一種提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過融合酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因，獲得了最適溫度降低,由70℃降解到60℃,而熱穩(wěn)定性提高的脲酶突變體。在70℃加熱30min,脲酶殘留活力由80％提高到96％。本發(fā)明首次提出，通過融合酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因UreA、UreB、UreC的方法來提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的策略，并且獲得了熱穩(wěn)定性提高的酸性脲酶，更有利于酸性脲酶的工業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】
一種提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脲酶(Urease，EC3.5.1.5 )，廣泛存在于動物、植物、細菌、真菌等中，其能專一性的 催化尿素水解產(chǎn)生兩分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功獲得的結(jié)晶態(tài)的酶，它 于1926年由Summer首次從刀豆中提取出。根據(jù)脲酶作用的最適pH值，可將脲酶分為酸性脲 酶、中性脲酶和堿性脲酶。
[0003] 脲酶主要應(yīng)用于發(fā)酵食品（尤其是酒精飲料如黃酒）中尿素的降解。氨基甲酸乙酯 (簡稱EC)，具有遺傳毒性及致癌性，廣泛存在于多種發(fā)酵食品（如醬油、食醋、泡菜)和酒精 飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒等）中。研究證實發(fā)酵食品（如黃酒、醬油等）中尿素是EC形成的 主要前體物質(zhì)，它和乙醇自發(fā)的反應(yīng)生成EC，從而嚴(yán)重影響人類的健康。酸性脲酶可以高效 消除發(fā)酵食品（如酒精類飲料)中的尿素，從而可以有效的減少了 EC的形成。
[0004] 目前來說，日本已經(jīng)實現(xiàn)了脲酶的商業(yè)化應(yīng)用，但脲酶的熱穩(wěn)定性使得其在商業(yè) 化應(yīng)用中依然具有一定的局限性。熱穩(wěn)定性高的脲酶更有益于脲酶的工業(yè)化應(yīng)用。因此，有 必要尋找能夠提高脲酶熱穩(wěn)定性的方法，獲得熱穩(wěn)定性更高的脲酶。
[0005] 本發(fā)明首次提出，通過融合酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA、UreB、UreC的方法來提高酸性 脲酶熱穩(wěn)定性的策略，并且獲得了熱穩(wěn)定性提高的酸性脲酶，更有利于酸性脲酶的工業(yè)化 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明解決第一個技術(shù)問題是提供一種提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法，所述方法 是將脲酶結(jié)構(gòu)基因融合，插入重組表達載體并進行表達。
[0007] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述方法是將脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA和UreB融合，插入 重組表達載體并進行表達。
[0008] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述方法是將脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA、UreB和UreC融合， 插入重組表達載體并進行表達。
[0009] 所述酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA序列如SEQ ID N0.1所示，結(jié)構(gòu)基因 UreB序列如SEQ ID N0.2所示，結(jié)構(gòu)基因 UreC序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述UreA與UreB融合后的基因片段UreAB序列如SEQ ID NO .4所示。
[0011] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述融合是先將UreA與UreB融合，獲得融合后的基 因片段UreAB，再將UreAB與UreC融合。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述UreAB與UreC融合后的基因片段UreABC序列如 SEQIDN0.5**。
[0013] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的方法包括如下步驟：（l)PCR擴增或合成UreA 基因片段和UreB基因片段；（2)以所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，通過融合PCR方法 獲得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；（3)將所獲得的UreAB片段與載體連接，構(gòu)建重組 表達載體;（5)將重組表達載體導(dǎo)入目的菌株進行表達。
[0014] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的方法包括如下步驟：（1)PCR擴增或合成脲酶 結(jié)構(gòu)基因 UreA基因片段、UreB基因片段和UreC基因片段；（2)以所獲得的UreA和Ure B基因 片段為模板，通過融合PCR方法獲得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；（3)以所獲得的 UreAB和UreC基因片段為模板，通過融合PCR方法獲得UreAB和UreC融合在一起的UreABC片 段；（4)將所獲得的UreABC片段與載體連接，構(gòu)建重組表達載體；（5)將重組表達載體導(dǎo)入目 的菌株進行表達。
[0015] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述載體為pNZ8148-ureLR。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因通過連接肽進行融合。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽由甘氨酸和絲氨酸組成。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GGGSGGGS。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GGGGGGGS。
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GSGSGSGG。
[0021 ]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GGGSGG。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GSGSGS。
[0023] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GSGSGG。
[0024] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GGGGGSGS。
[0025] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GGGSGSGS。
[0026] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽由甘氨酸組成。
[0027] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述連接肽序列為GGGGGG。
[0028] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接肽還包括(EAAAK)n連接肽和PT連接肽;所 述(EAAAK)n連接肽由谷氨酸和丙氨酸組成;所述PT連接肽由脯氨酸和蘇氨酸組成。
[0029] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體步驟如下：
[0030] 1)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank登錄號： AAPZ0Z000001 · 1，GI: 194454092-19445409,設(shè)計引物。以pNZ8148ureLR(pNZ8148ureLR的構(gòu) 建方法參見申請?zhí)枮?01310524588.6的專利申請，該質(zhì)粒含有完整脲酶基因簇UreLR，由脲 酶基因簇ABCEF⑶組成)為模板，通過PCR的方法，獲得Ur eA基因片段和Ur eB基因片段。
[0031] 2)以步驟1所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，通過融合PCR的方法獲得UreA 和UreB融合在一起的UreAB片段。
[0032] 3)步驟2所獲得的UreAB片段經(jīng)Ncol及PstI雙酶切，膠回收后與經(jīng)Ncol及PstI雙酶 切并且膠回收的載體pNZ8148-ureLR于16°C過夜連接，構(gòu)建重組表達載體pNZ8148-ureLR (AB-CEFGD)。
[0033] 4)步驟3)所獲得的重組表達載體pNZ8148-ureLR(AB-CEF⑶），電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌 L. lactis NZ9000,培養(yǎng)重組菌表達得到脲酶活力高的突變體。
[0034]在本發(fā)明的一個實施方式中，所述方法還可以是：（1)PCR擴增或合成UreA基因片 段和UreB基因片段；（2)以所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，通過融合PCR方法獲得 UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；（3)將所獲得的UreAB片段與UreC基因片段通過融合 PCR的方法獲得UreA和UreC融合在一起的UreAB片段；（4)將融合后的UreABC片段與載體連 接，構(gòu)建重組表達載體；（5)將重組表達載體導(dǎo)入目的菌株進行表達。
[0035] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接肽序列為SGGSSS。
[0036] 在本發(fā)明的一個實施方式中，所述提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法，具體步驟如下：
[0037] (1)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ0Z000001.1， GI: 194454092-19445409，設(shè)計引物。以pNZ8148-ureLR(申請?zhí)枮?01310524588 · 6，【公開日】 為2014年2月12日的專利中構(gòu)建，含有完整脲酶基因簇UreLR，由結(jié)構(gòu)基因 UreABCEF⑶組成） 為模板，通過PCR的方法，獲得UreA基因片段和UreB基因片段。
[0038] (2)以步驟1所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，通過融合PCR的方法獲得UreA 和UreB融合在一起的UreAB片段，其序列如SEQ ID NO.4所示。
[0039] (3)步驟2所獲得的UreAB片段經(jīng)Ncol及PstI雙酶切，膠回收后與經(jīng)Ncol及PstI雙 酶切并且膠回收的載體pNZ8148-ureLR于16 °C過夜連接，構(gòu)建重組表達載體pNZ8148-ureLR (AB-CEFGD)，該載體含有AB基因融合后的完整脲酶基因簇AB-CEFGD。
[0040] (3)以pNZ8148-ur eLR (AB-CEFGD)為模板，通過PCR的方法，獲得Ur eAB基因片段和 UreC基因片段。
[0041 ] (4)以步驟3所獲得的UreAB及UreC基因片段為模板，通過融合PCR方法獲得ABC融 合在一起的UreABC片段，序列如SEQ ID N0.5所示。
[0042] (5)步驟4所獲得的UreABC片段經(jīng)Ncol及PstI雙酶切，膠回收后與經(jīng)Ncol及PstI雙 酶切并且膠回收的載體pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)于16°C過夜連接，構(gòu)建重組表達載體 pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)。
[0043] (6)步驟5所獲得的重組表達載體pNZ8148-ureLR(ABC-EF⑶），電轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌 L.lactisNZ9000,培養(yǎng)重組菌表達得到脲酶活力高的突變體。
[0044] 本發(fā)明的第二個目的是提供根據(jù)所述方法獲得的脲酶突變體。
[0045] 有益效果：本發(fā)明通過采用不同長度的連接肽，融合酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA、 UreB、UreC，從而獲得了熱穩(wěn)定性提高的脲酶突變體UreAB和UreABC，融合UreA和UreB基因 的突變體UreAB能夠在70°C保溫30min后酶活力保持在90 %以上，融合UreAB和UreC基因的 突變體UreABC能夠在70°C保溫30min后酶活力保持在96%以上，為脲酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定 了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0046] 圖1從左往右分別為UreAB融合表達脲酶、UreABC融合表達脲酶及UreA、UreB、UreC 未融合的脲酶WT純化過程SDS-PAGE電泳圖;Μ，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1，粗酶液;2，硫酸氨沉淀； 3，DEAE離子交換層析;4，凝膠過濾層析。
[0047] 圖2為UreAB融合表達脲酶、UreABC融合表達酶、UreAB融合表達酶和未融合UreA、 UreB、UreC基因的脲酶WT的最適溫度及溫度穩(wěn)定性;A，最適溫度曲線，B，溫度穩(wěn)定性曲線。
【具體實施方式】 [0048]材料與方法：
[0049] 培養(yǎng)基：
[0050] GM17肉湯培養(yǎng)基(g · I/1):植物蛋白胨5,酵母抽提物5,聚蛋白胨5,抗壞血酸0.5， 牛肉膏2.5，MgS〇4 · 7Η20 0.01，β-甘油磷酸二鈉19,葡萄糖5。
[0051 ] 6/1-361178(8.1/1):6117肉湯培養(yǎng)基，蔗糖171.15，甘氨酸25。
[0052] 恢復(fù)培養(yǎng)基(g · L-iGMH肉湯培養(yǎng)基，MgCl2 · 6H20 4.06，CaCl20.22。
[0053] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g · L-蛋白胨15,酵母抽提物10,葡萄糖50，MgS〇4 · 7H20 0.246， MnS04· H20 0.0169〇
[0054] 分子生物學(xué)操作方法：
[0055]質(zhì)粒提取，參考SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)使用說明書。
[0056] DNA 片段回收，參考 Gene JET Gel Extraction Kit 和Gene JET PCR Purification Kit (Thermo)使用說明書。
[0057] 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化方法，參考Competent Cell Preparation Kit (大連寶生物)使用說明書。
[0058] 乳酸菌感受態(tài)細胞制備及電轉(zhuǎn)化，參考MoBiTec GmbH公司NICElxpression System for Lactococcus lactis操作手冊。
[0059] 脲酶酶活力測定方法：
[0060] 1)氯化銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用超純水配制0 . Immol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、 0.4mm〇VL、0.5mmol/L的NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確移取lmL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液分別置于順 序編號的10mL比色管中。37°C下恒溫保溫30min，立即用吸lmL終止劑于比色管中，振蕩混 勻。再依次加入lmL顯色劑I和顯色劑II，強烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容 至10mL，在625nm下比色測定0D值，以0D值為縱坐標(biāo)，NH 4+梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0061 ] 2)脲酶酶活測定方法:取兩支1 OmL比色管，分別加入lmL酶液和lmL滅活的酶液。然 后在兩管中分別加入lmL 3%尿素(用20mM pH 4.5的檸檬酸緩沖液配制），在37°C恒溫水浴 箱中反應(yīng)30min后，在兩管各加入lmL終止劑（10%三氯乙酸），混勻后加入lmL的顯色劑I (15g苯酚和0.625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL)和lmL顯色劑II(13.125g NaOH 和7.5mLNaC10用超純水定容至250mL)，強烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后取 出，用超純水稀釋至ljl〇mL，625nm處比色，測定0D值，計算酶活(采用氯化銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）。 [0062] 3)脲酶酶活單位定義：在常壓，20mM pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及37 °C條件 下，每分鐘降解尿素生成2μπι〇1 NH4+所需要的酶量為一個酶活力單位。
[0063] 實施例l:UreAB融合文庫構(gòu)建
[0064] (1)根據(jù)NCBI公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列GenBank:AAPZ0Z000001.1， GI: 194454092-19445409，設(shè)計引物。以pNZ8148-ureLR(專利CN201310524588 · 6中構(gòu)建，含 有完整脲酶基因簇UreLR，由結(jié)構(gòu)基因 ABCEFGD組成)為模板，以正向引物A-F及反向引物八-R6，A-R8，A-R10為引物，通過PCR的方法，獲得UreA基因片段；以正向引物B-F及反向引物B-R10為引物，獲得Ur eB基因片段。擴增體系及擴增條件均按照PrimerSTARHS DNAPolymerase (TAKARA)試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物采用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進行切膠 回收，回收〇.3kb(UreA基因）和l.lkMUreB基因）的片段，回收方法參照膠回收試劑盒 (TAKARA)說明書進行。
[0065] (2)以步驟1)所獲得的UreA，UreB基因片段為模板，以A-F，B-R為引物通過融合PCR 方法獲得融合在一起的UreAB片段。擴增體系及擴增條件均按照Primer STAR HS DNAP〇lymeraSe(TAKARA)試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行切膠 回收，回收1.4kb的片段，回收方法參照膠回收試劑盒(TAKARA)說明書進行。
[0066] 表1序列表
[0067]
[0068] 實施例2:UreAB融合文庫構(gòu)建
[0069] (1)重組表達質(zhì)粒 pNZ8148-ureLR (AB-CEFGD)構(gòu)建
[0070] 實施例1所獲得的UreAB片段經(jīng)Ncol及PstI雙酶切，膠回收后與經(jīng)Ncol及PstI雙酶 切并且膠回收的載體pNZ8148-ureLR于16°C過夜連接，構(gòu)建重組表達載體pNZ8148-ureLR (AB-CEFGD)。
[0071] (2)重組乳酸菌 L.lactisNZ9000(pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD))構(gòu)建
[0072] 上述步驟1)所獲得的重組表達載體pNZ8148-ureLR(AB-CEF⑶），電轉(zhuǎn)化乳酸乳球 菌L. lactis NZ9000，30°C培養(yǎng)1天后對長出的菌落進行菌落PCR鑒定，菌落PCR呈陽性的菌 株即為重組乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD))。由此便得到了UreAB融 合后的脲酶突變體文庫。
[0073]實施例3:UreAB融合文庫的篩選及鑒定
[0074] l)UreAB融合文庫初篩:挑取UreAB融合文庫中的菌接種到裝有l(wèi)mL GM17培養(yǎng)基的 1.5mL離心管中，過夜培養(yǎng)16h后按照2%的接種量轉(zhuǎn)接到新的1.5mL離心管中，當(dāng)0D6Q() = 0.4 左右加入10ng/mL Nisin和lmmol/LNiCh，繼續(xù)培養(yǎng)8h后10000r/min離心2min后收集菌體， 用檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)洗滌菌體兩次，然后測定其酶活大小，如圖1所示。
[0075] 2)UreAB融合文庫搖瓶復(fù)篩及測序鑒定
[0076]以步驟1)中初篩的脲酶活性較高的菌株進行搖瓶復(fù)篩。接種初篩菌株單菌落于含 氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h之后按2%的接種量進行轉(zhuǎn)接，50mL的裝液量為20mL，當(dāng) 0〇6〇〇 = 0.4左右加入1〇11〖/1111^附8；[11和11]11]1〇1/1^;^12，繼續(xù)培養(yǎng)811后收集菌體并測定酶活，相 應(yīng)的測序結(jié)果和酶活大小如表2所示。結(jié)果顯示，編號為10的菌株的酶活較其他融合子菌株 是最高的，其氨基酸序列為GGGGGGGS。將編號為10的菌株命名為L. lactisNZ9000 (pNZ8ure-UreAB)〇
[0077]表 2 重組乳酸菌 L.lactisNZ9000(pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD))脲酶酶活力大小及 其對應(yīng)連接肽的氨基酸序列
[0079]實施例3:UreABC融合子的構(gòu)建
[0080] 步驟1 ):根據(jù)N C B I公布的羅伊氏乳桿菌酸性脲酶基因序列G e η B a n k : AAPZ0Z000001.1，GI: 194454092-19445409,設(shè)計引物，引物序列如表 1所示。以pNZ8148-ureLR(申請?zhí)枮?01310524588.6,【公開日】為2014年2月12日的專利中構(gòu)建，含有完整脲酶基 因簇UreLR，由結(jié)構(gòu)基因 UreABCEF⑶組成)為模板，以正向引物A-F及反向引物A-R6，A-R8，A-R10為引物，通過PCR的方法，獲得UreA基因片段；以正向引物B-F及反向引物B-R10為引物， 獲得UreB基因片段。
[0081 ] 步驟2):以步驟1)所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，以A-F，B-R為引物通過 融合PCR方法獲得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段，序列如SEQIDN0.4所示。
[0082] 步驟3):將步驟2)所獲得的AB片段經(jīng)Ncol及PstI雙酶切，膠回收后與經(jīng)Ncol及 PstI雙酶切并且膠回收的載體pNZ8148-ureLR于16°C過夜連接，構(gòu)建重組表達載體 pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)，該載體含有AB基因融合后的完整脲酶基因簇AB-CEFGD。
[0083] 步驟4):以步驟3)構(gòu)建的重組表達載體pNZ8148-ureLR(AB-CEF⑶)為模板，以正向 引物AB-F及反向引物AB-R6，AB-R8，AB-R10為引物，通過PCR的方法，獲得UreAB基因片段；以 正向引物C-F及反向引物C-R為引物，獲得UreC基因片段。擴增體系及擴增條件均按照 PrimerSTARHS DNAPolymerase(TAKARA)試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物采用1 ·5%瓊脂糖凝膠 電泳進行切膠回收，回收方法參照膠回收試劑盒(TAKARA)說明書進行。
[0084]步驟5):以步驟4)所獲得的AB及C基因片段為模板，以AB-F，C-R為引物通過融合 PCR方法獲得UreAB、UreC融合在一起的UreABC片段，其序列如SEQIDN0.5所示。擴增體系 及擴增條件均按照PrimerSTARHS DNAPolymerase(TAKARA)試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物采 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行切膠回收，回收1.4kb的片段，回收方法參照膠回收試劑盒 (TAKARA)說明書進行。
[0085] 實施例4:UreABC融合文庫構(gòu)建
[0086] 步驟1)重組表達質(zhì)粒pNZ8148ureLR(ABC-EFGD)構(gòu)建
[0087] 實施例1所獲得的UreABC片段經(jīng)Ncol及PstI雙酶切，膠回收后與經(jīng)Ncol及PstI雙 酶切并且膠回收的載體pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)于16°C過夜連接，構(gòu)建重組表達載體 pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)。
[0088]步驟2)重組乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD))構(gòu)建
[0089] 上述步驟1)所獲得的重組表達載體pNZ8148-ureLR(ABC-EF⑶），電轉(zhuǎn)化乳酸乳球 菌L. lactis NZ9000，30°C培養(yǎng)1天后對長出的菌落進行菌落PCR鑒定，菌落PCR呈陽性的菌 株即為重組乳酸菌L.lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD))。由此便得到了UreABC融 合后的脲酶突變體文庫。
[0090] 實施例5:UreABC融合文庫的篩選及鑒定
[0091]步驟1 )UreABC融合文庫初步篩選：挑取UreABC融合文庫中的菌接種到裝有l(wèi)mL GM17培養(yǎng)基的1.5mL離心管中，過夜培養(yǎng)16h后按照2 %的接種量轉(zhuǎn)接到新的1.5mL離心管 中，當(dāng)OD6〇q = 0 · 4左右加入 10ng/mL Nisin和lmmol/L NiCl2,繼續(xù)培養(yǎng)8h后 10000r/min離心 2min后收集菌體，用檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)洗滌菌體兩次，然后測定其酶活。共挑選了88 株菌，僅挑選到一株有脲酶活力的突變株。
[0092]步驟2)UreABC融合文庫搖瓶復(fù)篩及測序鑒定
[0093] 以步驟1)中初篩的具有脲酶活力的菌株進行搖瓶復(fù)篩。接種初篩菌株單菌落于含 氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h之后按2%的接種量進行轉(zhuǎn)接，50mL的裝液量為20mL，當(dāng) 0〇6〇〇 = 0.4左右加入1〇11〖凡附8；[11和11]11]1〇1/1^;^12，繼續(xù)培養(yǎng)811后收集菌體并測定酶活，相 應(yīng)的測序結(jié)果和酶活大小如表3所示。結(jié)果顯示，此菌株其氨基酸序列為SGGSSS，并將其命 名為L. lactisNZ9000(pNZ8ure-UreABC)。
[0094] 表3對照菌和重組乳酸菌L. lactis NZ9000(pNZ8148-ureLR(ABC-EF⑶））脲酶酶活 及其對應(yīng)連接肽氨基酸序列
[0096] 實施例6:UreAB、UreABC融合酶和未融合結(jié)構(gòu)基因的重組酶的純化 [0097] (1)粗酶液的制備
[0098]分別挑取L. lactisNZ9000(pNZ8ureLR)、L.lactis NZ9000(pNZ8ure-UreAB)和 L. lactis NZ9000(pNZ8ure-UreABC)單菌落接種于含氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，30°C靜置培 養(yǎng)16h之后按2%的接種量進行轉(zhuǎn)接，50mL的裝液量為20mL，當(dāng)0D600 = 0.4左右加入10ng · mL-Sisin和lmmol · L-SiCh，繼續(xù)培養(yǎng)8h后10000r/min離心5min，棄上清，沖洗菌體并重懸 于50mM pH4.5的檸檬酸緩沖液中，菌體終濃度為0. lg/ml。將菌體置于冰水浴中進行超聲破 碎，超聲破碎的條件為：功率70W，工作2s間隔4s，重復(fù)工作30min，至菌體溶液變清澈為止。 將破碎液于4°C12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于干凈的離心管中低溫保存。
[0099] (2)乙醇分級沉淀
[0100]在冰浴條件下進行乙醇沉淀，利用蠕動栗勻速向上清液中加入預(yù)冷的無水乙醇并 使用磁力攪拌器對其進行攪拌，當(dāng)乙醇濃度達到20% (v/v)時，在水浴中放置30min后 lOOOOr · mirT1離心10min，收集上清和沉淀。繼續(xù)向上清中加入無水乙醇至終濃度為40% (v/v)，離心后收集上清和沉淀。以此得到終濃度為20%、40%、60%和80%的沉淀，并分別 測定各乙醇濃度下的酸性脲酶活性。脲酶主要集中在20 %的乙醇沉淀中。將20 %乙醇沉淀 上下來的蛋白溶解于適量20mmol/LpH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，用透析袋在相同的緩沖溶 液中對蛋白樣品透析。
[0101] (3)離子交換層析
[0102] 起始緩沖液A:20mmol/LpH 7·0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液B:含lmol/LNaCl的 20mmol/LpH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。采用HiTrap DEAE HL 5mL陰離子交換柱，先用起始緩 沖液平衡柱子，流速為5mL · mirT1，上樣后用洗脫緩沖液梯度洗脫蛋白，采用梯度20%， 40%，60%，80%，100%B液。經(jīng)酶活力測定，脲酶主要在40%B條件下被洗脫下來。
[0103] (4)凝膠過濾層析
[0104] Superdex_200prep grade凝膠柱，進樣量為0 · 5mL，柱體積120mL，緩沖液為 20mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，流速0.35mL · mirT1。收集出峰處，測定不同出峰處酶 活。
[0105] 純化過程SDS-PAGE如圖1所示。
[0106] 實施例7 :UreAB和UreABC融合酶的最適溫度以及溫度穩(wěn)定性
[0107] 測定最適反應(yīng)溫度時，在20_60°C范圍內(nèi)每隔10°C測定酶對尿素的酶活，緩沖液為 檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)。測定結(jié)果如圖2A所示，未融合結(jié)構(gòu)基因的脲酶WT對尿素的最適 溫度為70°C，而UreAB和UreABC融合酶對尿素的最適溫度為60°C，最適溫度的降低，使得該 酶在工業(yè)化應(yīng)用時可以在更低的溫度下達到更高的降解效果，從而降解工業(yè)化應(yīng)用的成 本。
[0108] 測定溫度穩(wěn)定性時，在20 °C -90 °C溫度范圍內(nèi)每隔10 °C使酸性脲酶在相應(yīng)的溫度 下保溫30min后，冰浴lOmin后按材料與方法中的酶活測定方法，測定脲酶酶活力。測定結(jié)果 如圖2B所示，脲酶WT在70 °C保溫30min后，其酶活力保持在80 %左右，UreAB融合的脲酶，在 相同條件下(70°C保溫30min)，其酶活力保持在90%以上，而UreABC融合的酸性脲酶在相同 條件下（70°C保溫30min)，其酶活力保持在96%以上。UreABC融合的脲酶熱穩(wěn)定性高于WT及 UreAB融合的酸性脲酶。溫度穩(wěn)定性的提高，更有利于酶的工業(yè)化應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1. 一種提高酸性脲酶熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于，將酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA、UreB融 合，插入重組表達載體并進行表達;所述酸性脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreA序列如SEQ ID NO. 1所示， 結(jié)構(gòu)基因 UreB序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：（I)PCR擴增或合成脲酶結(jié) 構(gòu)基因 UreA基因片段和UreB基因片段；（2)以所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，通過 融合PCR方法獲得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；（3)將所獲得的UreAB片段與載體連 接，構(gòu)建重組表達載體;（4)將重組表達載體導(dǎo)入目的菌株進行表達。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將脲酶結(jié)構(gòu)基因 UreAWreB融合的基因片 段UreAB與結(jié)構(gòu)基因 UreC融合，插入重組表達載體并進行表達;所述UreC基因序列如SEQ ID NO. 3所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步驟=(I)PCR擴增或合成脲酶結(jié) 構(gòu)基因 UreA基因片段、UreB基因片段和UreC基因片段；（2)以所獲得的UreA和Ure B基因片 段為模板，通過融合PCR方法獲得UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；（3)以所獲得的 UreAB和UreC基因片段為模板，通過融合PCR方法獲得UreAB和UreC融合在一起的UreABC片 段；（4)將所獲得的UreABC片段與載體連接，構(gòu)建重組表達載體；（5)將重組表達載體導(dǎo)入目 的菌株進行表達。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：（1)根據(jù)GenBank登錄號為 AAPZ0Z000001.1的序列設(shè)計引物，以pNZ8148-ureLR為模板，通過PCR的方法，獲得UreA基因 片段和UreB基因片段；（2)以所獲得的UreA和Ure B基因片段為模板，通過融合PCR方法獲得 UreA和UreB融合在一起的UreAB片段；（3)將所獲得的UreAB片段與載體pNZ8148-ureLR分別 進行雙酶切，連接，構(gòu)建重組表達載體pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD);(4)以重組表達載體 pNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)為模板，通過PCR的方法，獲得UreC基因片段，（5)以UreAB及UreC 基因片段為模板，通過融合PCR方法獲得UreABC片段；（6)將UreABC片段和載體PNZ8148-ureLR(AB-CEFGD)進行酶切，連接，構(gòu)建重組表達載體pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD); (7)將重 組表達載體pNZ8148-ureLR(ABC-EFGD)，導(dǎo)入目的菌株進行表達。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述載體為pNZ8148-ureLR。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述酸性脲酶的結(jié)構(gòu)基因通過連接 肽進行融合。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述連接肽序列由半胱氨酸和絲氨酸兩種 氨基酸組成。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述連接肽還包括(EAAAK)n連接肽或PT連 接肽;所述(EAAAK)n連接肽由谷氨酸和丙氨酸組成;所述PT連接肽由脯氨酸和蘇氨酸組成。10. 應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述方法獲得的脲酶突變體。
【文檔編號】C12N15/74GK105950597SQ201610512679
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】康振, 陳堅, 堵國成, 劉慶濤, 周建立
【申請人】江南大學(xué)