針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體為針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，其具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列，可用于免疫檢測(cè)、抗原富集純化等領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(親和性、特異性、穩(wěn)定性等)更好的突變體，用來發(fā)展進(jìn)一步用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。
【專利說明】
針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱納米抗體技術(shù)），以及基因工程抗體技術(shù)，特 別是針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體或多肽。 技術(shù)背景
[0002] 單域抗體是指由普通抗體可變區(qū)（VH或VL)組成的基因工程抗體。單域重鏈抗體 (又稱為納米抗體，VHH 抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chain anti body)是指僅由重鏈抗體(heavy-chain antibody)可變區(qū)（Variable region)組成的 基因工程抗體，其中，重鏈抗體(heavy-chain antibody)是一種存在于胳盤、藍(lán)魚等動(dòng)物體 內(nèi)天然缺失輕鏈的抗體。單域重鏈抗體是目前已知的最小的完整抗原結(jié)合片段，具有分子 量小、滲透性好等特點(diǎn)，目前已廣泛用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和檢測(cè)、抗體藥物開發(fā)等領(lǐng)域。
[0003] 前列腺癌是一種嚴(yán)重威脅老年男性健康的惡性腫瘤，其早期診斷和治療對(duì)于其預(yù) 后具有重要的意義。前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA) 是一種位于前列腺細(xì)胞膜上的II型跨膜糖蛋白，由750個(gè)氨基酸組成，分為胞內(nèi)區(qū)（氨基酸 序列為1-18)、跨膜區(qū)（19-43)和胞外區(qū)（44-750)，相對(duì)于傳統(tǒng)用于臨床檢測(cè)的前列腺特異 抗原(prostate specific antigen，PSA)，是一種更加敏感和特異的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物， 尤其是在激素難治性前列腺癌及前列腺癌轉(zhuǎn)移灶中均為高表達(dá)，在區(qū)分前列腺癌和其他類 型惡性腫瘤的敏感度和特異性分別為65.9%和94.5%。另外，在多種非前列腺來源的實(shí)體 瘤，如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、腎癌和結(jié)直腸癌等，PSMA也高度特異地表達(dá)于腫瘤血管 內(nèi)皮細(xì)胞上。而且本身具有神經(jīng)羧基肽酶和葉酸水解酶的活性，加之707個(gè)氨基酸組成的胞 外區(qū)能夠提供多個(gè)抗原表位等特點(diǎn)，使其成為了腫瘤免疫靶向治療和分子影像學(xué)中重要的 研究靶點(diǎn)。
[0004] 目前，人們發(fā)現(xiàn)了多種針對(duì)PSMA亦制備了多種能與其發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，包 括單克隆抗體7E11、J591，適體A9和A10，重組技術(shù)得到的ScFv抗體D7、Fab抗體及人源化抗 體的報(bào)道特別是已經(jīng)通過美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌的診斷和晚期核素治療的lllln-噴地 肽，就是基于針對(duì)PSMA的單克隆抗體與放射性核素相連而成。但與單域重鏈抗體相比，這些 配體存在生產(chǎn)成本相對(duì)較高，制備過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，可以被用于制備 檢測(cè)前列腺特異性膜抗原的試劑和工具。
[0006] 本發(fā)明提供一個(gè)針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體（即本發(fā)明針對(duì)前列腺 特異性膜抗原的單域重鏈抗體），具有SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列，其氨基酸序列可通 過標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法(ImMunoGeneTics，IMGT)進(jìn)行編號(hào)和結(jié)構(gòu)域的劃分。
[0007] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含框架區(qū)中的一個(gè)或者兩個(gè)以上的氨 基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸序列具有90 %同源性。
[0008] 本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含互補(bǔ)決定區(qū)中的一個(gè)或者兩個(gè)以上 的氨基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸序列具有80 %同源性。
[0009] 本發(fā)明提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID N0.: 1，通過遺傳密碼子可以隨 時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。該核酸分子的序列如SEQ ID N0. :2。
[0010] 本發(fā)明還提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.: 1部分結(jié)構(gòu)域，通過遺傳 密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。
[0011] 本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表 達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲 細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸 序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
[0013] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。
[0014] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)細(xì)胞上前列腺特異性膜抗原的方法，其特征是含有上述蛋 白質(zhì)或多肽?；诒景l(fā)明提供的蛋白質(zhì)或多肽與前列腺特異性膜抗原特異性結(jié)合的能力， 建立前列腺特異性膜抗原的檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)，免疫芯片 法，親和層析法和免疫層析法。
[0015] 本發(fā)明針對(duì)前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體在非疾病診斷治療目的免疫檢測(cè)、 以及菌體或抗原富集純化中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造， 能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發(fā)展進(jìn)一步用于 醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。
[0017] 本發(fā)明還涉及一種針對(duì)前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料，包括載體，搭 載在載體上的配基，該材料以針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體作為配基，所述針 對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體具有SEQ ID N0.: 1所示的氨基酸序列。所述載體為 磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。
[0018] 本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語具有如下含義：
[0019] 同源性:描述兩個(gè)或更多氨基酸序列的相似程度，第一個(gè)氨基酸序列和第二個(gè)氨 基酸序列之間同源性的百分比可以通過【第一個(gè)氨基酸序列中與第二個(gè)氨基酸序列中相應(yīng) 位置處的氨基酸序列相同的氨基酸殘基的數(shù)量】除以【第一個(gè)氨基酸序列中氨基酸總數(shù)】在 乘以【100%】來計(jì)算，其中第二個(gè)氨基酸序列中的某個(gè)氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與 第一個(gè)氨基酸相比）被認(rèn)為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹 配的計(jì)算機(jī)運(yùn)算程序如NCBI Blast獲得。
[0020] 結(jié)構(gòu)域:蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
[0021 ] IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種 已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)（E h r e n m a n，F(xiàn) ?， Q.Kaas,et al . ( 2010 ) .，! IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAl ign ： a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies ?T cell receptors，MHC， IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301_307.Lefranc，M.P.， C.Pommie，et al ? (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains"Dev comp Immunol 27(1) :55_77.http://www. imgt.org/)中的描述。
[0022] 密碼子(codon):又稱為三連體密碼子(triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核 苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。
[0023] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體或多肽具有 與前列腺特異性膜抗原特異性結(jié)合、可以通過生物學(xué)方法大規(guī)模生產(chǎn)、成本低、高效、分子 量小、滲透性好等性質(zhì)，顯示出良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1菌落PCR產(chǎn)物電泳、重組蛋白電泳和Western Blot鑒定圖。左邊Marker泳道為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1中的菌落PCR片段出現(xiàn)在預(yù)期位置。中間為純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，在預(yù)期位置出現(xiàn)明亮條帶。右邊為以抗PSMA單克隆抗體和抗His標(biāo)簽抗體的 Western Blot鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這些 具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 前列腺特異性膜抗原膜外區(qū)的真核表達(dá)
[0028] 采用RNAiso Plus試劑提取高表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞中總RNA，利用RT-PCR方法得 到編碼PSMA胞外區(qū)片段的DNA片段，使用Not I與BamH I兩種限制性內(nèi)切酶將其插入真核表 達(dá)載體pRAG2a，通過T4DNA連接酶連接為重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到TOP 10感受態(tài)細(xì)胞 培養(yǎng)過夜，將鑒定正確的克隆送測(cè)序驗(yàn)證。提取陽性克隆的質(zhì)粒，使用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000將DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中培養(yǎng)，于不同時(shí)相點(diǎn)收集上清，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測(cè)。培養(yǎng)一定時(shí)間后，按照HisTrap FF Crude試劑盒操作純化該蛋白。將純 化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉后，分別加入PSMA抗體和 His抗體，4°C過夜;漂洗后，加二抗室溫下孵育lh，再次漂洗，加入顯色液進(jìn)行顯影(圖1)。 [0029] 實(shí)施例2
[0030]抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體（即針對(duì)抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗 體)的淘選與鑒定
[0031]采用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫(為參考文獻(xiàn):〃涂追，許楊， 劉夏，等.駝源天然單域重鏈抗體庫的構(gòu)建與鑒定[J].中國(guó)生物工程雜志，2011，31 (4): 31 -36."中構(gòu)建的展示文庫）中淘選針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體。前列腺特異性 膜抗原膜外區(qū)的表達(dá)按照上述的實(shí)施例1進(jìn)行，第一輪淘選時(shí)，采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS， pH7.4)稀釋上述合成的PSMA胞外區(qū)蛋白至150yg/mL (第2-4輪包被濃度分別為100、50、50y g/mL)，在酶標(biāo)板上每孔加入100此，4 °C包被過夜。PBST (含0.5 % Tween 20)洗板5次，3 % BSA-PBS在37 °C封閉2h，洗板3次，加入與0.5 % BSA-PBS孵育過的噬菌體抗體庫100yL (約含2 X10nCFU)，37°C孵育lh，用PBST洗板5次(逐輪增加3次），再用PBS洗板10次(逐輪增加5次）。 再以100此洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附的噬菌體(37°C，5min)，用50此1>4_ HCl(lmol/L，pH 9.0)中和洗脫物，取10yL用于滴度測(cè)定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘 選。
[0032]經(jīng)過四輪淘選后采用濃度為5yg/mL的PSMA胞外區(qū)蛋白包被酶標(biāo)板，洗板、封閉同 上。加入擴(kuò)增純化的噬菌體克隆37°C孵育15min，100yL/孔，37°C孵育lh。洗板后加入稀釋度 為1:5000的 HRP-anti-M13 抗體，100yL/孔，37 °C孵育 lh 1BST 洗板 5次，加 TMB工作液 100yL/ 孔，室溫20min，每孔加入50yL硫酸(濃度為2mol/L)終止反應(yīng)，測(cè)定450nm吸光值。以前一輪 擴(kuò)增的噬菌體抗體庫直接包被酶標(biāo)板作為陽性對(duì)照，以PBS替代噬菌體克隆為空白對(duì)照，用 間接phage-EL ISA法測(cè)定菌體顆粒的結(jié)合活性。
[0033] 表1間接phage-ELISA加樣表
[0035]將ELISA陽性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到抗前列腺特異性膜抗原單域重 鏈抗體噬菌體陽性克隆的插入片段DNA序列，具體為(SEQ ID N0. :2):
[0037] 其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.: 1所示：
[0038] QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRFSRYAMGWFRQAPGKEREFIASISRSGGTTYYGDSVKGRFTISRDNAKNT VYLQMNTLKAEDTAVYYCAARTKGFGLRGQYHYWGQGTQVTVSS。即本發(fā)明抗前列腺特異性膜抗原的單 域重鏈抗體，其能與PSMA蛋白的膜外區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合。
[0039] 實(shí)施例3
[0040] PSMA表達(dá)細(xì)胞的ELISA和熒光免疫檢測(cè)
[0041 ] 胃癌細(xì)胞MKN45不表達(dá)PSMA，而前列腺癌細(xì)胞LNCaP表達(dá)PSMA，以這兩種細(xì)胞為例， 采用實(shí)施例2中淘選獲得的抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆進(jìn)行細(xì)胞 水平的ELI SA和熒光免疫檢測(cè)。向96孔板中分別種入LNCaP細(xì)胞(表達(dá)PSMA)和MKN45細(xì)胞(不 表達(dá)PSMA)各1 X 104個(gè)，培養(yǎng)過夜。4%多聚甲醛固定，每孔滴加 lOOyL的3 %過氧化氫液，用 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，37 °C孵育30min。TBS洗板3次，5 %BSA-PBS封閉，加入1 OOyL 抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆，于37°C孵育lh。其后PBS漂洗，添加 HRP-ant i -Ml 3抗體、TMB工作液和0D45Q的測(cè)定同實(shí)施例2。陽性對(duì)照使用噬菌體替代細(xì)胞，空 白對(duì)照使用PBS替代添加的噬菌體克隆，重復(fù)3次。
[0042]向24孔板中的每孔中添加細(xì)胞爬片后種入LNCaP細(xì)胞和MKN45細(xì)胞各4X 105個(gè)，培 養(yǎng)過夜。取出爬片，4%多聚甲醛固定，漂洗，滴加3%過氧化氫在爬片表面，用以阻斷內(nèi)源性 過氧化物酶活性。其后TBS洗3次，5 % BSA-PBS封閉30min。滴加100此展示本發(fā)明所述納米抗 體的噬菌體克隆孵育lh，以不加噬菌體克隆的細(xì)胞爬片為空白對(duì)照。其后添加稀釋度為1:2 000的anti-M13單克隆抗體孵育30min。洗片后滴加30yl稀釋度為1:200的FITC-山羊抗小鼠 二抗，避光孵育30min，并用DAPI染色液進(jìn)行復(fù)染，置于熒光顯微鏡下觀察。
[0043] 結(jié)果表明：由于不表達(dá)PSMA的MKN45細(xì)胞測(cè)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與空白對(duì)照存在差異，表 明該噬菌體能夠與其發(fā)生非特異性結(jié)合;但是LNCaP細(xì)胞測(cè)值顯著高于MKN45細(xì)胞，表明這 一部分差異來自于PSMA和抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆的特異性 結(jié)合。同時(shí)，細(xì)胞免疫熒光表明LNCaP細(xì)胞能夠與針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體 陽性克隆結(jié)合，而MKN45細(xì)胞以及未加抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克 隆的細(xì)胞爬片為陰性，表明淘選出的抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆 能夠有效地與PSMA表達(dá)陽性的細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。
[0044] 實(shí)施例4
[0045]抗前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體在大腸桿菌中的表達(dá)
[0046] 提取實(shí)施例2中針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體陽性克隆的噬菌粒為模 板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增條件:94°C 5min預(yù)變性;94°C 30s、55°C 30s、72°C 40s共30個(gè)循環(huán);最后72°C再延伸5min。結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收目的 片段。
[0047] 將得到編碼本發(fā)明所提供的抗前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的雙酶切基 因片段克隆連接到表達(dá)載體pET_28a，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，得到重組質(zhì)粒。
[0048]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(Rosseta)中，并挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌 落接種于LB培養(yǎng)基的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)，過夜活化;次日，按1 %的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中，37 °C、250rpm振蕩培養(yǎng)，至0D6QQ約為0.6后，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，37 °C、250rpm誘導(dǎo)4h。
[0049] 上述誘導(dǎo)的2mL菌液通過8000rpm離心得到菌體，菌體使用無菌roS洗滌3次，并用 lmL無菌PBS進(jìn)行重懸菌體，冰上超聲破碎菌體直至菌液清亮，在4°C下對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行離 心，離心條件為12000rmp/min，時(shí)間為10min，取上清加入5yl 5XSDS上樣緩沖液，沸水煮沸 5min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析并采用鎳柱對(duì)其進(jìn)行純化。
[0050]通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件（如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度 等），可以進(jìn)一步提高目的蛋白（單域重鏈抗體)的表達(dá)量，為大量制備抗前列腺特異性膜抗 原的單域重鏈抗體提供了途徑。
[0051 ] 實(shí)施例5
[0052]針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體親和常數(shù)的測(cè)定
[0053]將實(shí)施例4中表達(dá)的單域重鏈抗體采用生物素化試劑盒進(jìn)行生物素化標(biāo)記，其后 使用標(biāo)準(zhǔn)的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA技術(shù)測(cè)定生物素化針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體與實(shí) 施例1中重組表達(dá)的PSMA蛋白親和能力。具體步驟為:首先采用InM生物素化的針對(duì)前列腺 特異性膜抗原的單域重鏈抗體分別與13種不同濃度(0.1 nM~100yM)的PSMA抗原在EP管中 進(jìn)行30min孵育;其后，將90yL混合液加入已使用3 %BSA-PBST封閉的、包被有PSMA蛋白的酶 標(biāo)板中，孵育l〇min后，吸棄反應(yīng)液，并用PBST清洗;接著，加入100yL稀釋度為1:2000HRP標(biāo) 記的鏈霉親和素，孵育lh后采用PBST清洗5次;TMB工作液的使用和0D4 5Q的測(cè)定同實(shí)施例2。 采用非線性回歸分析得到〇D45Q最大值一半時(shí)，對(duì)應(yīng)的PSMA濃度，根據(jù)抗原-抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 實(shí)驗(yàn)的原理得出生物素化的針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體親和常數(shù)為5 X KTV M左右。
[0054]實(shí)施例6免疫親和吸附材料的制備 [0055] 1、免疫親和磁珠的制備
[0056] 采用納米磁珠作為載體，偶聯(lián)針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體后，得到 針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體免疫磁珠，具體制備方法如下：
[0057] 取lmg羧基修飾的磁珠(購(gòu)自無錫百運(yùn)納米科技有限公司，羧基磁珠300nm)于離心 管中，加入500y 1活化緩沖液(1 OmM，NaH2P〇4，pH 6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用 活化緩沖液洗滌2遍。分別加入2mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后， 靜置30min。用偶聯(lián)緩沖液（10mM，Na 2HP〇4，pH 7.4)洗滌磁珠3遍，加入溶于偶聯(lián)緩沖液的針 對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體lmg，室溫反應(yīng)3h，用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠3次，加入 500iil含l%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)或1% (w/v)卵清蛋白（0VA)的偶聯(lián)緩沖液封閉未反應(yīng) 的活性基團(tuán)，室溫反應(yīng)30min。用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠3次，PBS溶液（10mM，pH7.4，0.02%w/ v，Na3N)重懸后保存于4°C。
[0058] 2、針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體免疫親和吸附材料及親和柱的制備。 采用瓊脂糖微球作為載體，偶聯(lián)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，具體制備方法如下： [0059] 將CNBr活化的干膠用0.1M HC1洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液（10mM， Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌10次，加入針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂 糖微球），室溫反應(yīng)4h，使針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝 膠微球共價(jià)偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液（1 〇mM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2h 以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)。用5倍膠體積的磷酸緩沖液（10mM，pH 7.4)和醋酸緩沖液(0.謂， pH 4.0)交替洗滌3次，得到共價(jià)偶聯(lián)了針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的免疫親 和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為lml的層析柱，5~10倍柱床體積的 PBS (1 OmM，pH 7.4)洗滌后，加入20 %乙醇溶液，4 °C保存。
[0060] 3、針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體免疫親和吸附材料及親和柱的制備。 采用硅膠微球作為載體，偶聯(lián)抗前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，具體制備方法如下： [0061 ] 取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 6.0)交替洗滌5~10次，用10ml PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入5mg針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，混勻，加入終 濃度5mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4°C攪拌反應(yīng)12~24h，得到共價(jià)偶聯(lián)了針對(duì)前列 腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取〇.2ml上述免疫親和吸附材料于 容量為lml的層析柱，5~10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 6)洗滌后，加入含0.02%(w/v)Na3N 的PBS(10mM，pH 6)，4°C保存。
[0062]本發(fā)明針對(duì)前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有 SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識(shí)別前列腺特異性膜抗原。該單域重鏈 抗體容易獲得、吸附效率高，可以通過生物學(xué)方法大量培養(yǎng)生產(chǎn)配基為單域重鏈抗體，避免 了人工抗體等繁瑣生產(chǎn)方法，大大降低了生產(chǎn)成本。具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特 性，這些特性對(duì)于前列腺特異性膜抗原的低成本、可重復(fù)使用的純化及免疫學(xué)檢測(cè)方法有 重要的實(shí)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。2. -種核酸分子，其特征是編碼權(quán)利要求1中所述氨基酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQ ID NO.:2。4. 一種包含權(quán)利要求2所述的核酸序列的載體。5. -種包含權(quán)利要求4所述的載體的宿主細(xì)胞。6. 權(quán)利要求1所述的針對(duì)前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體在免疫檢測(cè)、菌體或抗原 富集純化中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體在制備前列腺特異性膜 抗原免疫檢測(cè)、富集以及純化試劑或材料中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述的針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技 術(shù)進(jìn)行改造所獲得的能與前列腺特異性膜抗原特異性結(jié)合的抗體。9. 一種針對(duì)前列腺特異性膜抗原的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配 基，其特征在于該材料以針對(duì)前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體作為配基，所述針對(duì)前 列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體具有SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/13GK105968201SQ201610073913
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年2月3日
【發(fā)明人】涂追, 許楊, 李燕萍, 黃志兵
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)