耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶jb13gh39及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39及其制備方法，其氨基酸序列如SEQ No.1所示。木糖苷酶JB13GH39具有以下性質(zhì)：最適pH4.5；經(jīng)pH4.0–9.0的緩沖液處理1h，該酶酶活剩余達70％以上；最適溫度50℃，在0–70℃內(nèi)都具有酶活，在20℃時具有52.8％的酶活；該酶在37℃和60℃下該酶穩(wěn)定，在70℃下該酶快速失活；胰蛋白酶及大部分金屬離子對其活性無影響或影響微弱；可水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖，水解產(chǎn)物主要為木糖。本發(fā)明的木糖苷酶可應(yīng)用于飼料、食品和生物能源等行業(yè)。
【專利說明】
耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷 酶JB13GH39及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖是植物半纖維素的主要成份，是自然界中最為豐富的可再生資源之一，其 主鏈由吡喃木糖以β_1，4糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈上具有阿拉伯糖、葡糖醛酸、乙醚、香豆酸、 肉桂酸等（Collins et al.FEMS Microbiol Rev，2005,29:3_23·)。內(nèi)切木聚糖酶（endo-1， 4-i3-d-Xylanase，EC 3.2.1.8)隨機地切割木聚糖的主鏈骨架，生成低聚木糖;木糖苷酶⑶-d_xylosidase，EC 3.2.1.37)可降低低聚木糖對內(nèi)切木聚糖酶的抑制作用，降解低聚木糖 生成木糖；內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶之間存在協(xié)同作用，以內(nèi)切木聚糖酶為主、木糖苷酶為 輔對木聚糖主鏈進行完全降解(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3-23·)。木 糖苷酶在醫(yī)藥、食品、釀酒、能源及造紙等領(lǐng)域都具有應(yīng)用價值（Zhang et al.Process Biochem，2014，49:1422-1428.)。根據(jù)氨基酸序列同源性，木糖苷酶可歸類于糖苷水解酶第 1、3、5、30、39、43、51、52、54、116和120家族，其可來源于細菌、真菌及植物等〇^11^3"6七 al.，Nucleic Acids Res，2014,42:D490_D495.)。
[0003] 耐鹽酶在高濃度NaCl下仍然具有催化活性，可應(yīng)用于高鹽食品和海產(chǎn)品加工及其 它高鹽環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域（如醬油發(fā)酵），在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污 染、節(jié)省滅菌等所消耗的能源(Madern et al .Extremophiles,2000,4:91-98);耐乙醇的酶 在同步糖化發(fā)酵中可提高乙醇產(chǎn)量和生物質(zhì)利用率、縮短發(fā)酵時間（Sato et al.J Biosci Bioeng，2010，110 : 679-683);耐蛋白酶的酶可應(yīng)用于食品及飼料等多種行業(yè)（Zhou et al.J Ind Microbiol Biot,2012,39:965-975)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39及其制備 方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖 苷酶JB13GH39，其氨基酸序列如SEQ No. 1所示。
[0006] 本發(fā)明還提供一種編碼木糖苷酶JB13GH39的基因 jB13GH39,所述基因 jB13GH39的 核苷酸序列如SEQ No.2所示。
[0007] 本發(fā)明還提供一種包含木糖苷酶基因 jB13GH39的重組載體。
[0008]本發(fā)明還提供一種包含木糖苷酶基因 jB13GH39的重組菌株。
[0009]本發(fā)明所述耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39可得自鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas sp.)。木糖苷酶JB13GH39總共含538個氨基酸，理論分子量為60.3kDa，其中 N端19個氨基酸為預(yù)測信號肽序列"MAMGRSIMIRRMAMCVALA"，成熟的木糖苷酶JB13GH39含 519個氛基酸。該木糖昔酶貝136!139全序列與66111^111<:中3口]1；[1^01]1〇仙8 8口.？1?090111-131'- 6A來源的潛在木糖苷酶(WP_051103436)全序列具有最高的氨基酸序列一致性，為70.8%。 [0010] 木糖苷酶JB13GH39的最適pH值為4.5;經(jīng)pH4.0-9.0的緩沖液處理lh，該酶酶活剩 余達70%以上；該酶最適溫度為50°C，在0_70°C內(nèi)都具有酶活;該酶在37°C和60°C下穩(wěn)定， 在70°C下快速失活;在反應(yīng)體系中加入3.0-20.0% (w/v)的NaCl，該酶的活性不受影響；經(jīng) 3.0-30.0%(w/v)的NaCl在37°C下處理60min，該酶仍能保持80%以上的活性;在15.0%(v/ v)的乙醇中，該酶具有55.2 %的活性;經(jīng)3.0-20.0 % (v/v)的乙醇在37 °C下處理60min，該酶 仍能保持74%以上的活性;經(jīng)2.2-87.〇11^/1^的胰蛋白酶在37°(：下處理111，該酶的酶活基本 保持不變;該酶能水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖，水解產(chǎn)物主要為木糖。 [0011] 本發(fā)明提供了編碼上述木糖苷酶JB13GH39的基因 jB13GH39,該基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 本發(fā)明通過基因組測序的方法獲得木糖苷酶JB13GH39的編碼基因 jB13GH39,其全 長1617bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA。
[0013]本發(fā)明還提供了包含上述木糖苷酶基因 jBl 3GH39的重組載體，優(yōu)選為pEasy-E2-jB13GH39。將本發(fā)明的木糖苷酶基因插入到表達載體中，使其核苷酸序列與表達調(diào)控序列 相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，將本發(fā)明的木糖苷酶基因和表達載體 pEasy-E2通過T-A方式相連接，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pEasy-E2-jB13GH39。
[0014]本發(fā)明還提供了包含上述木糖苷酶基因 jB13GH39的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大 腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21 (DE3) / jBl 3GH39。
[0015]本發(fā)明制備木糖苷酶JBl 3GH39的方法按以下步驟進行：
[0016] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；
[0017] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木糖苷酶JB13GH39表達；
[0018] 3)回收并純化所表達的木糖苷酶JB13GH39。
[0019] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) / jB 13GH39。
[0020] 本發(fā)明提供了一個新的木糖苷酶基因，其編碼的木糖苷酶最適pH4.5;最適溫度50 °C ;良好的耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶特性。本發(fā)明的木糖苷酶可應(yīng)用于飼料、食品和生物能源 等行業(yè)。
【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0022]圖1:在大腸桿菌中表達的木糖苷酶JB13GH39的SDS-PAGE分析，其中，M:蛋白質(zhì) Marker; P:純化的重組木糖苷酶JBl 3GH39。
[0023]圖2:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的pH活性。
[0024]圖3:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的pH穩(wěn)定性。
[0025]圖4:純化的重組木糖苷酶JBl 3GH39的熱活性。
[0026]圖5:純化的重組木糖苷酶JBl 3GH39的熱穩(wěn)定性。
[0027] 圖6:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的NaCl抗性。
[0028] 圖7:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的NaCl穩(wěn)定性。
[0029]圖8:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的乙醇抗性。
[0030]圖9:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的乙醇穩(wěn)定性。
[0031]圖10:純化的重組木糖苷酶JB13GH39的胰蛋白酶抗性。
[0032]圖11:純化的重組木糖苷酶JB13GH39水解木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、 木五糖(X5)及木六糖(X6)的產(chǎn)物分析，其中，XI:木糖;CK:底物和失活的酶(煮沸l(wèi)Omin); S: 反應(yīng)組。
【具體實施方式】
[0033]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0034] 試驗材料和試劑
[0035] 1、菌株及載體:鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)分離于云南省紅河哈尼族彝族 自治州個舊市磷礦土土樣，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC 1.10968;大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)和表達載體pEasy_E2購于北京全式金生 物技術(shù)有限公司。
[0036] 2、試劑：DNA聚合酶和dNTP購自 TaKaRa&3;pNP(p-nitrophenol)、pNPX(p-nitrophenyl-0-d-xylopyranoside)Np-nitrophenyl-a-L-arabinofuranosideN 糖、山毛櫸木聚糖、羧甲基纖維素納和β-葡聚糖購自Sigma公司，阿拉伯木聚糖、木二糖、木 三糖、木四糖、木五糖及木六糖購自Megazyme公司，Genomic DNA Clean&Concentration試 劑盒購自Zymo Research公司，Tureseq DNA Sample Preparation Kit購自 Illumima公司， 其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0037] 3、培養(yǎng)基：
[0038] LB培養(yǎng)基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸饋水至 1000ml，pH自 然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0039] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0040] 實施例1:木糖苷酶基因 jB13GH39的克隆
[0041 ]提取鞘氨醇單胞菌基因組DNA:將培養(yǎng)2d的液體菌液離心取菌體，加入lmL溶菌酶， 37°C處理60min，再加入裂解液，裂解液組成為：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl 500mM，2%SDS (w/v)，pH8·0，70°C水浴裂解60min，每隔lOmin混勾一次，在4°C下lOOOOrpm離心5min。取上 清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下 lOOOOrpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置 于-20°C備用。
[0042]用超聲打斷儀Biorupter將5yg的鞘氨醇單胞菌基因組打斷為400-600bp的片段， 用Genomic DNA Clean&Concentration試劑盒對打斷的DNA片段進行純化，純化后用 Tureseq? DNA Sample Preparation Kit進行DNA片段的末端補平、3'端加六堿基和加接頭、 及DNA片段的PCR擴增(操作按試劑盒說明書進行）。用MiSeq基因組測序儀（Illumima公司） 對上述制備好的文庫進行基因組測序。
[0043] 基因組測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)讀碼框預(yù)測和本地BLAST比對，得到木糖苷酶基因 jB13GH39，該基因序列如SEQIDN0.2所示。
[0044] 實施例2:重組木糖苷酶JB13GH39的制備
[0045] 以5'GCAACTCTCTGCACGGCTCCGG 3'和5'CTTTCGCTCCTTGGGTGCAATTGAC 3'為引物 對，鞘氨醇單胞菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94 °C變性5min;然后94 。(:變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin 30sec，30個循環(huán)后72°C保溫lOmiruPCR結(jié)果 得到木糖苷酶基因 jB 13GH39，并在該基因3 '端引入突出的A堿基。將木糖苷酶基因 jBl 3GH39 和表達載體pEasy-E2通過T-A方式相連接，獲得含有jB13GH39的重組表達質(zhì)粒pEasy-E2-jB13GH39。將pEasy-E2-jB13GH39轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/jB13GH39〇
[0046] 取含有重組質(zhì)粒pEasy-E2-jB13GH39的重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/jB13GH39， 以〇. 1%的接種量接種于LB(含100yg ml^Amp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化 的菌液以1 %接種量接種到新鮮的LB(含100yg mdmp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3h (0D6QQ達到0.6-1.0)后，加入終濃度0.7mM的IPTG進行誘導，于20 °C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h或26 °C振蕩培養(yǎng)約8Κ12000Γρπι離心5min，收集菌體。用適量的pH7.0M CIlVaine緩沖液懸浮菌體 后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng)12，OOOrpm離心10min后，吸取 上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分別親和和洗脫目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果 (圖1)表明，重組木糖苷酶JBl 3GH39得到了純化，產(chǎn)物為單一條帶。
[0047]實施例3:純化的木糖苷酶JBl 3GH39的性質(zhì)測定 [0048] 1、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的活性分析：
[0049]實施例2純化的重組木糖苷酶JB13GH39的活性測定方法采用pNP法:將pNPX溶于緩 沖液中，使其終濃度為2mM;反應(yīng)體系含50yL適量酶液，450yL的2mM底物;底物在反應(yīng)溫度下 預(yù)熱5min后，加入酶液再反應(yīng)10min，然后加2mL 1M Na2C03終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在405nm 波長下測定釋放出的pNP; 1個酶活單位(U)定義為每分鐘分解底物產(chǎn)生Ιμπιο 1 pNP所需的酶 量。對底物p-n i tr opheny 1 -α-L-arab i nof urano s i de的測定也采用pNP法。對底物山毛櫸木 聚糖、羧甲基纖維素納、普魯蘭多糖和葡聚糖的活性測定方法采用3,5 -二硝基水楊酸 (DNS)法:將底物溶于緩沖液中，使其終濃度為0.5% ;反應(yīng)體系含100yL適量酶液，900yL底 物;底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng)10min，然后加2. OmL DNS終止反應(yīng)， 沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長下測定0D值;1個酶活單位(U)定義為在給定的條件 下每分鐘分解底物產(chǎn)生lymol還原糖（以木糖計)所需的酶量。
[0050] 2、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的pH活性和pH穩(wěn)定性測定：
[00511 酶的最適pH測定:將木糖苷酶JB13GH39在37°C下和pH3.0-8.0的緩沖液中進行酶 促反應(yīng)。酶的pH穩(wěn)定性測定：將純化的酶液置于pH3.0- 10.0的緩沖液中，在37 °C下處理 6 0 m i η，然后在p Η 4.5及3 7 °C下進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為： Mcllvainebuff er(pH3 · 0-8 · 0)和0 · 1M glycine-Na0H(pH9 · 0-10 · 0)。以pNPX為底物，反應(yīng) lOmin，測定純化的木糖苷酶JB13GH39的酶學性質(zhì)。結(jié)果表明：JB13GH39的最適pH為4.5 (圖 2);經(jīng)pH4.0-9.0的緩沖液處理lh，該酶酶活剩余達70%以上（圖3)。
[0052] 3、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的熱活性及熱穩(wěn)定性測定：
[0053]酶的熱活性測定:在pH4.5的緩沖液中，于0-70°C下進行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性 測定:將同樣酶量的酶液分別置于37°C、60°C和70°C中，處理0_60min后，在pH4.5及37°C下 進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以PNPX為底物，反應(yīng)lOmin，測定純化的JB13GH39 的酶學性質(zhì)。結(jié)果表明：JB13GH39的最適溫度為50 °C，在0_70°C內(nèi)都具有酶活，在20 °C時具 有52.8 %的酶活(圖4);該酶在37°C和60°C下穩(wěn)定，在70°C下快速失活(圖5)。
[0054] 4、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的動力學參數(shù)測定：
[0055] 酶的動力學參數(shù)一級反應(yīng)時間測定:在pH4.5及50°C下，以ImMpNPX為底物，依次在 酶促反應(yīng)的Ι-lOmin內(nèi)終止反應(yīng)并測定酶活性，計算出酶活性與反應(yīng)時間的比值，若在一定 時間內(nèi)該比值保持穩(wěn)定，則此時間為一級反應(yīng)時間。用〇. 05-2. OmM pNPX為底物，在pH4.5、 50°C和一級反應(yīng)時間下，根據(jù)Lineweaver-Burk方法測定Km、Vmax和kc； at。經(jīng)測定，在50°C及 pH4 · 5 條件下，JB13GH39 對 pNPX 的 Km、VmajPkcat 分別為 3 · 44mM、90 · 32ymol min-Vg-1 和 90.77s-1。
[0056] 5、不同金屬離子及化學試劑對純化的重組木糖苷酶JB13GH39活力的影響：
[0057] 在酶促反應(yīng)體系中加入一定終濃度的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影 響。在37°C及pH4.5條件下，以pNPX為底物測定酶活性。結(jié)果（表2)表明：SDS完全抑制 JB13GH39; AgN03、10 · OmM的NiS〇4、CuS〇4及HgCl2對JB13GH39的抑制較強；添加 10 · OmM的 CoCl2，JB13GH39受到部分抑制；而 10 · OmM的FeS〇4及1 · 0 % (v/v)的Triton X-100和Tween 80 對JB13GH39有明顯的促進作用，提高JB13GH39的酶活約為0.5倍;其余金屬離子及化學試劑 對該酶活性無影響或影響微弱。
[0058] 表2.金屬離子及化學試劑對純化的重組JB13GH39活力的影響
[0061 ] 7、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的NaCl抗性及NaCl穩(wěn)定性測定：
[0062] 酶的NaCl抗性測定：在酶促反應(yīng)體系中加入3 · 0-30 · 0 % (w/v)NaCl，于pH4 · 5及50 °C下進行酶促反應(yīng)。酶的NaCl穩(wěn)定性測定:將純化的酶液置于3.0- 30.0 % (w/v)的NaCl水溶 液中，在37°C下處理60min，然后在pH4.5及50°C下進行酶促反應(yīng)，以未加 NaCl但在37°C下保 溫60min的酶液作為對照。以pNPX為底物，反應(yīng)lOmin，測定純化的JB13GH39的酶學性質(zhì)。結(jié) 果表明：在反應(yīng)體系中加入3.0_20.0%(?八）的似(：1，貝136!139的活性不受影響，加入 25 ·0% (w/v)和30 ·0% (w/v)NaCl，JB13GH39仍然分別具有52 ·6%和30 ·0% 的活性（圖6);經(jīng) 3.0-30.0% (w/v)的NaCl在37°C下處理60min，該酶仍能保持80%以上的活性（圖7)。
[0063] 8、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的乙醇抗性及乙醇穩(wěn)定性測定：
[0064] 酶的乙醇抗性測定:在酶促反應(yīng)體系中加入3.0-30.0 % (v/v)乙醇，于pH4.5及50 °C下進行酶促反應(yīng)。酶的乙醇穩(wěn)定性測定:將純化的酶液置于3.0-30.0 % (v/v)的乙醇中， 在37°C下處理60min，然后在pH4.5及50°C下進行酶促反應(yīng)，以未加乙醇但在37°C下保溫 60min的酶液作為對照。以pNPX為底物，反應(yīng)lOmin，測定純化的JB13GH39的酶學性質(zhì)。結(jié)果 表明：隨著乙醇含量的增加，JB13GH39活性逐漸降低，在15.0 % (v/v)的乙醇中，該酶具有 55.2%的活性（圖8);經(jīng)3.0-20.0%(￥八)的乙醇在37°(：下處理601^11，該酶仍能保持74%以 上的活性（圖9)。
[0065] 9、純化的重組木糖苷酶JB13GH39的胰蛋白酶抗性測定：
[0066] 酶的胰蛋白酶抗性：用不同濃度的胰蛋白酶(pH7.5)在37°C下對重組酶處理lh，然 后在PH4.5及50°C下進行酶促反應(yīng)，以置于蛋白酶對應(yīng)pH緩沖液中但未加蛋白酶的酶液作 為對照。結(jié)果表明：經(jīng)2.2-87 . Omg/mL的胰蛋白酶在37 °C下處理lh，JB13GH39的酶活基本保 持不變(圖10)。
[0067] 10、純化的重組木糖苷酶JB13GH39對底物的降解：
[0068] 在口!14.5及50°(：下，該酶對口即乂的比活為37.78 ±0.861]11^ - 1，對底物？- nitrophenyl-a-L-arabinofuranoside、樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖、阿拉伯木聚糖、羧甲基 纖維素納、普魯蘭多糖和葡聚糖皆無活性。
[0069] 11、純化的重組木糖苷酶JB13GH39水解木寡糖的產(chǎn)物分析：
[0070]對木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖的產(chǎn)物分析方法采用薄層層析法 (TLC)，反應(yīng)體系含45yL 0.5% (w/v)的底物，5yL適當稀釋酶液（約0.04U酶液），在ρΗ4.5及 50°C下，反應(yīng)150min后終止反應(yīng)并分析水解產(chǎn)物(使用青島海洋化工有限公司的高效薄層 層析硅膠板G型）。
[0071 ]薄層層析步驟如下所示：
[0072] (1)配制展開劑（冰醋酸20mL，雙蒸水20mL，正丁醇40mL，混勻），取適量倒入展開 槽，靜置30min左右；
[0073] (2)將硅膠板放在110 °C烘箱中活化30min，冷卻后劃線，點樣(每次0.5yL，吹干，共 點3次）；
[0074] (3)將點樣的一端硅膠板朝下放入展開槽中，點樣點不要沒入展開劑；
[0075] (4)待展開劑到距硅膠板上沿1.5cm時，取出硅膠板，吹干，再展開一次；
[0076] (5)第二次展開結(jié)束后，硅膠板直接浸入適量顯色劑（lg二苯胺溶于50mL丙酮中， 溶解后加入lmL苯胺及5mL 85%的磷酸，混勾，現(xiàn)用現(xiàn)配）；
[0077] (6)幾秒鐘后，立即取出硅膠板并放置于90°C烘箱中10_15min，使斑點顯色。
[0078]結(jié)果表明：JB13GH39能水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖，水解產(chǎn)物主 要為木糖(圖11)。
[0079] 本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù) 語和科學術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該 理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意 義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
[0080] 最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參 照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解:依然可以對本 發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均 應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。
【主權(quán)項】
1. 一種耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JBl3GH39，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ No. 1所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的木糖苷酶JB13GH39的基因 jB13GH39，其特征在于，所述基 因 jB13GH39的核苷酸序列如SEQNo·2所示。3. -種包含權(quán)利要求2所述的木糖苷酶基因 jB13GH39的重組載體。4. 一種包含權(quán)利要求2所述的木糖苷酶基因 jB13GH39的重組菌株。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39在飼料工業(yè)中的應(yīng) 用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述木糖苷酶JB13GH39的制備方法，按以下步驟進行： 1) 用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木糖苷酶JB13GH39表達； 3) 回收并純化所表達的木糖苷酶JB13GH39。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39在食品加工中的應(yīng) 用。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述耐鹽耐乙醇耐胰蛋白酶的木糖苷酶JB13GH39在生物能源工業(yè)中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/42GK105950592SQ201610559679
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】周峻沛, 黃遵錫, 張蕊, 劉鈺, 唐湘華, 李俊俊, 吳倩, 慕躍林
【申請人】云南師范大學