一種酶的固定化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種酶的固定化方法，尤其涉及一種用于啤酒生產(chǎn)的酶的固定化方法。該方法中將α?乙酰乳酸脫羧酶的緩沖溶液中加入到氯化鈣溶液中反應(yīng)得到形成帶有初步固定化酶的納米花結(jié)構(gòu)，然后將得到的納米花分散到的海藻酸鈉溶液，之后將得到的分散液以一定的滴加速度逐滴加入到氯化鈣溶液中攪拌固化得到微球最終產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的固定化酶方法制備的微球能夠使固定化酶活保持在游離酶活的98％以上，同時(shí)也使固定酶具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性利用性，為其在工業(yè)上的應(yīng)用提供了廣泛前景。
【專利說明】
一種酶的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地涉及一種酶的固定化方法，尤其涉及一種用于 啤酒生產(chǎn)的酶的固定化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶制劑作為生物工程研究的碩果之一，在啤酒行業(yè)得到了普及和提高。近幾年啤 酒企業(yè)為了提高質(zhì)量，降低成本，增加效益，越來越多地使用酶制劑。通過使用酶制劑，可以 彌補(bǔ)麥芽中酶活力的不足，加大輔料用量，改善麥汁成分，提高啤酒發(fā)酵度，縮短發(fā)酵周期， 增加產(chǎn)量等。在生產(chǎn)過程中補(bǔ)充外加酶，始終貫穿于啤酒生產(chǎn)的全過程之中，它可使操作簡(jiǎn) 便，效益提高。如耐高溫淀粉酶應(yīng)用在糊化時(shí)，可達(dá)到無麥芽糊化，使輔料比例增加，酒質(zhì) 清淡爽口；采用液體高效糖化酶協(xié)同麥芽糖化，可以彌補(bǔ)麥芽質(zhì)量差、酶活力不足，提高麥 汁中可發(fā)酵性糖的含量;發(fā)酵液中添加脯氨酸內(nèi)切酶，可以增強(qiáng)啤酒的非生物穩(wěn)定性;向發(fā) 酵液中添加乙酰乳酸脫羧酶，可以方便快捷的降低雙乙酰含量等。
[0003] 酶制劑一般是以液態(tài)形式加入到糖化或發(fā)酵罐等罐體中，這種外源酶一旦加入就 難以分離并再利用，由于酶制劑價(jià)格一般比較高，單次利用對(duì)成本不利。另外，添加到發(fā)酵 罐內(nèi)的酶制劑不會(huì)經(jīng)過蒸煮過程變性析出，一般在成品酒經(jīng)巴氏滅菌后仍存在一定的酶活 力，以后在啤酒存放過程中，受到殘余酶的作用，啤酒口味會(huì)變甜、寡淡。不僅如此，酶的添 加量也應(yīng)受到嚴(yán)格控制，例如糖化酶對(duì)羧肽酶有一定的破壞作用，故若用量不當(dāng)，會(huì)影響啤 酒的泡沫穩(wěn)定性，并使成品酒呈一定的澀味。最后，酶制劑一般不可能將生產(chǎn)菌帶入酶中， 但是生產(chǎn)過程不可能是無菌操作，會(huì)帶來一定量的微生物，增加染菌的風(fēng)險(xiǎn)。總之，使用酶 制劑的單位成本及其產(chǎn)生的效果都應(yīng)仔細(xì)核算，投入和產(chǎn)出應(yīng)做到平衡或得益更多一些。 酶制劑的這些限制因素導(dǎo)致了其應(yīng)用受到一定影響。
[0004] 將酶或酵母細(xì)胞固定化是改善上述酶制劑問題，提高發(fā)酵效率的有效手段之一。 固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，克服了游離酶的上述不足之 處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡(jiǎn)便等一系列 優(yōu)點(diǎn)，因此酶或細(xì)胞的固定化受到研究者日益重視。
[0005] 但固定化酶也存在明顯的問題。限制固定化酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要原因有：
[0006] (1)酶固定化的成本較高。固定化成本包括酶、載體以及所用化學(xué)試劑的費(fèi)用、制 備工藝費(fèi)用及固定化效率等。以載體為例，目前國內(nèi)研究固定化所用的載體材料幾乎都集 中在海藻酸鹽、卡拉膠或一些大孔樹脂等有機(jī)材料上，雖然固定化效果較好，載體材料耐腐 蝕性差，有壓力存在時(shí)經(jīng)一段時(shí)間后易變形，并且無法再生。。另外，連續(xù)操作需要的設(shè)備比 較復(fù)雜，這些因素大大增加細(xì)胞固定化的成本，限制了此技術(shù)在國內(nèi)的工業(yè)化應(yīng)用。
[0007] (2)固定化對(duì)活性影響較大。酶的三維構(gòu)象對(duì)微環(huán)境非常敏感，一些固定化方法如 吸附法，對(duì)酶分子的三維構(gòu)象、柔順性等無明顯不良影響，因而可獲得較高的固定化酶活 性。但由于酶三維構(gòu)象的變換自由度與游離酶相似，酶的穩(wěn)定性難盡人意。其它的一些固定 化方法如共價(jià)法，由于酶的三維構(gòu)象及其柔順性受到限制，而且所用的固定化載體有可能 會(huì)觸及到酶的活性敏感區(qū)，常伴隨酶活性的大量喪失。如何獲得具有理想三維構(gòu)象柔順性 的固定化酶體系一直是生物催化劑多相反應(yīng)體系難以解決的科學(xué)問題之一。
[0008] 盡管如此，隨著生物、信息和納米技術(shù)的發(fā)展，以及對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，人們 還再根據(jù)傳統(tǒng)酶固定化技術(shù)存在的問題，不斷探索改進(jìn)、完善和發(fā)展新的酶固定化方法。因 此，具有工業(yè)化應(yīng)用前景的載體，高效穩(wěn)定的固定化技術(shù)，高活性長壽命的固定化酶或細(xì)胞 以及其在啤酒釀造行業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用性，是目前該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種酶的固定化方法，該方法操作 簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可以大大提高固定化酶的穩(wěn)定性和重復(fù)性，從而降低啤酒產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)成 本。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的酶的固定化方法，所述方法包括如下步驟：
[0011] (1)在含有待固定化的α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)的緩沖溶液中加入到氯化鈣溶液 Α中，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，離心分離，洗滌，得到形成帶有初步固定化酶的納米花結(jié) 構(gòu)，其中相對(duì)于每毫克載體Ca3(P〇4)2,固定化酶的含量約為0.12~3.13mg。
[0012] ⑵將上述步驟⑴中得到的納米花分散到的海藻酸鈉溶液中，攪拌。
[0013] (3)將上述步驟（2)中得到的分散液以一定的滴加速度逐滴加入到氯化鈣溶液B 中，攪拌固化后得到直徑約為1至2μπι的微球，離心分離，將微球用蒸餾水洗滌三次，得到包 覆了海藻酸鈣(ALG)的酶和磷酸鈣的微球最終產(chǎn)品。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述ALDC緩沖溶液為PBS緩沖溶液（磷酸鹽緩沖溶液），其中 ALDC濃度為0.05-2mg/ml，優(yōu)選為 1.2mg/ml，PBS的濃度為4mmol/L。
[0015] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述氯化|丐溶液A的濃度為0 · 1 -0 · 5mo 1 /L，優(yōu)選為0 · 1 -0 · 3mo 1 / L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2mol/L。
[0016]優(yōu)選地，步驟（1)中所述ALDC緩沖溶液與所述氯化鈣溶液A的體積比為1:1至200: 1，優(yōu)選為30:1至80:1，進(jìn)一步優(yōu)選為50:1。
[0017] 優(yōu)選地，步驟（1)中，反應(yīng)溫度為0至60°C，優(yōu)選為0至40°C，進(jìn)一步優(yōu)選為25°C，反 應(yīng)時(shí)間為1至24小時(shí)，優(yōu)選為4至18小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為12小時(shí)。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述海藻酸鈉的濃度為0.01至0.06g/ml，優(yōu)選為0.02至 0.04g/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為0.03g/ml;所述納米花中含有的ALDC與所述海藻酸鈉重量比為17: 100 至 17:500，優(yōu)選為 17:150 至 17:400，進(jìn)一步優(yōu)選為 17:300。
[0019]優(yōu)選地，步驟⑵中，所述攪拌時(shí)間為0.5至2小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)。
[0020] 優(yōu)選地，步驟(3)中，所述滴加速度為1至10ml/min，優(yōu)選為1至5ml/min，進(jìn)一步優(yōu) 選為 3ml/min〇
[0021] 優(yōu)選地，步驟（3)中，所述氯化鈣溶液B的濃度為0.5至2.5mol/L，優(yōu)選為1.0至 2.5mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為 2. Omol/L。
[0022] 優(yōu)選地，步驟(3)中，所述攪拌固化時(shí)間為5分鐘至60分鐘，優(yōu)選為5分鐘至30分鐘， 進(jìn)一步優(yōu)選為15分鐘。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種包覆了海藻酸鈣的酶和磷酸鈣的微球，所述 微球根據(jù)本發(fā)明的酶固定化方法制備。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種根據(jù)本發(fā)明的酶固定化方法制備的包覆了海 藻酸鈣的酶和磷酸鈣的微球在啤酒生產(chǎn)中的用途。
[0025]有益效果
[0026]根據(jù)本發(fā)明的固定化酶方法與其他的酶固定方法相比，能夠充分保留酶的活性甚 至提高酶的活性。但是由于納米結(jié)構(gòu)一些共有的缺點(diǎn)，如機(jī)械強(qiáng)度弱，粒徑小，對(duì)外界環(huán)境 敏感等，限制了納米花固定酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，使其不能在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用。而 本發(fā)明的發(fā)明人將此納米花固定化酶用海藻酸鈉包覆之后制備成2mm左右的微球，使得固 定化酶活能保持在游離酶活的98%以上。同時(shí)也使固定酶具有了穩(wěn)定性和可重復(fù)性利用 性。為其在工業(yè)上的應(yīng)用提供了廣泛前景。
【附圖說明】
[0027]圖1為實(shí)施例1中制備的Ca3 (P〇4) 2 - ALDC納米花結(jié)構(gòu)的SEM掃描圖。
[0028]圖2為實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球的照片。
[0029]圖3為樣品的酶活性測(cè)試結(jié)果的柱狀圖，其中圖3a為游離ALDC的酶活性；圖3b為根 據(jù)實(shí)施例1的步驟(1)中制備的ALDC-Ca3(P〇4)2納米花的酶活性;圖3c為根據(jù)實(shí)施例1的步驟 (3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca 3(P〇4)2納米花微球的酶活性；以及圖3d為根據(jù)對(duì)比實(shí)施 例1中制備的海藻酸鈣包覆的ALDC微球酶活性。
[0030] 圖4為pH值對(duì)樣品酶活性的影響曲線，其中圖4a為pH值對(duì)游離ALDC的酶活性的影 響曲線；圖4b為pH值對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC-Ca 3(P〇4)2納米花的酶活性的 影響曲線；圖4c為pH值對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca 3(P〇4)2納 米花微球的酶活性的影響曲線；以及圖4d為pH值對(duì)根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包 覆的ALDC微球酶活性的影響曲線。
[0031] 圖5為溫度對(duì)樣品酶活性的影響曲線，其中圖5a為溫度對(duì)游離ALDC的酶活性的影 響曲線；圖5b為溫度對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC-Ca 3 (P〇4) 2納米花的酶活性的 影響曲線；圖5c為溫度對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca3(P〇4) 2納 米花微球的酶活性的影響曲線；以及圖5d為溫度對(duì)根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包 覆的ALDC微球酶活性的影響曲線。
[0032] 圖6為表示重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，其中圖6a為根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1) 中制備的ALDC-Ca3(P〇4)2納米花的重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6b為根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備 的海藻酸鈣包覆的ALDC微球酶活性重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6c為根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3) 中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca 3(P〇4)2納米花微球的酶活性的重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]在根據(jù)本發(fā)明的酶的固定化方法的步驟（1)中所述ALDC緩沖溶液為PBS緩沖溶液 (磷酸鹽緩沖溶液），其中ALDC濃度為0.05-2mg/ml，當(dāng)控制ALDC濃度在此范圍內(nèi)時(shí)，形成的 納米花形貌良好，即，表面積較大，而不會(huì)形成表面光滑的圓球等形貌;而當(dāng)ALDC濃度不在 此范圍內(nèi)時(shí)，即小于0.05mg/ml或者大于2mg/ml時(shí)，形成的納米顆粒表面的裙皺突起較小， 即表面可能較為光滑，這使得比表面積較小，不利于酶的固定化。ALDC的濃度優(yōu)選為1.2mg/ ml，在此濃度下形成的納米花形貌最佳，即納米顆粒的表面積最大化且，顆粒粒徑適當(dāng)，團(tuán) 聚現(xiàn)象小。
[0034] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述氯化|丐溶液A的濃度為0 · 1-0 · 5mol/L，優(yōu)選為0 · 1-0 · 3mol/ L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2mol/L。
[0035] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述ALDC緩沖溶液與所述氯化鈣溶液A的體積比為1:1至200: 1，優(yōu)選為30:1至80:1，進(jìn)一步優(yōu)選為50:1。當(dāng)所述ALDC緩沖溶液與所述氯化鈣溶液A的體積 比小于1:1時(shí)，則由于溶液中鈣離子含量過大，有可能導(dǎo)致酶不能穩(wěn)定地固定在納米花表面 上，這可能是由于納米花表面存在大量鈣陽離子而導(dǎo)致削弱了酶與納米花表面的相互靜電 作用引起；當(dāng)所述ALDC緩沖溶液與所述氯化鈣溶液A的體積比大于200:1時(shí)，則由于溶液中 鈣離子含量過小，也有可能導(dǎo)致酶不能穩(wěn)定地固定在納米花表面上，這可能是由于鈣離子 含量過少使得酶與納米花表面的相互作用太小。
[0036] 優(yōu)選地，步驟（1)中，反應(yīng)溫度為0至60°C，優(yōu)選為0至40°C，進(jìn)一步優(yōu)選為25°C，反 應(yīng)時(shí)間為1至24小時(shí)，優(yōu)選為4至18小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為12小時(shí)。
[0037] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述海藻酸鈉的濃度為0.01至0.06g/ml，優(yōu)選為0.02至 0.04g/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為0.03g/ml;所述納米花中含有的ALDC與所述海藻酸鈉重量比為17: 100至17: 500,優(yōu)選為17:150至17:400,進(jìn)一步優(yōu)選為17:300。當(dāng)所述納米花中含有的ALDC 與所述海藻酸鈉重量比在17:100至17:500的范圍內(nèi)時(shí)，可以確保海藻酸鈉具有良好的溶解 狀態(tài)，同時(shí)保證溶液具有適當(dāng)?shù)恼吵矶?，而?dāng)所述納米花中含有的ALDC與所述海藻酸鈉重 量比低于17:100或高于17 :500時(shí)，可能由于所述海藻酸鈉的含量過低或過高，而導(dǎo)致溶液 粘稠度不適當(dāng)或海藻酸鈉不能很好地溶解。
[0038]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述攪拌時(shí)間為0.5至2小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)。
[0039] 優(yōu)選地，步驟(3)中，所述滴加速度為1至10ml/min，優(yōu)選為1至5ml/min，進(jìn)一步優(yōu) 選為3ml/min，當(dāng)?shù)渭铀俣瓤刂圃?至10ml/min范圍內(nèi)時(shí)，可以確保形成的顆粒的球形完整， 而當(dāng)?shù)渭铀俣炔辉诖朔秶鷥?nèi)時(shí)，形成的顆粒粒度不夠均勻，且形貌不規(guī)整。
[0040] 優(yōu)選地，步驟（3)中，所述氯化鈣溶液B的濃度為0.5至2.5mol/L，優(yōu)選為1.0至 2.5mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為2. Omol/L。當(dāng)所述氯化鈣溶液B的濃度控制在0.5至2.5mol/L范圍 內(nèi)時(shí)，可以確保海藻酸鈉小球瞬間凝固，而不致變形或嚴(yán)重團(tuán)聚。
[0041] 以下，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。在進(jìn)行描述之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，在本說明書和所附 的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語不應(yīng)解釋為限制于一般含義和字典含義，而應(yīng)當(dāng)在允許發(fā)明人 適當(dāng)定義術(shù)語以進(jìn)行最佳解釋的原則的基礎(chǔ)上，根據(jù)與本發(fā)明的技術(shù)方面相應(yīng)的含義和概 念進(jìn)行解釋。因此，這里提出的描述僅僅是出于舉例說明目的的優(yōu)選實(shí)例，并非意圖限制本 發(fā)明的范圍，從而應(yīng)當(dāng)理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以由其獲得其 他等價(jià)方式或改進(jìn)方式。
[0042] 以下實(shí)施例僅是作為本發(fā)明的實(shí)施方案的例子列舉，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限 制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和構(gòu)思的范圍內(nèi)的修改均落入本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] (1)將451111濃度為1.211^/1111的厶〇)(：的？85(4_〇1/14!1 = 7.4)緩沖液中加入0.91111 濃度為〇.2mol/L的CaCl2溶液中，于25°C反應(yīng)12小時(shí)，12000rpm離心10min，并且用蒸餾水離 心洗滌三次，得到Ca3(P〇4)2_ALDC納米花。
[0045] (2)用紫外-可見分光光度計(jì)法計(jì)算步驟(1)得到的上清液以及洗滌液中的酶含量 可以獲得Ca3(P〇4)2_ALDC納米花上的酶負(fù)載量為1.911^/^3(?〇4)2(111^)。取負(fù)載了1711^ ALDC酶的納米花分散在0.03mo 1/L的10ml的海藻酸鈉溶液中，攪拌1小時(shí)獲得均一的分散 液。
[0046] (3)將步驟（2)中得到的分散液用注射器以3ml/min的速度滴入100ml的濃度為 2. Omol/L的CaCl2溶液中，攪拌固化15min后，離心分離，用蒸餾水洗滌三次，獲得海藻酸鈣 包覆的Ca 3(P〇4)2_ALDC納米花微球，直徑約為2mm，具體參見圖2。
[0047]圖1為步驟（1)中得到的Ca3 (P〇4) 2-ALDC納米花結(jié)構(gòu)的SEM掃描圖，從圖中可以看 出，納米花具有完整的花型結(jié)構(gòu)以及多孔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)增加了其比表面積以及ALDC的活 性。
[0048]圖2為步驟(3)中得到的海藻酸鈣包覆的Ca3 (P〇4) 2- ALDC納米花微球的照片，從圖 中可以看出，得到的海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球粒徑分布均勻，直徑約為 2mm 〇
[0049] 實(shí)施例2
[0050] 除了將步驟（1)中ALDC的roS(4mmol/L，pH=7 · 4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為Omg/ ml以外，即不含ALDC，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P04) 2納米花微球。 [0051 ] 實(shí)施例3
[0052]除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 0.05mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0053] 實(shí)施例4
[0054] 除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 0.1mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0055] 實(shí)施例5
[0056] 除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 0.2mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0057] 實(shí)施例6
[0058]除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 0.6mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0059] 實(shí)施例7
[0060] 除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 0.8mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0061 ] 實(shí)施例8
[0062] 除了將步驟（1)中ALDC的roS(4mmol/L，pH=7 · 4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為lmg/ ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。
[0063] 實(shí)施例9
[0064] 除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 1.4mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0065] 實(shí)施例10
[0066] 除了將步驟（1)中ALDC的PBS(4mmol/L，pH = 7.4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為 1.8mg/ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。 [0067] 實(shí)施例11
[0068] 除了將步驟（1)中ALDC的roS(4mmol/L，pH=7 · 4)緩沖液中ALDC的濃度設(shè)置為2mg/ ml以外，按照實(shí)施例1相同的方法制備海藻酸鈣包覆的Ca3(P〇4)2_ALDC納米花微球。
[0069] 表1初始ALDC濃度對(duì)負(fù)載量/Ca3 (P〇4) 2 (mg)的影響
[0070]
[0071 ]其中所述"初始酶量"為反應(yīng)開始前，ALDC的PBS緩沖溶液中含有的酶的總量= ALDC初始濃度X PBS緩沖溶液的體積;所述"總負(fù)載量"為反應(yīng)結(jié)束后被固載的酶量=初始 酶量-上清液中的酶量;所述"ALDC負(fù)載量/Ca3 (P〇4) 2 (mg)"為每暈克磷酸|丐負(fù)載的酶量。
[0072]初始酶濃度對(duì)負(fù)載量的影響見表1，從表中可以看出，隨著初始酶濃度的增加，納 米花中每毫克磷酸|丐所結(jié)合的酶量逐步增加，從〇.1211^/^3(?〇4)2(111^)逐漸升至3.1411^/ Ca 3(P04)2(lmg)。但當(dāng)ALDC初始濃度繼續(xù)增加，超過2.0mg/ml后，ALDC負(fù)載量增加不多，因?yàn)?ALDC負(fù)載量已趨于飽和。
[0073]對(duì)比實(shí)施例1
[0074] (1)取 10ml濃度為 1 · 7mg/ml 的ALDC的PBS (4mmo 1/L，pH = 7 · 4)緩沖液分散在 0.03mol/L濃度為10ml的海藻酸鈉溶液中，攪拌1小時(shí)獲得均一的分散液。
[0075] (2)將步驟（1)中得到的分散液用注射器以3ml/min的速度滴入2.0M，100ml的 CaCl2溶液中，攪拌固化15min后，用蒸餾水洗滌三次，獲得海藻酸鈣包覆ALDC微球。
[0076]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1:酶活性測(cè)試
[0077]將游離ALDC、實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC-Ca3(P04) 2納米花、實(shí)施例1的步驟 (3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca3 (P〇4) 2納米花微球以及對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣 包覆的ALDC微球?yàn)闃悠罚瑱z測(cè)其ALDC的活性。
[0078] ALDC酶活性的檢測(cè)以α-乙酰乳酸為底物，在pH 6.0，溫度30°C的條件下，將每分鐘 ALDC反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成Ιμπιο?乙偶姻所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。
[0079] 酶活性測(cè)定步驟：
[0080] (1)乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品配置成不同濃度的溶液，各種濃度取 400yL，加入4.6ml顯色劑，30 °C顯色40min后于波長522nm處讀取吸光值，用吸光值對(duì)乙偶姻 濃度作圖，制得乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0081] (2)游離ALDC酶活性的測(cè)定。將原酶液稀釋一定的倍數(shù)，取20yL稀釋酶液于試管 中，加入MES緩沖溶(pH值6 ·0)300yL，30°C水浴預(yù)熱lOmin后，在反應(yīng)管中加入80yL的α-乙酰 乳酸為底物，迅速混合后置于30 °C恒溫水浴中精確反應(yīng)20min后，迅速加入4.6mL顯色劑，混 勻，置于30°C顯色40min后于波長522處讀取吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得轉(zhuǎn)化生成乙偶姻的 量。
[0082] (3)實(shí)施例1的步驟(1)中制備的ALDC-Ca3 (P〇4) 2納米花、實(shí)施例1的步驟(3)中制備 的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca3 (P〇4) 2納米花微球以及對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包覆的 ALDC微球酶活性的測(cè)定。取含有與游離酶等量酶的此三種固定化酶樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照標(biāo) 準(zhǔn)曲線，得到這三種固定化酶作用下轉(zhuǎn)化生成乙偶姻的量。
[0083] (4)將游離酶的酶活性設(shè)為100 %，用固定化酶的酶活性除以游離酶的酶活性，可 得三種固定化酶的相對(duì)酶活。
[0084] 結(jié)果見圖3，從圖3中可以看出根據(jù)本發(fā)明的方法制備的ALDC_Ca3 (P〇4) 2納米花微 球能保持自由酶活性的98%以上。而僅由海藻酸鈣包覆ALDC的活性僅為自由酶的70%左 右。
[0085]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2 :pH值對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)的影響
[0086] 分別用pH為3.5、4、4.5、5、5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，pH為6、6.5的MES緩沖溶液 以及pH為7、7.5、8的Tris-HCl緩沖溶液代替酶活測(cè)定步驟(2)中的MES緩沖液，其余條件不 變，對(duì)所述四種樣品進(jìn)行酶活測(cè)試，可以獲得pH對(duì)四種樣品活性的影響曲線。將最適pH值處 的活性(即最高活性設(shè)為100%，其余pH處活性為相對(duì)于最高活性的相對(duì)活性）
[0087]圖4為pH值對(duì)樣品酶活性的影響曲線，其中圖4a為pH值對(duì)游離ALDC的酶活性的影 響曲線；圖4b為pH值對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC-Ca3(P〇4)2納米花的酶活性的 影響曲線；圖4c為pH值對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca 3(P〇4)2納 米花微球的酶活性的影響曲線；以及圖4d為pH值對(duì)根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包 覆的ALDC微球酶活性的影響曲線。
[0088] 從圖4中可以看出游離酶在pH超過5以后活性急劇下降，而ALDC-Ca3(P〇4)2納米花 的酶活性在PH3.5~7.5范圍內(nèi)仍能保持85%以上的活性，但當(dāng)pH超過7.5時(shí)，活性也會(huì)急劇 下降。而海藻酸鈣與ALDC可以較好地克服pH的影響（圖4d的曲線），因此制備的海藻酸鈣包 覆八1^< &3(?〇4)2納米花微球的酶活性即使在?11大于7.5時(shí)，仍然能夠保持85%以上的活 性。
[0089 ]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3:溫度對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)的影響
[0090] 將實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1的酶活性測(cè)試步驟(2)中的反應(yīng)溫度(恒溫水浴，非顯色溫度)分別 設(shè)置為40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C和70°C，其余反應(yīng)條件不變，對(duì)四種樣品進(jìn)行酶活 性測(cè)試，可以獲得溫度對(duì)四種樣品活性影響曲線。將最適溫度處的活性（即最高活性)設(shè)為 100 %，其余溫度處活性為相對(duì)于最高活性的相對(duì)活性。
[0091] 圖5為溫度對(duì)樣品酶活性的影響曲線，其中圖5a為溫度對(duì)游離ALDC的酶活性的影 響曲線；圖5b為溫度對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC-Ca 3 (P〇4) 2納米花的酶活性的 影響曲線；圖5c為溫度對(duì)根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca3(P〇4) 2納 米花微球的酶活性的影響曲線；以及圖5d為溫度對(duì)根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包 覆的ALDC微球酶活性的影響曲線。
[0092] 溫度對(duì)四種樣品的影響見圖5,從圖中可以看出，根據(jù)本發(fā)明的方法制備得到的海 藻酸鈣包覆Ca3(P〇4) 2_ALDC的納米花微球在45~75°C范圍內(nèi)仍能保持85%的以上的活性， 而僅由海藻酸鈣包覆ALDC在55 °C以上，游離酶在65 °C以上才能保持較好的活性。
[0093]實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4:重復(fù)利用性實(shí)驗(yàn)
[0094]將根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC_Ca3 (P〇4)2納米花、根據(jù)實(shí)施例1的步驟 (3)中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca3 (P〇4) 2納米花微球以及根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻 酸鈣包覆的ALDC微球三種樣品進(jìn)行酶活測(cè)定步驟(3)中的與底物進(jìn)行反應(yīng)后，將此三種樣 品離心取出洗滌后重復(fù)步驟(3)。如此重復(fù)6次，獲得三種固定化酶重復(fù)使用6次每次的酶 活。將第一次的酶活設(shè)為1〇〇%，其余使用后的酶活為相對(duì)于最高酶活的相對(duì)酶活。
[0095] 圖6為表示重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，其中圖6a為根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1) 中制備的ALDC-Ca3(P〇4)2納米花的重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6b為根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備 的海藻酸鈣包覆的ALDC微球酶活性重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6c為根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3) 中制備的海藻酸鈣包覆ALDC-Ca 3(P〇4)2納米花微球的酶活性的重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0096] 對(duì)三種樣品做了重復(fù)性利用的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，根據(jù)實(shí)施例1的步驟(3) 中制備的海藻酸鈣包覆Ca3(P〇4) 2_ALDC納米花微球在重復(fù)利用六次時(shí)依舊能夠保證酶活在 70%以上。而根據(jù)對(duì)比實(shí)施例1中制備的海藻酸鈣包覆ALDC在重復(fù)利用六次時(shí)能保證酶活 在60%以上。但是根據(jù)實(shí)施例1的步驟（1)中制備的ALDC-Ca 3(P〇4)2納米花在重復(fù)利用六次 時(shí)，酶活僅為原酶活的25%左右。由此可見，海藻酸鈣包覆Ca3(P〇4)2_ALDC相比于單純的 ALDC-Ca3(P〇4)2納米花和海藻酸鈣包覆ALDC具有很好的可重復(fù)利用性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶的固定化方法，所述方法包括如下步驟： (1) 在含有待固定化的α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)的緩沖溶液中加入到氯化鈣溶液A中， 在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，離心分離，洗滌，得到形成帶有初步固定化酶的納米花結(jié)構(gòu)， 其中相對(duì)于每毫克載體Ca 3(P〇4)2,固定化酶的含量約為0.12~3.13mg; (2) 將上述步驟(1)中得到的納米花分散到的海藻酸鈉溶液中，攪拌； (3) 將上述步驟(2)中得到的分散液以一定的滴加速度逐滴加入到氯化鈣溶液B中，攪 拌固化后得到直徑約為1至2μπι的微球，離心分離，將微球用蒸餾水洗滌三次，得到包覆了海 藻酸鈣(ALG)的酶和磷酸鈣的微球最終產(chǎn)品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述ALDC緩沖溶液 為PBS緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液），其中ALDC濃度為0 · 05-2mg/ml，優(yōu)選為1 · 2mg/ml，PBS的 濃度為4mmol/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述氯化鈣溶液A的 濃度為〇. l-〇.5mol/L，優(yōu)選為0. l-0.3mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.2mol/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟（1)中所述ALDC緩沖溶液 與所述氯化鈣溶液A的體積比為1:1至200:1，優(yōu)選為30:1至80:1，進(jìn)一步優(yōu)選為50:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟（1)中，反應(yīng)溫度為0至60 °C，優(yōu)選為0至40°C，進(jìn)一步優(yōu)選為25°C，反應(yīng)時(shí)間為1至24小時(shí)，優(yōu)選為4至18小時(shí)，進(jìn)一步 優(yōu)選為12小時(shí)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟(2)中，所述海藻酸鈉的濃 度為0.01至0.06g/ml，優(yōu)選為0.02至0.04g/ml，進(jìn)一步優(yōu)選為0.03g/ml;所述納米花中含有 的ALDC與所述海藻酸鈉重量比為17:100至17:500，優(yōu)選為17:150至17:400，進(jìn)一步優(yōu)選為 17:300;所述攪拌時(shí)間為0.5至2小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中，所述滴加速度為1 至10ml/min，優(yōu)選為1至5ml/min，進(jìn)一步優(yōu)選為3ml/min。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中，所述氯化鈣溶液B 的濃度為〇 · 5至2 · 5mol/L，優(yōu)選為1 · 0至2 · 5mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為2 · Omol/L;所述攪拌固化時(shí) 間為5分鐘至60分鐘，優(yōu)選為5分鐘至30分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選為15分鐘。9. 一種包覆了海藻酸鈣的α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)和磷酸鈣的微球，所述微球根據(jù)權(quán) 利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的酶固定化方法制備。10. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的包覆了海藻酸鈣的α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)和磷酸鈣的 微球在啤酒生產(chǎn)中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N11/04GK105950604SQ201610389084
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】董建軍, 侯同剛, 余俊紅, 王建勛, 尹花, 王蘭, 常宗明, 黃淑霞, 咸漠
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所