一種耐受有毒產(chǎn)物的細胞固定化方法及其固定化細胞生產(chǎn)1,5-戊二胺工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體涉及一種耐受有毒產(chǎn)物的細胞固定化方法及該固定化細胞轉化生產(chǎn)1,5?戊二胺的連續(xù)化生產(chǎn)工藝。本申請對聚乙烯醇與海藻酸鈉配比及相應的成膠方法進行了研發(fā)優(yōu)化，制備的固定化細胞具有可耐受高濃度1,5?戊二胺對菌體細胞的損傷、有較好的膨脹性能、可耐受轉化過程中大量二氧化碳氣體的釋放對結構的影響、機械強度高、使用壽命長等優(yōu)點；并且分批使用6次以后活力保持在98%以上，連續(xù)使用12h后活力保持在70%以上。本發(fā)明所提供的連續(xù)化生產(chǎn)工藝所需設備少，便于操作，生產(chǎn)規(guī)模放大容易，自動化程度高。生產(chǎn)過程不添加任何中和劑；產(chǎn)品澄清，分離純化容易。
【專利說明】
一種耐受有毒產(chǎn)物的細胞固定化方法及其固定化細胞生產(chǎn)1, 5-戊二胺工藝
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別涉及耐受有毒產(chǎn)物的細胞固定化方法及其固定 化細胞生產(chǎn)1，5-戊二胺工藝。
【背景技術】
[0002] 1，5_戊二胺（簡稱戊二胺），即尸胺，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮 堿，為蛋白質(zhì)腐敗時賴氨酸在脫羧酶作用下發(fā)生脫羧反應時生成的產(chǎn)物。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，1， 5_戊二胺可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)植物衰老過程，刺激植物生長，促進果實發(fā)育;此 外，1，5_戊二胺還可以提高植物的耐冷性;在醫(yī)藥上，1，5_戊二胺是臨床上用于治療鐵中毒 藥物去鐵胺B的前體;而1，5-戊二胺目前最有價值的應用是作為尼龍單體與丁二酸、己二 酸、癸二酸等聚合合成PA5.4、PA5.6、PA5.10等生物尼龍。
[0003] 近年來，由于生物尼龍的深入開發(fā)及應用，1，5-戊二胺的需求量不斷增加。目前1， 5_戊二胺的獲取方法主要有提取法、化學法、發(fā)酵法及全細胞催化法。提取法來源有限，過 程復雜，無法工業(yè)化生產(chǎn);化學法以腈類為原料，產(chǎn)量高，適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，但其反應過 程劇烈，污染較大，不符合綠色發(fā)展的要求;發(fā)酵法原料來源廣泛且可再生，成本低，污染也 較小，但其調(diào)控過程比較復雜，產(chǎn)量也較低。全細胞催化法是指利用完整的生物細胞作為催 化劑進行化學轉化，其本質(zhì)是利用細胞內(nèi)的酶進行催化，是介于發(fā)酵法和提取酶催化法之 間的一種生物催化技術。相比發(fā)酵法，全細胞催化克服了發(fā)酵法生產(chǎn)周期長、代謝產(chǎn)物復 雜、底物轉化率低、產(chǎn)物分離提取困難及能耗高等缺點。相比純酶催化反應，全細胞中各酶 系維持原有狀態(tài)和特定位置，酶穩(wěn)定性更好，半衰期更長，適應性更強，更易實現(xiàn)能量和輔 酶的原位再生;細胞內(nèi)完整的多酶體系可以實現(xiàn)酶的級聯(lián)反應，催化效率高。
[0004] 但由于高濃度的產(chǎn)物1，5-戊二胺對菌體細胞有明顯的損傷，造成菌體隨轉化的進 行而逐漸破碎。一方面，破碎的菌體細胞1，5_戊二胺生產(chǎn)效率顯著下降，嚴重制約了 1，5_戊 二胺的產(chǎn)量；另一方面，菌體細胞無法重復使用，因而需重復培養(yǎng)以獲取大量的菌體細胞， 從而造成生產(chǎn)成本的增加。此外，每批次的菌體活力也會有差異，導致每批次產(chǎn)出的1，5_戊 二胺含量差異，從而影響后續(xù)分離純化操作。因而，開發(fā)一種可長時間維持菌體活力的方法 具有重要的意義。
[0005] 固定化細胞技術是一種常用的保護細胞的方法，在保持細胞活力具有一定的作 用。此外，固定化的細胞可以反復使用，降低了生產(chǎn)成本。在細胞固定化方法中，包埋法因其 操作簡便、易于放大和通用性等原因應用最廣。適用于包埋法的載體種類較多，如海藻酸 鈉、聚乙烯醇、卡拉膠、瓊脂糖等，其中應用最為廣泛的是聚乙烯醇和海藻酸鈉，由于單獨使 用聚乙烯醇制備的凝膠球容易粘連，因而通常將二者按一定比例混合使用。但二者的配比 和相應的成膠方法對固定化細胞的活性和固定化小球的機械強度影響較大，特別是在類似 L-賴氨酸轉化生成1，5_戊二胺的脫羧反應過程中，大量的二氧化碳釋放對固定化小球的機 械強度影響更為顯著，現(xiàn)有方法無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于克服1，5-戊二胺生產(chǎn)過程中由于高濃度產(chǎn)物1，5-戊二胺的細胞 毒性造成的菌體裂解和生產(chǎn)能力下降。
[0007] 本發(fā)明首先提供了一種細胞的固定化方法，該方法不僅可以有效的保護細胞以耐 受高濃度的有毒產(chǎn)物，還可以耐受轉化過程中釋放氣體對固定化球體機械強度的影響。
[0008] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0009] 本發(fā)明提供一種耐受有毒產(chǎn)物的細胞固定化方法，包括如下步驟：
[0010] (1)冷水加入聚乙烯醇后加熱至98 °C溶化后，加入海藻酸鈉，滅菌鍋加熱溶化，攪 拌冷卻至40-50°C，加入含有細胞保護劑的菌懸液，充分攪拌均勻；
[0011] (2)用注射器或蠕動栗將步驟(1)所述混合液滴加到交聯(lián)劑溶液中，形成直徑0.3- 0.5cm的小球，室溫靜置6-12h后，-45~-80 °C冷凍8-16h;冷凍結束后，室溫緩慢融化，用生 理鹽水洗滌2次，冰箱保存，用于轉化。
[0012] 優(yōu)選的，所述的細胞保護劑為甘油，甜菜堿，二甲基亞砜(DMS0)，聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)，甘露醇中的任一種;優(yōu)選PVP或甜菜堿。
[0013] 優(yōu)選的，按質(zhì)量比計，海藻酸鈉:聚乙烯醇：菌體細胞(濕重）：細胞保護劑為0.5~ 6.5:2 ~10:1 ~5:1 ~10
[0014] 優(yōu)選的，所述的菌體為3%(按質(zhì)量百分比）。
[0015] 優(yōu)選的，所述的交聯(lián)劑為(按質(zhì)量百分比）0.5~6.5%的氯化鈣溶液。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種由上述權利要求1-4任一方法獲得的固定化細胞。
[0017] 本發(fā)明也提供了一種所述的固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)1，5_戊二胺的工藝，其特征在 于，包括如下步驟：
[0018] (1)將所述的固定化細胞裝入柱式反應器中，填充細胞的徑高比為1:5~1:10。
[0019] ⑵以4~10g(L-纏it)/g(麵踵)/h的流速將L_$負氨酸溶液栗入至I」步驟（1)的固定化細 胞柱反應器中。其中，柱反應器可以多組串聯(lián)或并聯(lián)組合使用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0021 ] (1)本發(fā)明所提供的固定化方法具有材料成本低，操作簡單，重現(xiàn)性好等特點。
[0022] (2)制備的固定化細胞具有如下顯著優(yōu)點：①可耐受高濃度1，5_戊二胺對菌體細 胞的損傷。②有較好的膨脹性能，可耐受轉化過程中大量二氧化碳氣體的釋放對結構的影 響。③機械強度高，可耐受發(fā)酵罐在500rpm下連續(xù)攪拌12h不破碎，可耐壓0.2~0.4MPa。④ 使用壽命長。分批使用6次以后活力保持在98%以上，連續(xù)使用12h后活力保持在70%以上。
[0023] (3)本發(fā)明所提供的連續(xù)化生產(chǎn)工藝所需設備少，便于操作，生產(chǎn)規(guī)模放大容易， 自動化程度高。生產(chǎn)過程不添加任何中和劑;產(chǎn)品澄清，分離純化容易。
[0024] 因此本發(fā)明也可以廣泛應用于反應過程中因毒性產(chǎn)物而產(chǎn)生破壞菌體活力的生 物轉化生產(chǎn)，也可應用于其他反應過程中有氣體產(chǎn)生的固定化細胞的制備。
【附圖說明】
[0025]圖1為聚乙烯醇(PVA)成膠方法對菌體活力的影響。
[0026]圖2為菌體量與固定化菌體活力的關系。
[0027] 圖3為響應面法(C⑶設計)試驗結果驗證。
[0028] 圖4為細胞保護劑添加試驗。
[0029]圖5為固定化細胞重復使用試驗。
[0030] 圖6為固定化細胞柱反應器連續(xù)生產(chǎn)1，5_戊二胺。
【具體實施方式】
[0031] 以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按 照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟 練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0032] 實施例1
[0033] 使用不同濃度的PVA與2%海藻酸鈉的混合物作為固定材料，分別使用硼酸交聯(lián)法 和冷凍法制備固定化細胞。具體操作方法為:冷水加入聚乙烯醇后加熱至98°C溶化后，加入 海藻酸鈉，滅菌鍋加熱溶化，攪拌冷卻至40-50°C，加入菌懸液至終濃度為10g?sn)/L，充分 攪拌均勻。用注射器或蠕動栗將上述混合液滴加到交聯(lián)劑溶液中得到直徑〇. 3~0.5cm的小 球。硼酸交聯(lián)法交聯(lián)劑使用含3% (質(zhì)量百分比）氯化鈣的飽和硼酸溶液;冷凍法交聯(lián)劑為 3% (質(zhì)量百分比）的氯化鈣溶液。對于硼酸交聯(lián)法制得的小球，室溫靜置8h后，用生理鹽水 洗滌2次，冰箱保存，用于轉化。對于冷凍法制得的小球，先室溫靜置8h后，-80°C冷凍8h。冷 凍結束后，室溫緩慢融化，用生理鹽水洗滌2次，冰箱保存，用于轉化。
[0034] 使用上述固定化細胞以L-賴氨酸鹽酸鹽為底物進行轉化試驗。轉化體系包括:菌 體細胞〇. lg(濕菌重），L-賴氨酸量150g/l。轉化條件為37°C，200rpm，轉化1小時后檢測1，5_ 戊二胺含量。對照組使用相同質(zhì)量的游離細胞代替固定化細胞，其余條件相同。固定化細胞 的相對活力以固定化細胞的1，5-戊二胺產(chǎn)量比游離細胞的1，5-戊二胺產(chǎn)量計算得到。 [0035]結果如圖1所示。分別采用-80°C冷凍法制備的固定化細胞相對活力較硼酸法有顯 著的提高，其中，2%海藻酸鈉-2%PVA固定的細胞相對活力達到91%。說明硼酸是影響菌體 活力的主要原因。此外，固定化細胞相對活力與PVA含量呈負相關趨勢。
[0036] 此外，試驗對比了冷凍法成膠和常溫成膠（即僅使用3%CaCl2溶液成膠，室溫靜置 8h)的差異，如圖1所示，常溫成膠相對活力均保持在60%左右，不同PVA含量間無顯著差異， 但較冷凍法下降了 10%-30%。
[0037]將固定化細胞裝入7.5L發(fā)酵罐在500rpm下攪拌12h后，結果表明，三種固定化方法 所制備的固定化小球均保留完整。
[0038] 實施例2
[0039] 采用實施例1中冷凍法制備固定化細胞，其中海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2.0%，聚乙烯醇 質(zhì)量分數(shù)2.0 %，菌體量與凝膠溶液的質(zhì)量體積比（g/1 OOmL) 1~5，測定固定化小球的相對 活力，轉化條件中除菌體量外，其余條件同實施例1。結果如圖2所示，轉化液中1，5_戊二胺 的濃度隨載菌量的增加而增大，但單位質(zhì)量菌體1，5_戊二胺產(chǎn)率在載菌量大于3%后沒有 顯著提升，并且當3%的載菌量時，固定化細胞的單位質(zhì)量菌體1，5-戊二胺產(chǎn)率4.41 ± 0.09g/g(?廳)/h，與對照(4.89±0.468/^(?廳)/11)相比無顯著差異，說明3%的載菌量即可 飽和固定化小球。
[0040] 實施例3
[0041] 采用實施例1中冷凍法制備固定化細胞，通過響應面法分析法中的中心組合設計 (CCD)試驗對固定化載體海藻酸鈉（SA)、聚乙烯醇(PVA)的質(zhì)量分數(shù)，成型劑氯化鈣溶液 (CaC12)的質(zhì)量分數(shù)，|丐化時間和冷凍時間等因素進行優(yōu)化。各因素水平如表1所示，共32組 試驗，轉化反應條件同實施例1。試驗結果如表2所示。試驗結果經(jīng)建模分析得到回歸方程：
[0042] LoglO(響度活力）=+ 1 · 38_1 · 81*SA+2 · 2lE-〇〇3*PVA-〇 · 26*CaCl2+0 · 〇39*鈣化時 間-0 · 028* 冷凍時間+0 · 074*SA*PVA+0 · 32*SA*CaCh+0 · 053*SA* 冷凍時間+0 · 27*SA2-0 · 014* PVA2-0 · 036*CaCl22_l · 64E-003*鈣化時間2-1 · 94E-003*冷凍時間2-0 · 01*SA2*PVA-0 · 046* SA2*CaCl2_7 · 73E-003*SA2* 冷凍時間
[0043] 模型達極顯著水平卬=14.44，？〈0.0001)，模型相關系數(shù)1?2 = 0.939^(1」1?2 = 0.874,說明模型可用于真實值的模擬。根據(jù)模型預測最佳的固定化條件為：海藻酸鈉 3.62%，聚乙烯醇4.71 %，氯化鈣溶液4.21 %，鈣化11.84小時，-80冷凍15.96小時。依據(jù)模 擬預測條件進行細胞固定化后進行轉化試驗，轉化反應條件同實施例1。結果如圖3所示，細 胞經(jīng)固定化后相對活力保持在97%以上。


[0049] 實施例4
[0050] 采用實施例1中冷凍法制備固定化細胞，其中海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)2.0%，聚乙烯醇 質(zhì)量分數(shù)2.0 %，菌體量3 % (濕菌重）。分別添加終濃度為10 %甘油，10 %甜菜堿，7 %DMS0， 5%PVP，1 %甘露醇等細胞保護劑。不添加保護劑組為對照組。轉化體系包括:菌體細胞0. lg (濕菌重），L-賴氨酸量50g/l。轉化條件為37°C，200rpm，轉化2小時，其間補加5M鹽酸維持pH 穩(wěn)定。轉化過程中定期檢測轉化液中L-賴氨酸含量，當賴氨酸消耗至10g/l時，補加底物至 50g/l 〇
[0051] 結果如圖4(a)所示，添加了細胞保護劑的固定化細胞在連續(xù)轉化2h后菌體活力均 保持在90%以上，其中甜菜堿（10%)和PVP(5%)的效果最顯著;此外，如圖4(b)所示，1,5-戊二胺的濃度隨轉化的進行顯著提升，其中使用添加甜菜堿和PVP的固定化細胞均轉化得 至ljl，5-戊二胺101±2g/L，顯著高于對照組77±2g/L。
[0052] 實施例5
[0053]采用實施例1中冷凍法制備固定化細胞，其中海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%，聚乙烯醇質(zhì) 量分數(shù)5%，5%PVP，菌體量3% (濕菌重）。轉化體系包括:菌體細胞0. lg(濕菌重），L-賴氨酸 量50g/l。轉化條件為37°C，200rpm，其間補加5M鹽酸維持pH穩(wěn)定。轉化過程中定期檢測轉化 液中L-賴氨酸含量，當賴氨酸消耗至10g/l時，補加底物至50g/l。轉化2小時后分離固定化 細胞，添加新鮮50g/l L-賴氨酸溶液進行轉化，重復使用固定化細胞轉化6次。試驗結果如 圖5所示，固定化細胞在分批轉化6次后，單位菌體1，5_戊二胺產(chǎn)率在批次間沒有顯著的差 異(？ = 0.471，€( = 0.05)，相對活力保持在98%以上。
[0054] 實施例6
[0055] 采用實施例1中冷凍法制備固定化細胞，其中海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)4%，聚乙烯醇質(zhì) 量分數(shù)5 %，5 %PVP，菌體量3 % (濕菌重）。將上述固定化細胞裝入柱式反應器中，填充細胞 的徑高比為1:6。以4g(L-賴氨酸)/g(細胞濕重)/h的流速將300g/L L-賴氨酸溶液栗入到固 定化細胞柱反應器中，當溶液填滿柱反應器后，將流速逐漸增至l〇g(L-賴氨酸)/g(細胞濕 重)/h。每隔lh取樣檢測1，5_戊二胺含量。結果如圖6所示，菌體比轉化速率在前四個小時內(nèi) 逐漸上升，這是由于固定化小球隨轉化的進行逐步膨脹，從而傳質(zhì)效率逐步提高，轉化4h后 達到最大值，此時單位菌體的轉化速率達到6.19±0.01g 1,5-戊二胺/g(?廳|)/h，而后菌體 活力有下降的趨勢，但12h后仍保持最高活力的70%以上，轉化液中1，5_戊二胺的含量可維 持在100g/L以上。試驗結果表明，利用本發(fā)明提供的方法制備的固定化細胞具有長時間連 續(xù)轉化生產(chǎn)1，5-戊二胺的能力，且由于該工藝易于放大，通過增加固定化細胞量和原料液 L-賴氨酸的濃度即可獲得更高濃度的1，5-戊二胺轉化液以及更高的L-賴氨酸的轉化率。
[0056]本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發(fā)明各 個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的 內(nèi)容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所 述改進也落入所附權利要求書的范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種耐受有毒產(chǎn)物的細胞固定化方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 冷水加入聚乙烯醇后加熱至98°C溶化后，加入海藻酸鈉，滅菌鍋加熱溶化，攪拌冷 卻至40-50°C，加入含有細胞保護劑的菌懸液，充分攪拌均勻； (2) 用注射器或蠕動栗將步驟（1)所述混合液滴加到交聯(lián)劑溶液中，形成直徑0.3-0.5 cm的小球，室溫靜置6-12 h后，-45~-80°C冷凍8-16 h;冷凍結束后，室溫緩慢融化，用生 理鹽水洗滌2次，冰箱保存，用于轉化。2. 根據(jù)權利要求1所述的細胞固定化方法，其特征在于，所述的細胞保護劑為甘油，甜 菜堿，二甲基亞砜(DMSO)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，甘露醇中的任一種;優(yōu)選PVP或甜菜堿。3. 根據(jù)權利要求1所述的細胞固定化方法，其特征在于，海藻酸鈉:聚乙烯醇:菌體細胞 (濕重）:細胞保護劑為0.5~6.5:2~10:1~5:1~10。4. 根據(jù)權利要求1所述的細胞固定化方法，其特征在于，所述的菌體為3%(按質(zhì)量百分 比）。5. 根據(jù)權利要求1所述的細胞固定化方法，其特征在于，所述的交聯(lián)劑為（按質(zhì)量百分 比）0.5~6.5%的氯化鈣溶液。6. 上述權利要求1-5任一方法獲得的固定化細胞。7. -種權利要求6所述的固定化細胞連續(xù)生產(chǎn)1，5-戊二胺的工藝，其特征在于，包括如 下步驟： (1) 將所述的固定化細胞裝入柱式反應器中，填充細胞的徑高比為1:5~1:10。 (2) 以4~10 ga-編酸)/g(細?鍾)/h的流速將L-賴氨酸溶液栗入到步驟（1)的固定化細胞柱 反應器中。
【文檔編號】C12N11/10GK105950601SQ201610368936
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】陳可泉, 馬偉超, 沈金山, 曹遜, 何育美, 歐陽平凱
【申請人】南京工業(yè)大學