一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明方法為將將黑曲霉纖維素外切酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID NO.3所示的序列。改造后的黑曲霉纖維素外切酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。通過(guò)將SEQ ID NO.4所示基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上，再用所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母即可得到生產(chǎn)改造后的黑曲霉纖維素外切酶的酵母菌株。改造后的黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性得到了提高。
【專利說(shuō)明】
一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn) 定性的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 黑曲霉纖維素酶是一種廣泛使用的纖維素酶。在纖維素酶的作用下，纖維素被降 解成可以利用的糖類。自然界里面有大量的纖維素在高鹽環(huán)境之下，比如海藻、海洋垃圾中 的纖維素、造紙廢水中的纖維素等。高鹽環(huán)境下纖維素的降解需要能夠耐受高鹽度的纖維 素酶，因?yàn)楦啕}度會(huì)降低普通纖維素酶的熱穩(wěn)定性，耐鹽的纖維素酶在高鹽度下要具有更 尚的熱穩(wěn)定性。
[0004] 黑曲霉纖維素酶是一種具有較好熱穩(wěn)定性的纖維素酶，然而其在高鹽度下的熱穩(wěn) 定性有待進(jìn)一步提尚，提尚其在尚鹽度下的熱穩(wěn)定性有利于降低纖維素的降解成本，從而 提升纖維素利用的價(jià)值。
[0005] 提升纖維素酶的熱穩(wěn)定性或者提升纖維素酶高鹽度下熱穩(wěn)定性的方法較多:化學(xué) 修飾，物理固定，基因工程技術(shù)改造纖維素酶的一級(jí)序列等。基因工程技術(shù)改造纖維素酶的 一級(jí)序列是一種較為可行的方案，一級(jí)序列改造后耐鹽性能更好的酶具有更便利的利用方 式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種提高黑曲霉纖維素 外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性的方法，為將黑曲霉纖維素外切 酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID N0.3所示的序列。改造前，黑曲霉纖維素外切酶的氨 基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1、2所示。改造后的黑曲霉纖維素 外切酶與改造前相比，第311位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝彼?，其在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性 得到了提高。改造后的黑曲霉纖維素外切酶編碼基因的核苷酸序列優(yōu)選如SEQ ID N0.4所 不。
[0008] 一種生產(chǎn)黑曲霉纖維素外切酶的酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:將SEQ ID NO.4所示的黑曲霉纖維素外切酶編碼基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上，再用所構(gòu)建的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化酵母。所述的表達(dá)載體優(yōu)選為PPIC9K。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)，改變了纖維素外切酶的氨基酸序列，提高了纖維素外 切酶在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0011] 實(shí)施例中所用到的部分實(shí)驗(yàn)材料如下：限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒(Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)、T4 DNA Ligase購(gòu)自Takara;質(zhì)粒pPIC9K、SMD1168酵母、大腸桿 菌DH5a均為商業(yè)化產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒提取試劑盒(B518188)購(gòu)自上海生工。SEQ ID NO.5所示的合成序列1、SEQ ID NO.6所示合成序列2為全合成序列，實(shí)驗(yàn)室保藏;合成序列1 包含了酶切位點(diǎn)和改造前黑曲霉纖維素外切酶的編碼基因 （SEQ ID N0.2)序列，合成序列2 包含了酶切位點(diǎn)和改造后黑曲霉纖維素外切酶的編碼基因 （SEQ ID N0.4序列。
[0012] 實(shí)施例1 1、質(zhì)粒PPIC9K的提取 含有質(zhì)粒PPIC9K的大腸桿菌DH5a在含有氨芐青霉素 SOyg/mL的LB培養(yǎng)基中（50mL培養(yǎng) 基裝入150三角瓶中）37°C培養(yǎng)12h。用質(zhì)粒提取試劑盒(B518188)提取質(zhì)粒。提取步驟如下： (1)取0.5mL菌液，lOOOOrpm離心3min收集菌體，倒盡或吸干培養(yǎng)基。
[0013] (2)在菌體沉淀中加入700yL Lysis Buffer UF，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體，室 溫放置3min。
[0014] (3)將裂解液全部小心移入吸附柱，室溫放置lmin，8000rpm離心2min。倒掉收集管 中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
[0015] (4)向吸附柱中加入500yL Prewash Solution，8000rpm離心2min。倒掉收集管中 的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
[0016] (5)向吸附柱中加入500yL Wash Solution，8000rpm離心lmin。倒掉收集管中的液 體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
[0017] (6)重復(fù)向吸附柱中加入500yL Wash Solution，8000rpm離心lmin。倒掉收集管 中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。
[0018] (7)將吸附柱和收集管放入離心機(jī)，8000rpm離心2min。
[0019] (8)將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50yL Elution Buffer，室溫靜置2min，8000 rpm離心2min。將所得到的質(zhì)粒DNA溶液置于-20°C保存。
[0020] 2、質(zhì)粒PPIC9K及SEQ ID從).5所示合成序列1的酶切 質(zhì)粒PPIC9K用EcoRI和No?酶切，酶切為加入質(zhì)粒25nL，加入兩種限制性內(nèi)切酶EcoRI 和Notl酶切酶各0.2仙，加入酶切緩沖液及ddH20 24.6仙，在30°C保溫60min，加入5nL Loading Buffer，60°C保溫 1 Omin，得到質(zhì)粒pPIC9K酶切液。
[0021] 合成序列1 25tiL，加入酶切緩沖液及ddH20 24.6UL，加入兩種限制性內(nèi)切酶EcoRI 和Notl 內(nèi)切酶各0 · 2yL，在30°C保溫60min，加入5yL Loading Buffer，60°C保溫10min，得到 合成序列1酶切液。
[0022] 質(zhì)粒PPIC9K和合成序列1分別酶切后，各自取酶切液進(jìn)行電泳。
[0023] 3、酶切液電泳 (1)電泳試劑配制 1 )5 X TBE(tris-硼酸及EDTA)緩沖液的配制（lOOOmL) : Tris 54g，硼酸27 · 5g，0 · 5mol/L EDTA 20mL，將pH調(diào)到8.0，定容至lOOOmLjt：冰箱保存，用時(shí)稀釋5倍。
[0024] 2)加樣緩沖液的配制:0.25%溴酚藍(lán)，40%(W/V)蔗糖水溶液，4°C冰箱保存。
[0025] 3)溴化乙錠的配制：稱取0. lg溴化乙錠，溶于10mL水，配成終濃度為10mg/mL的母 液，4°C冰箱保存。染色時(shí)，吸取12.5yL的母液，加入250mL的水中，使其終濃度為0.5yg/mL， 混合均勻。
[0026] 4H00XTE緩沖液的配制：lmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100mmol/L EDTA。稱取Tris 121. lg，EDTA-Na 237.23g，先用800mL雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調(diào)pH至8.0(大約 加入鹽酸20mL)，然后定容至lOOOmL。
[0027] 5) 100 X 電泳緩沖液的配制:4mol/L Tris-HCl(pH8 · 0)，2mol/L醋酸鈉，200mmol/L EDTA。稱取Tri s 242.2g，無(wú)水乙酸鈉82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL雙蒸水加熱攪拌 溶解后，再用冰乙酸調(diào)pH至8.0(大約加入冰乙酸50mL)，然后定容至500mL。用時(shí)稀釋100倍。 [0028] (2)電泳方法 1)安裝電泳槽:將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在 水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳。
[0029] 2)1%瓊脂糖凝膠的制備:稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，置微波爐或沸水浴中 加熱至完全溶化，取出搖勻。
[0030] 3)灌膠:將冷卻到60°C的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。
[0031] 4)待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。
[0032] 5)加樣:將DNA樣品與加樣緩沖液按體積比4:1混勻后，用微量移液器將混合液加 到樣品槽中，每槽加2〇yL，記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量。
[0033] 6)電泳:安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開電源，調(diào)電壓至 3-5V/cm，電泳l-3hr，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿l-2cm時(shí)，停止電泳。
[0034] 7)染色和觀察:取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm 的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶。
[0035] 4、酶切片段的回收和純化 使用Takara的膠回收試劑盒回收純化酶切的DNA片段。在紫外燈下切出含有目的DNA的 瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。
[0036] 稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。向膠塊中加入膠塊溶解液Buffer GM，Buffer GM的 加量3凝膠體積。均勻混合后室溫25°C溶解膠塊10min。當(dāng)凝膠完全溶解后，加入3M醋酸鈉溶 液(pH5.2) 10yL，均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。將試劑盒中的Spin Column安置于Col lection Tube上。0.2mL膠溶解液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。將700yL的 Buffer W3加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。再次將700yL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。將Spin Column安置于 Collection Tube上，室溫12000rpm離心lmin。將Spin Column安置于新的1 ·5mL的離心管 上，在Spin Column膜的中央處加入30yL滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。室 溫 12000rpm 離心 lmin 洗脫 DNA。
[0037] 5、連接與轉(zhuǎn)化 連接體系為:酶切回收的合成序列1 7燦，酶切回收的PPIC9K質(zhì)粒ltiL，T4 DNA ligase lyL，Buffer如匕4°(：連接24小時(shí)。
[0038]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測(cè) 序鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為PPIC9K-1。
[0039] 6、酵母菌感受態(tài)制備 (1)從平板上或保種管中，挑少許SMD1168酵母，在YPDA平板(YPDA培養(yǎng)基：胰蛋白胨 20g/L，酵母浸膏10g/L，瓊脂20g/L(固體），腺嘌呤15mL/L 0 · 2%腺嘌呤，調(diào)節(jié)pH=7 · 5，121°C 滅菌15min)上劃單克隆，30°C培養(yǎng)3天左右。
[0040] (2)從平板上分別挑取單克隆(直徑2-3mm)到含有3mL YPDA的玻璃試管中（平行做 3管)。
[0041 ] (3 ) 30 °C、50rpm培養(yǎng)8-12h。取200UL菌液，測(cè)0D_。選取0D_值最大的一個(gè)試管（即 活力最高的一個(gè)），吸取5tiL轉(zhuǎn)移至50mL新鮮的YPDA培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基裝在250mL三角瓶中）。 [0042] (4) 30 Γ、230rpm培養(yǎng) 16-20h，直至0D6qq=0 · 15-0 · 3。
[0043] (5)將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)入2個(gè)50mL離心管，室溫3000g離心3min，棄上清，用100mL新 鮮的YPDA懸起管底的菌體，并倒入干凈的三角瓶中。30 °C、230rpm培養(yǎng)直到0D6Q()=0.4-0.5 (3-5小時(shí)）。 (6) 將菌液倒入2個(gè)50mL離心管，室溫3000g離心3min，棄上清，每個(gè)離心管用30mL mi 1 ipore7jC 重懸。 (7) 再次3000g離心3min，棄上清，每管用1.4mL 1.1 XTE/LiAc重懸。
[0044] (8)將重懸的菌液轉(zhuǎn)移到2個(gè)EP管中，12000rpm離心15s。
[0045] (9)棄上清，每管用600μL l.IXTE/LiAc重懸，將兩管重懸菌液并入一管，得到酵 母感受態(tài)細(xì)胞。
[0046] 7、質(zhì)粒pPIC9K-l轉(zhuǎn)化酵母菌 質(zhì)粒PPIC9K-1用SacI線性化，往25uL pPIC9K-l中加入限制性內(nèi)切酶SacI酶0.2燦、酶 切緩沖液及ddH2〇 24.8yL，在30°C保溫60min，加入5yL Loading Buffer，60°C保溫lOmin， 得到PPIC9K-1酶切液。pPIC9K-l酶切液通過(guò)電泳回收純化得到線性化的pPIC9K-l質(zhì)粒。 [0047] 往離心管中加入線性化的pPIC9K-l質(zhì)粒lOyL、鮭魚精DNA(變性的，10mg/mL)5yL， 加入酵母感受態(tài)細(xì)胞5〇uL，輕彈混勻；加入500UL PEG/LiAc輕彈混勻。30°C水浴30min，每 10-15min輕彈混勻；加入20yL DMS0,輕彈混勻；42°C水浴15min，每5-10min輕彈混勻； 12000rpm離心0.5min，棄上清；用 lmL液體PDA培養(yǎng)基重懸；30 °C、200rpm培養(yǎng)90min; 12000r/ m離心0 · 5min，棄上清;加入液體Η)Α培養(yǎng)基(含有0 · 9% NaCl)重懸，涂布含氨芐青霉素50此/ mL的PDA平板。
[0048] 8、篩選 在含氨芐青霉素 SOyg/mL的TOA平板上篩選轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子，接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基(產(chǎn) 酶培養(yǎng)基為含葡萄糖8g/L、甲醇3g/L的YPDA培養(yǎng)基）。
[0049] 250mL三角瓶中裝入產(chǎn)酶培養(yǎng)基50mL，30°C、50rpm培養(yǎng)12h得到發(fā)酵醪液，測(cè)定發(fā) 酵醪液中纖維素外切酶的酶活，酶活為0. 〇〇5U/mL。
[0050]纖維素外切酶酶活測(cè)定方法為:取2g微晶纖維素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸 鈉緩沖液(PH4.8)中，加入發(fā)酵醪液0.5mL，50°C水浴30min，DNS法[見文獻(xiàn)，甄靜，王繼雯， 謝寶恩，等.一株纖維素降解真菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析[J].微生物學(xué)通報(bào)， 2011，38(5): 709-714.]測(cè)定生成還原糖的量。酶活定義:每分鐘水解微晶纖維素生成ΙμΜ 還原糖所需酶的量為ιυ。
[0051 ] 9、纖維素外切酶在高鹽溶液中的熱穩(wěn)定性 取2g微晶纖維素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中，加入NaCl，NaCl 最終濃度為8%(w/w)，加入上述步驟8中的發(fā)酵醪液0.5mL，測(cè)定酶活，酶活記為A，A= 0.0052U/mL〇
[0052] 取2g微晶纖維素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8)中，加入NaCl， NaCl最終濃度為8%(w/w)，加入上述步驟8中的發(fā)酵醪液0.5mL，52°C水浴45min后再測(cè)定酶 活，酶活記為 B，B=0.004628U/mL。
[0053] 熱穩(wěn)定性用B/A表示，值越大，熱穩(wěn)定性越好，測(cè)定B/A=89%。
[0054] 實(shí)施例2 具體操作同實(shí)施例1，區(qū)別是將SEQ ID N0.5所示合成序列1換成SEQ ID N0.6所示合成 序列2。最后篩選到的轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子在產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的發(fā)酵醪液的酶活為 0.0051 U/mL;其在高鹽溶液中的酶活A(yù)為0.0053 U/mL，酶活B為0.005194 U/mL，穩(wěn)定性B/A =98%。結(jié)果表明定向改造后的SEQ ID N0.4所示序列表達(dá)的纖維素外切酶在高鹽溶液中的 熱穩(wěn)定性得到提尚。
[0055] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高黑曲霉纖維素外切酶在高鹽溶液中熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于:所述的 方法為將黑曲霉纖維素外切酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID NO.3所示的序列。2. -種改造后的黑曲霉纖維素外切酶，其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。3. 編碼權(quán)利要求2所述的黑曲霉纖維素外切酶的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示。4. 一種生產(chǎn)黑曲霉纖維素外切酶的酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于:包括如下步驟： 將權(quán)利要求3所述的基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上，再用所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述的表達(dá)載體為pPIC9K。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK105969753SQ201610559620
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】薛棟升, 梁龍?jiān)?
【申請(qǐng)人】湖北工業(yè)大學(xué)