Car-cd19抗原受體的人源化融合基因片段、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)和細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域。一種CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段，為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。發(fā)明有效避免了鼠源CD19基因?qū)е碌娜丝故罂贵w的產(chǎn)生。CAR-hCD19嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞在特異識(shí)CD19陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞后，可以在短期內(nèi)有效殺死腫瘤細(xì)胞，可用于治療CD19陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞白血病或B淋巴細(xì)胞瘤，且沒(méi)有明顯的毒副作用。
【專利說(shuō)明】
CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段、其構(gòu)建方法及 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明公開(kāi)了一種CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段、其構(gòu)建方法及應(yīng) 用，屬于生物技術(shù)和細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 白血病，俗稱"血癌"，是一種造血組織的惡性疾病，其主要原因是造血細(xì)胞的某一 系列、或者是某一白細(xì)胞系列的前體細(xì)胞失去分化成熟能力，在骨髓和其他造血組織中呈 惡性克隆性增生、積聚，并侵犯其他人體器官，比如:肝、脾、淋巴結(jié)，最終造成全身組織、器 官的破壞，使正常造血功能受到抑制。與固體腫瘤所不同的是，白血病不是生長(zhǎng)在某個(gè)局部 器官，而是隨著血液系統(tǒng)分布在全身，因此會(huì)影響到人體各個(gè)系統(tǒng)、器官和組織的惡性病。 白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右，是我國(guó)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，其中男性多于女性。 在兒童和青年中最常見(jiàn)，是兒科惡性腫瘤發(fā)病率中排名第一。早期白血病治療主要以化療 為主，對(duì)于中晚期白血病患者，主要的治療方法有化療、骨髓移植。雖然骨髓移植是中晚期 白血病最為有效的治療方法，但其亦存在著價(jià)格昂貴、骨髓源少的缺點(diǎn)。
[0003] 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T細(xì)胞技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展非常 迅速的一種細(xì)胞治療技術(shù)。通過(guò)基因改造技術(shù)，效應(yīng)T細(xì)胞的靶向性、殺傷活性和持久性均 較常規(guī)應(yīng)用的免疫細(xì)胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài)。
[0004] 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)是由抗原特異性的受體(如單 鏈抗體scFv)，間隔序列（spacer)，跨膜序列(TM Domain)和胞內(nèi)共刺激信號(hào)分子組成。間隔 序列可以是111861、111864、1118〇、007或0)8等，跨膜序列可以是0)3(工04、007、0)8、？6￡1?1 Y、H2-Kb等。胞內(nèi)共刺激信號(hào)分子可以是0)28、0)134、0)137、0)244^6￡1?1、（3)3(等。根據(jù) 胞內(nèi)共刺激信號(hào)分子的組成的差異，CAR被分為三代。第一代CAR僅含有一個(gè)胞內(nèi)的信號(hào)分 子，第二代含有兩個(gè)共刺激信號(hào)分子，第三代含有三個(gè)共刺激信號(hào)分子。CAR修飾的T淋巴細(xì) 胞在體內(nèi)能夠通過(guò)其單鏈抗體特異的識(shí)別相關(guān)腫瘤表面抗原，然后通過(guò)胞內(nèi)共刺激信號(hào)分 子將識(shí)別的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，激活T淋巴細(xì)胞的殺傷性，殺傷腫瘤細(xì)胞。
[0005] B淋巴細(xì)胞抗原⑶19,又稱⑶19,是一種屬于Ig超家族成員的穿膜糖蛋白，其廣泛 分布于不同時(shí)期B細(xì)胞表面，包括前B細(xì)胞，不成熟B細(xì)胞，成熟B細(xì)胞，活化B細(xì)胞。另外，CD19 被大部分B細(xì)胞惡性腫瘤(例如，慢性淋巴性白血病，急性淋巴性帕血病和彌漫性大B細(xì)胞 淋巴癌等)所表達(dá)，但并不分布于骨髓中干細(xì)胞上，因此B細(xì)胞惡性腫瘤的理想腫瘤靶點(diǎn)。目 前CAR-T技術(shù)中所應(yīng)用的CD 19抗原受體是采用鼠源基因，例如鼠源單克隆抗體FMC63，但是 此類鼠源基因片段在治療人類疾病過(guò)程中有引起人抗鼠抗體(HAMA，Human anti-mouse antibodies)的產(chǎn)生的可能性，因此人源化整個(gè)基因片段就顯得非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種CAR-CD19抗原受體的人源化融合基 因片段。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述融合基因片段及含有該片段的載體 的構(gòu)建方法。
[0008] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述融合基因片段及含有該片段的載體 的用途。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] -種CAR-抗原受體的人源化融合基因片段，由氮端到碳端順次拼接人源化的抗原 scFv序列、CD28鏈接區(qū)序列、CD28跨膜蛋白區(qū)序列和信號(hào)結(jié)構(gòu)域序列。
[0011] 所述抗原scFv序列的"抗原"包括但不限于CD 10，CD 19，CD20，CD22，CD24，CD30， CD33，CD38，CD39，CD133，CD138，本發(fā)明優(yōu)選 CD19。
[0012] 所述"信號(hào)結(jié)構(gòu)域序列"包括但不限于CD3_zeta序列、FC ε RI γ，CD28,4_1BB (CD137)，0X-40(CD134)中的一種或幾種，安全自殺基因，如FKBPCasp9等。該信號(hào)結(jié)構(gòu)域序 列可以任意組合。本發(fā)明選用⑶3-zeta序列。
[0013] -種CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段，由氮端到碳端順次拼接人源化的 ⑶19scFv序列、⑶28鏈接區(qū)序列、⑶28跨膜蛋白區(qū)序列、⑶28細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白區(qū)序列和⑶3-zeta序列。
[0014] 所述CAR-⑶19抗原受體的人源化融合基因片段（即CAR-h⑶19融合基因片段)為序 列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0015] 本發(fā)明為了減小載體質(zhì)粒的大小，進(jìn)而增加轉(zhuǎn)染和病毒的生產(chǎn)效率，人源化融合 基因片段中的某些位點(diǎn)被人為的進(jìn)行了刪減，這樣既有效的縮短了整個(gè)基因的序列，同時(shí) 保持了完整的融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，保留了其有效的抗原識(shí)別性、同時(shí)提高了細(xì)胞 毒性。
[0016] 含有并表達(dá)所述的CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體。所述載體是 指能把所攜帶的基因片段在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的各種病毒及質(zhì)粒，既包括永久性整合進(jìn)細(xì)胞基因 組中的，也包括在細(xì)胞內(nèi)只能短暫表達(dá)的載體。所述載體包括但不限于病毒、質(zhì)?；騌NA;所 述病毒為慢病毒、腺病毒、腺聯(lián)病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒或其他本領(lǐng)域常用病毒載體。
[0017] -種含有CAR-⑶19抗原受體的人源化融合基因片段的載體的構(gòu)建方法，包括以下 步驟：
[0018] (1)利用PCR及重疊延伸技術(shù)分別設(shè)計(jì)包含BsmI和Notl酶切位點(diǎn)及至少兩個(gè)隨機(jī) 堿基的引物，將BsmI和Notl引入hCD19抗體人源編碼基因的兩端，并將包含h⑶19的PCR片段 產(chǎn)物克隆入pGEM-T easy載體，得到pGEM-T-hCD19;
[0019] ⑵用步驟（1)同樣的方法分別擴(kuò)增CD28鏈接區(qū)序列、CD28跨膜蛋白區(qū)序列、CD28 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白區(qū)序列和CD3zeta片段，按順序整合進(jìn)pGEM-T-hCD19載體中，得到包含CAR-h⑶19融合基因片段的載體；
[0020] (3)通過(guò)BsmI和Sail將整個(gè)CAR-hCD19融合基因片段插入到pHIV-EGFP真核表達(dá)載 體中，得到pcHIV-CAR-hCD19表達(dá)載體。
[0021] 所述步驟（1)中的引物為序列表SEQ ID No.2和序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸 序列；步驟(2)中CAR-h⑶19融合基因片段為序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0022]含有上述的CAR-h⑶19抗原受體的人源化融合基因片段的宿主細(xì)胞。
[0023] 含有CAR_hCD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體的宿主細(xì)胞。
[0024] -種治療癌癥的藥物，含有CAR_hCD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體的 宿主細(xì)胞，作為活性成分制備而成的。
[0025] 所述宿主細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。本發(fā)明攜帶有融合基因的載體，通過(guò)其特有的方式整 合進(jìn)T淋巴細(xì)胞的基因組中，融合基因得到正確表達(dá)，形成具有識(shí)別癌癥細(xì)胞所表達(dá)的特異 性抗原的scFv部分、跨膜蛋白部分及兩個(gè)協(xié)同信號(hào)結(jié)構(gòu)域。此時(shí)，T淋巴細(xì)胞被構(gòu)造成CAR-T 淋巴細(xì)胞，因此具有特異殺傷表達(dá)某特定抗原的癌癥細(xì)胞。
[0026] 所述的CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段用于制備治療癌癥的藥物的用 途。
[0027] 含有CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體用于制備治療癌癥的藥物 的用途。
[0028] 含有CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體的宿主細(xì)胞用于制備治療 癌癥的藥物的用途。
[0029]所述癌癥為⑶19陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞白血病或B淋巴細(xì)胞瘤。
[0030] 本發(fā)明可用于治療⑶19陽(yáng)性的白血病和B淋巴細(xì)胞瘤，提供了一種新型的CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法）細(xì) 胞治療方法。
[0031] 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明構(gòu)建的含有CAD_hCD19融合基因的真核表達(dá)載體，在培養(yǎng)條 件下快速增值，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合到T淋巴細(xì)胞的基因組中，在T淋巴細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，特 異性識(shí)別B淋巴細(xì)胞表面所表達(dá)的⑶19蛋白，進(jìn)而有效殺死B淋巴細(xì)胞。經(jīng)過(guò)7-10天培養(yǎng)后， CAR-T淋巴細(xì)胞的數(shù)量被成百上千倍地增殖，且細(xì)胞毒性達(dá)到最高。從培養(yǎng)環(huán)境中分離純化 得到的CAR-hCD19 T淋巴細(xì)胞可以被凍存，在合適的時(shí)機(jī)下回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明設(shè)計(jì)的人源化的CAD_hCD19融合基因序列，有效避免了鼠 源CD19基因?qū)е碌娜丝故罂贵w的產(chǎn)生。將該嵌合抗原受體轉(zhuǎn)入表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在人淋巴 細(xì)胞表面的高效表達(dá)，將非特異性的淋巴細(xì)胞定向改造為能夠識(shí)別人CD19從而介導(dǎo)CD19陽(yáng) 性的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向殺傷的特異性淋巴細(xì)胞。其中特別優(yōu)選的融合基因序列使得嵌合性 抗原受體更好地發(fā)揮作用。CAR-hCD19嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞在特異識(shí)CD19陽(yáng)性的 腫瘤細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)后，可以在短期內(nèi)有效殺死腫瘤細(xì)胞，并在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在，能 有效防止病情的復(fù)發(fā)，可用于治療CD19陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞白血病或B淋巴細(xì)胞瘤，且沒(méi)有明 顯的毒副作用。
[0033]以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，并非對(duì)本發(fā)明的限制。根 據(jù)本領(lǐng)域公知常識(shí)，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方式并不僅限于實(shí)施例所公開(kāi)的內(nèi)容，因此凡依照本發(fā) 明技術(shù)啟示所進(jìn)行的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為本發(fā)明原理圖
[0035]圖2為CAR-h⑶19融合基因片段設(shè)計(jì)圖
[0036] 圖3為CAR-h⑶19融合基因在T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)量圖
[0037]圖4為表達(dá)CAR-h⑶19融合基因的T淋巴細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
【具體實(shí)施方式】
[0038]實(shí)施例1:質(zhì)粒載體構(gòu)建
[0039]以下實(shí)驗(yàn)中的DNA基因片段均由體外擴(kuò)增合成，并由基因測(cè)序確定其正確序列。 [0040] 1、利用PCR及重疊延伸技術(shù)分別設(shè)計(jì)包含BsmI和Notl酶切位點(diǎn)及至少兩個(gè)隨機(jī)堿 基的引 物5 '-GGGCATTCCTCCTGATCCAGACATCCAG ( SEQ ID 1^0.2^5: AGTCAGTGGCAGAGGAGTCGCCGGCGTGG(SEQ ID No · 3)。將BsmI和Notl 引入hCD19抗體人源編碼 基因的兩端，并將包含hCD19的PCR片段產(chǎn)物克隆入pGEM-T easy載體(載體購(gòu)于Promega公 司），得到 pGEM-T-hCD19;
[00411 2、用步驟（1)的方法分別擴(kuò)增⑶28鏈接區(qū)序列、CD28跨膜蛋白區(qū)序列、⑶28細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)蛋白區(qū)序列和⑶3zeta片段，按順序整合進(jìn)pGEM-T-hCD19載體中，得到包含CAR-h⑶19抗 原受體的人源化融合基因片段的載體；
[0042] 3、通過(guò)BsmI和Sail酶切位點(diǎn)將整個(gè)CAR-h⑶19抗原受體的人源化融合基因片段插 入到慢病毒質(zhì)粒載體pHIV-EGFP(https: //www · addgene · org/21373/，addgene公司產(chǎn)品， Plasmid#21373)的EF-Ια啟動(dòng)子之后，得到pcHIV-CAR-hCD19表達(dá)載體。
[0043] 得到的CAR-hCD19核心基因片段由人源化的⑶19scFv開(kāi)始，緊接其后的是⑶28鏈 接區(qū)、CD28跨膜蛋白區(qū)、CD28細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白區(qū)和由CD3-zeta組成的一級(jí)和二級(jí)信號(hào)結(jié)構(gòu)域 (見(jiàn)圖2)，CAR-h⑶19核心基因片段為序列表SEQ ID No.l所示的核苷酸序列。
[0044]實(shí)施例2:慢病毒制備
[0045]實(shí)施例1得到的載體質(zhì)粒同其他慢病毒包裝質(zhì)粒，如包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev及包膜蛋白質(zhì)粒pMD2 .G按照1 : 1 : 1 : 0.5的比例，采用轉(zhuǎn)染試劑，如磷酸鈣或 1^卩(^6(^3111；[116(1'1161'1]1〇?181161')等，按照具體試劑操作說(shuō)明共同轉(zhuǎn)染密度達(dá)到60%-70% 的293T細(xì)胞株。
[0046] 293T細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后，在24-72小時(shí)之內(nèi)，通過(guò)收集細(xì)胞上清液的形式開(kāi)始收集慢 病毒載體，之后經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾的方式濃縮、純化慢病毒載體，最后在-80 °C條件下長(zhǎng)期冷凍 保存。
[0047]實(shí)施例3: CAR-T細(xì)胞的制備及模型試驗(yàn)
[0048] 通過(guò)白細(xì)胞除去法獲得的外周血細(xì)胞產(chǎn)品，采用密度梯度離心的方式分離外周血 單個(gè)核細(xì)胞(主要包含⑶3+的T淋巴細(xì)胞，CD19+的B淋巴細(xì)胞及少量的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞等），培養(yǎng)在不含牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0049] T淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)⑶3/⑶28 Dynabeads(購(gòu)于Thermo Fisher公司）激活和慢 病毒（1:1 -1:50的轉(zhuǎn)化濃度)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，在合適的培養(yǎng)條件下快速增值。取不同時(shí)間段的細(xì)胞， 稀釋濃度到 1E6細(xì)胞/100μ1 PBS，采用抗體CD3-FITC，CD19-PE(購(gòu)于Becton Dickinson)根 據(jù)廠家操作建議的濃度，在冰上染色30分鐘，清洗后在濃度0.5 %的多聚甲醛溶液中重新懸 浮，最后在Accuri C6流式細(xì)胞儀（購(gòu)于BD公司）上進(jìn)行定量分析。慢病毒所攜帶的CAR-hCD19融合基因經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后被永久性的整合進(jìn)T淋巴細(xì)胞的基因組中，并在T淋巴細(xì)胞表 面進(jìn)行表達(dá)(見(jiàn)圖3)，并能特異性識(shí)別B淋巴細(xì)胞表面所表達(dá)的CD19蛋白，進(jìn)而殺死B淋巴細(xì) 胞(見(jiàn)圖4)。
[0050] 圖3顯示，分別取第5天和細(xì)胞收獲之前的細(xì)胞，按照上述方法，染色細(xì)胞，并在流 式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，顯示CAR-hCD19在T淋巴細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞含量隨著培養(yǎng) 時(shí)間增加而增高。
[0051 ]圖4顯示，采用密度梯度離心的方式分離外周血單個(gè)核細(xì)胞后，在第0天，第3天，第 6天，分別取細(xì)胞，按照上述方法，對(duì)⑶3+Τ細(xì)胞和⑶19+Β細(xì)胞進(jìn)行流式分析。其中，Mock組為 對(duì)照組(不加病毒進(jìn)行改造，不表達(dá)CAR)，Vect 〇r組為實(shí)驗(yàn)組(經(jīng)過(guò)慢病毒改造，表達(dá)CAR+)， 1和2為兩個(gè)不同人的樣本組。對(duì)照組Ι-Mock和2-Mock顯示，未經(jīng)過(guò)慢病毒改造、不表達(dá)CAR+ 的T細(xì)胞不具有殺傷CD19+B細(xì)胞的功能，從第0天到第6天一直存在CD19+的B細(xì)胞;而實(shí)驗(yàn)組 Ι-Vector和2-Vector顯示經(jīng)過(guò)慢病毒改造、表達(dá)CAR+的T細(xì)胞具有殺傷⑶19+B細(xì)胞的功能， 從第3天開(kāi)始檢測(cè)不到CD19+的B細(xì)胞。
[0052]經(jīng)過(guò)7-10天的培養(yǎng)后，T淋巴細(xì)胞的數(shù)量被成百上千倍的增值，并且細(xì)胞毒性達(dá)到 最高。最后，混合培養(yǎng)中的⑶3/⑶28 Dynabeads被分離出，純化后的CAR-hCD19 T淋巴細(xì)胞 被凍存，并在合適的時(shí)機(jī)被回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。
[0053]本發(fā)明攜帶有融合基因的載體，通過(guò)其特有的方式整合進(jìn)T淋巴細(xì)胞的基因組中， 融合基因得到正確表達(dá)，形成具有識(shí)別癌癥細(xì)胞所表達(dá)的特異性抗原的scFv部分、跨膜蛋 白部分及兩個(gè)協(xié)同信號(hào)結(jié)構(gòu)域。此時(shí)，T淋巴細(xì)胞被構(gòu)造成CAR-T淋巴細(xì)胞，因此具有特異殺 傷表達(dá)某特定抗原的癌癥細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段，其特征在于：由氮端到碳端順次拼 接人源化的⑶19 scFv序列、⑶28鏈接區(qū)序列、CD28跨膜蛋白區(qū)序列、CD28細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白區(qū) 序列和CD3_zeta序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化融合基因片段，其特征在于:所述的基因片段為序列表 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 含有并表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于:所述載體為病毒、質(zhì)?；騌NA;所述病毒為 慢病毒、腺病毒、腺聯(lián)病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。5. -種含有CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體的構(gòu)建方法，其特征在于 包括以下步驟： (1) 利用PCR及重疊延伸技術(shù)分別設(shè)計(jì)包含BsmI和NoU酶切位點(diǎn)及至少兩個(gè)隨機(jī)堿基 的引物，將BsmI和NotI引入h⑶19抗體人源編碼基因的兩端，并將包含h⑶19的PCR片段產(chǎn)物 克隆入pGEM-T easy載體，得到pGEM-T-hCD19; (2) 用步驟（1)的方法分別擴(kuò)增CD28鏈接區(qū)序列、CD28跨膜蛋白區(qū)序列、CD28細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 蛋白區(qū)序列和CD3zeta片段，按順序整合進(jìn)pGEM-T-hCD19載體中，得到包含CAR-hCD19融合 基因片段的載體； (3) 通過(guò)BsmI和Sail將整個(gè)CAR-hCD19融合基因片段插入到pHIV-EGFP真核表達(dá)載體 中，得到pcHIV-CAR-hCD19表達(dá)載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種含有CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段的載體的 構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟（1)中的引物為序列表SEQ ID NO.2和序列表SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列；步驟(2)中CAR-hCD19融合基因片段為序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列。7. 含有權(quán)利要求1或2所述的CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段和/或權(quán)利3或4 所述的載體的宿主細(xì)胞;所述宿主細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。8. -種治療癌癥的藥物，其特征在于:含有權(quán)利要求1或2所述的融合基因片段、或含有 權(quán)利要求3或4所述的載體、或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞。9. 權(quán)利要求1或2所述的CAR-CD19抗原受體的人源化融合基因片段和/或權(quán)利3或4所述 的載體和/或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞用于制備治療癌癥的藥物的用途。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備治療癌癥的藥物的用途，其特征在于:所述癌癥為CD19 陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞白血病或B淋巴細(xì)胞瘤。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105950645SQ201610014730
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年1月11日
【發(fā)明人】荊東輝
【申請(qǐng)人】灝靈賽奧（天津）生物科技有限公司