一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制備方法，包括以下兩種方法中的任意一種：方法一：將菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔陰離子樹脂為載體，在10～45℃，pH4.0～6.0條件下吸附并冷卻后，以終濃度為0.1％～0.5％的戊二醛溶液為交聯(lián)劑在2～25℃條件下交聯(lián)后洗滌干燥得固定化酶；方法二：將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸鈉溶液中混勻制成混合溶液，將混合溶液滴入氯化鈣溶液中，靜置固定后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。本發(fā)明所述的技術(shù)方案制備的固定化酶酶回收利用率，操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性均顯著提高，因而其制備的固定化酶在實際工業(yè)應(yīng)用中具有較好的潛力。
【專利說明】
一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于酶固定化領(lǐng)域，具體涉及一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]果聚糖水解酶是指能夠催化果聚糖降解的一類酶。根據(jù)其水解底物方式和位點(diǎn)的不同大致可以分為兩類:果聚糖外切水解酶(fructan exohydrolase)和果聚糖內(nèi)切水解酶 (endo-1nulinlase)。研究認(rèn)為，植物體中參與果聚糖降解的水解酶是果聚糖外切水解酶果聚糖外切水解酶是植物體中降解果聚糖的主要酶類，它主要是通過水解末端的果糖基生成 1個果糖來實現(xiàn)降解的，最終形成產(chǎn)物是果糖和蔗糖，在轉(zhuǎn)化酶催化作用下，蔗糖分子能夠被進(jìn)一步水解。目前為止，4種類型的FEH已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并被報道:果聚糖6-外切水解酶，果聚糖1-外切水解酶，果聚糖6&1外切水解酶和6-蔗果三糖外切酶。它們的分類主要是通過糖苷鍵的不同來劃分的。研究發(fā)現(xiàn)，果聚糖外切水解酶已經(jīng)在菊芋黑麥草、燕麥、牛蒡、大蒜等植物中發(fā)現(xiàn)，并且其中一些植物的FEH基因已被克隆并得到了驗證。
[0003]有關(guān)果聚糖水解酶的研究大概起始于九十年代，有關(guān)果聚糖水解酶的介紹國內(nèi)外均有報道。1991年，Richard等從黑麥草葉片中提取出FEH，研究認(rèn)為它具有水解果聚糖的能力，純化后的FEH，E當(dāng)蔗糖濃度為10mM時，其酶活會受到抑制。1993年，Richard等研究了草類植物中的果聚糖水解酶，研究認(rèn)為，代謝濃度、蔗糖等體外抑制劑會對大麥草中的果聚糖水解酶的酶活具有影響。同時他還認(rèn)為，外水解酶在低等植物體中是沒有的，它只存在與高等植物體中。1999年，Joke De Roove從菊苣根中分離出果聚糖水解酶，通過純化后，果聚糖水解酶分子量的大小為60kDa，最適溫度35°C，最適pH范圍在5.0-5.5之間。他認(rèn)為，蔗糖、四乙酸二乙胺(EDTA)對果聚糖水解酶具有抑制作用。然而，Van等從小麥中分離純化的6-FEH， 蔗糖對其酶活并沒有產(chǎn)生抑制作用。
[0004]近年來，我國也對果聚糖水解酶進(jìn)行了研究。王靜等通過對Aspergillus ficuum 菊粉酶系進(jìn)行了研究，通過分離純化和鑒定獲得了 5個菊粉酶:3個外切菊粉酶(分別命名為 Ex〇-1、Ex〇-n、Ex〇-m)和2個內(nèi)切菊粉酶(分別命名為End〇-1、End〇-n )，并對它們的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。黃雪松等對大蒜果聚糖酶進(jìn)行了研究，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，研究認(rèn)為大蒜果聚糖酶屬于外切酶。許歡歡等從菊芋中克隆得到了 2個果聚糖外切水解酶基因， 分別命名為Htl-FEHI和Htl-FHin，然后轉(zhuǎn)入酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生重組酶蛋白 Htl-FEHI和Htl-FEHII。果聚糖外切水解酶(FEHtl-FEHII)是從菊芋中克隆分子量大小約為65.lkDa。它不僅在植物體中對果聚糖具有很強(qiáng)的水解能力，同時在植物的滲透調(diào)節(jié)過程中也有很重要的作用。
[0005]果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII )在植物中主要負(fù)責(zé)果聚糖的降解，參與植物體內(nèi)過果聚糖的動員和分配，果聚糖外切水解酶在菊苣、菊芋、小麥、大蒜等植物體中被發(fā)現(xiàn)并被報道，而關(guān)于果聚糖外切水解酶的應(yīng)用目前還比較少。
[0006]果聚糖外切水解酶(Htl-FHin )的酶學(xué)性質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，單純的Htl-FHin和大多數(shù)游離酶一樣，穩(wěn)定性差、易失活，不能夠重復(fù)利用。因此研究果聚糖外切水解酶(Htl-FEH II)的固定化技術(shù)提高Htl-FEHII的酶學(xué)性能是被領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶。
[0008]本發(fā)明的另一種方法在于提供一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法。
[0009]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]—種固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，它包括以下兩種方法中的任意一種:
[0011]方法一:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔陰離子樹脂為載體，在10?45 °C，pH4.0?6.0條件下吸附并冷卻后，以終濃度為0.1 %?0.5%的戊二醛溶液為交聯(lián)劑在2 ?25°C條件下交聯(lián)后洗滌干燥得固定化酶；
[0012]方法二:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸鈉溶液中混勻制成混合溶液，將混合溶液滴入氯化鈣溶液中，靜置固定后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。
[0013]上述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，優(yōu)選為:[〇〇14] 方法一的詳細(xì)步驟為:稱取預(yù)處理好的D201大孔陰離子樹脂，加入pH4.0?6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，在10?45 °C條件下吸附并冷卻后，加入終濃度為〇.1 %?〇.5 %的戊二醛溶液，2?25 °C交聯(lián)后洗滌并干燥得固定化酶；
[0015]方法二的詳細(xì)步驟為:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到濃度為0.5%?3 %的海藻酸鈉溶液中混合均勻制成混合溶液，將混合溶液滴入濃度為1 %?4%的氯化鈣溶液中，靜置固定〇.5?2.5h后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。
[0016]上述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，進(jìn)一步優(yōu)選為:
[0017]方法一中所述吸附的溫度為20?40°C，pH值為4.5?5.0，時間為0.5?6h;所述戊二醛溶液的終濃度為0.1 %?0.25%，所述交聯(lián)的溫度為2?15°C，時間為0.5?8h;
[0018]方法二中所述海藻酸鈉溶液的濃度為0.5%?2.5%，所述氯化鈣溶液的濃度為 1%?2%，所述靜置固定的時間為0.5?2。
[0019]上述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，作為一種最優(yōu)選技術(shù)方案:
[0020]所述的方法一為:稱取預(yù)處理好的D201大孔陰離子樹脂加入pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，40°C吸附3小時，迅速冷卻后，加入戊二醛溶液， 使其終濃度為0.125%，10°C交聯(lián)2小時后，用蒸餾水洗滌干燥后放在4°C冰箱中備用;處理過程中，菊芋果聚糖外切水解酶酶液的添加量為每lg樹脂中加入0.3?lml部分純化酶液； 最佳為每lg樹脂中加入〇.5ml部分純化酶液。
[0021]所述的方法二為:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到濃度為2%的海藻酸鈉溶液中混合均勻制成混合溶液，將混合溶液滴入濃度為1.5%的氯化鈣溶液中，靜置固定2h 后，過濾并將濾餅用蒸餾水洗滌干燥得固定化酶。
[0022]上述的方法所制備的固定化菊芋果聚糖外切水解酶。
[0023]本研究采用兩種方法對菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)進(jìn)行固定化:[〇〇24] 一、以D201大孔陰離子樹脂為載體，戊二醛溶液為交聯(lián)劑，采用吸附交聯(lián)法對菊芋果聚糖外切水解酶(Ht 1 -FEHII)進(jìn)行固定化:二、以海藻酸鈉為載體，采用包埋法對Ht 1-FEHn進(jìn)行固定化。確定了這兩種方法制備固定化酶Ht1-FEHn的最適制備條件，并對游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。同時，通過對吸附交聯(lián)法和包埋法制備的固定化酶進(jìn)行了比較，確定了吸附交聯(lián)法制備的固定化酶要比包埋法制備的固定化酶效果更為理想，在工業(yè)應(yīng)用中更有使用價值。[〇〇25] 主要研究結(jié)果如下:[〇〇26]1.采用D201大孔陰離子樹脂為載體，戊二醛為交聯(lián)劑對菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)進(jìn)行固定化，對其固定化條件進(jìn)行探索與優(yōu)化，確定了固定化酶的最佳制備條件:稱取已處理好的樹脂0.2g，然后加入pH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和0.lml的部分純化酶液(3.40mg/ml)，放置在搖床上40°C吸附3小時，迅速冷卻后，加入戊二醛溶液，使其終濃度為0.125% (v/v)，10°C交聯(lián)2小時后，用蒸餾水洗滌后放在4°C冰箱中備用。通過此條件制備的固定化酶，酶活回收率能夠達(dá)到73.53 %。[〇〇27]按照固定化酶制備條件制備固定化酶，并對其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析:固定化酶的最適反應(yīng)溫度為40 °C，比游離酶提高了 5 °C。最適pH為6.5，與游離酶相較，pH值向右移動了 0.5個單位，固定化酶熱穩(wěn)定性與游離酶相比，并沒有提高。[〇〇28]2.通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，采用海藻酸鈉包埋法固定化重組酶Htl-FEHII的最適條件如下:海藻酸鈉溶液為2 % (質(zhì)量體積比mg/ml，即每100ml溶液中含2mg的海藻酸鈉)，氯化鈣溶液濃度為1.5% (質(zhì)量體積比mg/ml)，加酶量為0.3ml，固定化時間為2小時時，其固定化效果最好。采用海藻酸鈉法在最適固定化條件下制備的固定化酶的回收率為53.60%。
[0029]3.在海藻酸鈉包埋法最適條件確定后制備固定化酶，并對游離酶和海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶進(jìn)行了分析比較。研究發(fā)現(xiàn)，游離酶的最適反應(yīng)溫度為35°C，經(jīng)固定化后，固定化酶的最適反應(yīng)溫度仍為35°C ;游離酶的最適pH值為6.0，經(jīng)固定化后，最適pH值為 7.0,比游離酶向右偏移了 1個單位。采用海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定并沒有提高，這可能與菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)本身熱穩(wěn)定性不穩(wěn)定有關(guān)。
[0030]4.通過對陰離子交換樹脂吸附交聯(lián)法和海藻酸鈉包埋法制備的菊芋果聚糖外切水解酶(
[0031]Ht 1 -fEH n )比較發(fā)現(xiàn):采用吸附交聯(lián)法制備的菊芋果聚糖外切水解酶(Ht 1-FEH n)。酶回收利用率，操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性均比包埋法制備的固定化酶要高，因而其制備的固定化酶在實際工業(yè)應(yīng)用中具有較好的潛力。[〇〇32]本發(fā)明的有益效果:[〇〇33]本發(fā)明所述的技術(shù)方案制備的固定化酶酶回收利用率，操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性均顯著提高，因而其制備的固定化酶在實際工業(yè)應(yīng)用中具有較好的潛力?！靖綀D說明】
[0034]圖1為吸附交聯(lián)法制備固定化酶的條件選擇與優(yōu)化
[0035]其中，A為不同吸附溫度條件下固定化酶的相對酶活;B為不同pH值條件下固定化酶的相對酶活;C為不同吸附時間固定化酶的相對酶活;D為不同戊二醛濃度下固定化酶的相對酶活;E為不同交聯(lián)溫度下固定化酶的相對酶活;F為不同交聯(lián)時間固定化酶的相對酶活;G為不同加酶量條件下固定化酶的相對酶活和回收利用率
[0036]圖2為吸附交聯(lián)法制備的固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
[0037]其中，A為不同pH條件下固定化酶和游離酶的相對酶活;B為不同溫度對固定化酶酶活的影響;C為固定化酶和游離酶放在不同的溫度條件的相對酶活;D為固定化酶的操作穩(wěn)定性;E為固定化酶和游離酶的藏穩(wěn)定性
[0038]圖3為包埋法制備固定化酶的條件選擇與優(yōu)化
[0039]其中，A為不同濃度海藻酸鈉溶液對固定化酶活性的影響;B為不同固定化時間對固定化酶活性的影響;C為不同氯化鈣濃度對固定化酶活性的影響;D為不同加酶量條件下的固定化酶的酶活和回收率
[0040]圖4為包埋法制備的固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
[0041]其中，A為不同溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)游離酶和固定化酶的相對酶活;B為不同的pH 值條件下固定化酶和游離酶的相對酶活;C為不同溫度條件下游離酶和固定化酶酶活;D為固定化酶的操作穩(wěn)定性;E為固定化酶的和游離酶的貯藏穩(wěn)定性【具體實施方式】
[0042]實施例1菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII )的吸附交聯(lián)法固定化[〇〇43]1.1材料與方法
[0044]1.1.1實驗材料[〇〇45]菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)是由菊芋中克隆得到基因Htl-FHin，然后轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行異源表達(dá)，以甲醇為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其產(chǎn)生而得到的重組蛋白。其分子量大小為90kDa，其制備方法采用現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開的技術(shù)方案(許歡歡.菊芋果聚糖外切水解酶1 _外切水解酶基因(Ht 1 -FEHs)的克隆、鑒定及表達(dá)模式的研究[D]南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015)。 [〇〇46]D201大孔陰離子交換樹脂購于河北華眾有限公司[〇〇47]1.1.2酶液制備與部分純化
[0048]重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)—粗酶液酶活測定—硫酸銨沉淀濃縮粗酶液—透析。具體操作步驟參考文獻(xiàn)[許歡歡.菊芋果聚糖外切水解酶1-外切水解酶基因(Htl-FEHs)的克隆、鑒定及表達(dá)模式的研究[D]南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015)]。
[0049]1.1.3樹脂預(yù)處理
[0050]剛購買的新樹脂中可能會含有一些雜質(zhì)或者未完全反應(yīng)的烴類、防腐劑等，這些物質(zhì)不僅可能會有毒性，也有可能隨溶液進(jìn)入離子交換樹脂孔徑之中，進(jìn)而影響離子交換樹脂的功能。因此，新購買的樹脂在使用之前必須進(jìn)行預(yù)處理。具體操作方法如下:首先將樹脂用大體積的蒸餾水洗滌多次并將破碎樹脂挑出，用2%的氫氧化鈉溶液(質(zhì)量體積比 mg/ml，即每100ml氫氧化鈉溶液中含2mg氫氧化鈉)浸泡24個小時，然后用蒸餾水洗滌至中性后用5 % (v/v)的鹽酸溶液浸泡24小時，再用蒸餾水洗滌至中性，放置冰箱中備用。[〇〇5111.2酶活力測定[〇〇52]1.2.1固定化酶和游離酶酶活力測定[0〇53]單位酶活:1ml酶液在35°C，pH5.5條件下，每分鐘分解1-Kestose生成1_〇1果糖的酶量。[〇〇54]游離酶活力測定方法:取0.2% (質(zhì)量體積比mg/ml，即每100ml 1-Kestose溶液中含0 ? 2mg 1-Kestose)的1-Kestose溶液0 ? 9ml為底物(pH5 ? 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)，加入0.lml的菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHn )部分純化酶液35°C反應(yīng)3.5小時后，沸水浴 5min終止反應(yīng)，快速冷卻后用DNS法測定酶活。
[0055]固定化酶酶活力測定方法:測定方法同游離菊芋果聚糖外切水解酶方法一致。按實驗需要稱取一定量的固定化酶，加入底物，反應(yīng)3.5小時，取出反應(yīng)液，沸水浴5min，迅速冷卻后，測定酶活。
[0056]1.2.2相對酶活[〇〇57] 相對酶活是指在同一組試驗中，以測得的最高的一組酶活為100%，其它幾組酶活與之相比，結(jié)果以百分之百來表示。[〇〇58]1.2.3酶活回收利用率結(jié)果表達(dá)
[0059]酶活回收率=固定化酶酶活/加入總酶活X 100%
[0060]1.2.4蛋白含量測定[〇〇611 將部分純化酶液適當(dāng)稀釋后，采用BCA蛋白分析試劑盒(AURAGENE，POO 1B-1)測定其蛋白含量。經(jīng)測定后，所得部分純化酶液的濃度為3.40mg/ml。[0〇62]1.3固定化酶制備條件選擇與優(yōu)化[〇〇63]1.3.1吸附溫度[〇〇64] 稱取0.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后加入pH5.5 (0.05M/L)的醋酸-醋酸鈉緩沖液和〇.lml的1.1.2步驟制備的部分純化酶液(3.40mg/ml)，分別放在放置搖床上在10°C，20°C，30°C，40°C，50°C和60°C條件下吸附3小時，冷卻后，加入戊二醛溶液使其終濃度為0.5% (體積百分含量)中，5°C交聯(lián)4小時后用蒸餾水洗滌，稍微干燥后測定并計算固定化酶相對酶活。結(jié)果如圖1A所示。
[0065]測定結(jié)果表明，固定化酶在0?40°C范圍內(nèi)，相對酶活隨著吸附溫度的升高而升高，當(dāng)吸附溫度超過40°C時，固定化酶的酶活急劇下降。這可能是因為菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHin)本身熱穩(wěn)定性比較差有關(guān)，當(dāng)溫度超過一定范圍后，酶活喪失，從而造成固定化酶酶活急劇下降。
[0066]1.3.2pH[〇〇67]稱取0.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后分別加入pH4.0、4.5、5.0、 5.5、6.0(0.05M/L)的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.lml的1.1.2步驟制備的部分純化酶液，放置搖床上40°C吸附3小時，冰上冷卻后，加入戊二醛溶液使其終濃度為0.5% (體積百分含量)，5°C交聯(lián)4小時后用蒸餾水洗滌2至3次，稍微干燥后測定并計算固定化酶相對酶活。結(jié)果如圖1B所示。
[0068]由圖可以看出，固定化酶相對酶活在pH4.5時，固定化酶的酶活最高，若低于或高于4.5時，固定化酶的酶活均會呈現(xiàn)逐漸或快速下降趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象主要是因為pH值的改變能夠直接引起固定化酶微環(huán)境或者載體與酶分子之間作用力的改變，因而，pH值過高或過低都會造成酶蛋白活力下降。
[0069]1.3.3吸附時間[〇〇7〇]稱取〇.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后分別加入pH 4.5(0.05M/L) 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.lml部分純化酶液，放置搖床上40°C分別吸附0.5、1.5、3、4.5、6 個小時，冷卻后，加入戊二醛溶液使其終濃度為0.5% (體積百分含量)，5°C交聯(lián)4小時后用蒸餾水洗滌，稍微干燥后測定并計算固定化酶相對酶活。結(jié)果如圖1C所示。[0071 ]由圖中可以可出，當(dāng)吸附時間為0.5?3小時之間時，菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)固定化酶酶活隨著時間的增加而上升，吸附3小時，固定化酶的酶活達(dá)到最高值。若吸附時間超過3小時，隨著時間的延長，固定化酶酶活不再增加，甚至有所下降。之所以產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因為:一、吸附時間太短，游離酶不能被載體完全吸附，可能會使部分游離酶仍然停留在溶液中，因而造成相對酶活較低。二，吸附時間過長，固定化酶長時間在暴露在外界環(huán)境中會造成其酶活下降。綜上所述，選擇3小時的吸附時間為最佳操作條件用于下一步固定化酶的制備。[〇〇72]1.3.4戊二醛濃度[〇〇73]稱取0.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后分別加入pH 4.5(0.05M/L) 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.lml 1.1.2步驟制備的部分純化酶液(3.40mg/ml)，放置搖床上 40 °C吸附3個小時，冷卻后，分別加入戊二醛溶液，使其終濃度(v/v)為0 %、0.125 %、 0.25 %、0.5 %和1 %，5°C交聯(lián)4小時后用蒸餾水洗滌，稍微干燥后測定并計算固定化酶相對酶活。結(jié)果如圖1D所示。
[0074]戊二醛是一種雙功能試劑，既能夠促使酶交聯(lián)，又能夠使酶變性。如果戊二醛濃度過低，游離酶不能與載體緊密結(jié)合，酶易從載體上脫落。戊二醛溶液濃度過高，會加速交聯(lián)反應(yīng)，其反應(yīng)較為劇烈，在交聯(lián)過程中會使酶蛋白大量失活。由圖中可以看出，固定化菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII )酶活在一定的戊二醛濃度范圍內(nèi)，隨著戊二醛溶液濃度的增加，其酶活逐漸增加。戊二醛終濃度在〇?〇.125%時，固定化酶的酶活隨著戊二醛濃度的增加而增加，當(dāng)戊二醛終濃度為0.125%時，固定化酶的酶活達(dá)到最大值。當(dāng)戊二醛終濃度超過0.125%時，交聯(lián)反應(yīng)較為劇烈，超過了菊芋果聚糖外切水解酶的耐受范圍，因而隨著戊二醛溶液濃度的增加，酶活開始逐漸下降。
[0075]1.3.5交聯(lián)溫度[〇〇76]稱取0.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后分別加入pH 4.5(0.05M/L) 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.lml的部分純化酶液(3.40mg/ml)，放置在搖床上40°C吸附3個小時，在冰上冷卻后，分別加入戊二醛溶液，使其終濃度為0.125 %，分別在2°C、5 °C、10°C、15 °C、25 °C和35 °C條件下靜置交聯(lián)4小時，然后用蒸餾水洗滌，稍微干燥后測定并計算固定化酶相對酶活，每組設(shè)三個平行。結(jié)果如圖1E所示。[〇〇77]由圖中可以看出，當(dāng)交聯(lián)溫度低于1〇 °c時，固定化酶Ht1-raH n的酶活隨著溫度的逐漸升高而增加。交聯(lián)溫度為10°c時，固定化酶酶活達(dá)到最高值。交聯(lián)溫度超過10°C，固定化酶酶活急劇下降。這可能是因為，交聯(lián)溫度過高或過低都影響交聯(lián)劑的功能，進(jìn)而影響固定化酶的交聯(lián)效果。因而，選擇交聯(lián)溫度10°c用于下一步固定化酶的制備。
[0078]1.3.6交聯(lián)時間[〇〇79]稱取0.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后分別加入pH 4.5(0.05M/L) 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.lml的部分純化酶液，放置搖床上40°C吸附3個小時，冷卻后，加入戊二醛溶液使其終濃度為0.125%，10°C分別靜置交聯(lián)0.5、1、2、4、6、8小時后用蒸餾水洗并干燥，然后計算固定化酶相對酶活。結(jié)果如圖1F所示。
[0080]由圖中可以看出，當(dāng)交聯(lián)時間為2小時時，固定化酶Ht 1-FEHII的酶活最高。在一定時間范圍內(nèi)，固定化酶的酶活隨著時間的增加而增加。交聯(lián)時間過短或過長，固定化酶Htl-FEHII酶活都會受到影響，交聯(lián)時間過短，酶與載體之間結(jié)合力較弱，在洗滌和操作過程中，酶較容易從陰離子樹脂載體上脫落，從而導(dǎo)致固定化酶的酶活較低。交聯(lián)時間過長，固定化酶的酶活也會下降，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的固定化載體與酶的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量有限，隨著交聯(lián)時間的增加酶與載體的結(jié)合位點(diǎn)逐漸趨于飽和，很可能部分Htl-FEHII酶的活性中心被遮掩， 不能夠充分催化底物。
[0081]1.3.7加酶量[〇〇82]稱取0.2g預(yù)處理好的D201大孔陰離子交換樹脂，然后分別加入pH 4.5(0.05M/L) 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.025ml，0.05ml，0.lml，0.2ml，0.4ml (濃度單位為3.40mg/ml)的部分純化酶液，放置搖床上40 °C吸附3個小時，冷卻后，加入戊二醛溶液，使其終濃度為 0.125%，10°C分別靜置交聯(lián)2小時后用蒸餾水洗并干燥，然后計算固定化酶相對酶活。結(jié)果如圖1G所示。
[0083]—般而言，固定化酶活在一定范圍內(nèi)會隨著加酶量的增加而增加，當(dāng)超過一定范圍時，隨著載體結(jié)合位點(diǎn)接近飽和，相對酶活不再升高，甚至?xí)驗榧用噶窟^多一方面使空間位阻效應(yīng)加大，從而造成酶蛋白活降低:另一方面，加酶量過多，致使樹脂內(nèi)部的孔徑被堵塞，其余的游離酶只能吸附在樹脂表面，致使底物只能與樹脂表面的酶蛋白發(fā)生反應(yīng)，因而固定化酶酶活不再隨著加酶量的增加而上升。[〇〇84]由上圖可以看出，當(dāng)加酶量小于0.lml時，固定化酶Ht 1 -FEHII酶活和回收利用率隨著加酶量的增多而快速增加，當(dāng)加酶量繼續(xù)增加到〇.2ml時，此時固定化酶酶活雖然達(dá)到最大值，但在此范圍內(nèi)，酶活增長速度較慢，當(dāng)加酶量為〇.2ml時，相對酶活雖然達(dá)到最大值，超過此范圍，固定化酶酶活不再增加，且固定化酶回收率開始降低，容易造成酶的浪費(fèi)， 增加生產(chǎn)成本。因此選用0.1ml的加酶量制備的固定化酶并對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。[〇〇85]1.4固定化酶酶學(xué)性質(zhì)
[0086]按上述最佳固定化酶制備參數(shù)條件制備固定化酶，對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，并與游離酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較。
[0087]1.4.1最適 pH
[0088]按照固定化酶制備的最佳條件制定固定化酶，分別將游離酶和固定化酶加入到不同pH(5,5.5，6,6.5,7)的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，并測定固定化酶和游離酶的相對酶活，每組三個重復(fù)，結(jié)果如圖2A所示。[〇〇89]由上圖可知，游離酶的最適反應(yīng)pH為6.0,菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)經(jīng)固定化后，最適pH為6.5。較游離酶而言，向右移動了 0.5個單位左右。當(dāng)選擇陰離子材料為載體時，固定化酶的pH值往往會向堿性方向移動，若選用陽離子材料作為固定化酶的在提示，固定化酶的PH值則會向酸性方向移動。
[0090]1.4.2最適溫度[〇〇91]根據(jù)固定化酶的最佳制備條件制備固定化酶和游離酶，加入底物后放在不同的溫度(25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，50°C)條件下反應(yīng)，然后測定其相對酶活，測定結(jié)果如圖2B 所示。[〇〇92]由測定結(jié)果可以看出，游離酶的最適反應(yīng)溫度在30?35°C范圍內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)溫度為 35°C時，固定化酶的酶活最高，因而游離酶的最適反應(yīng)溫度為35攝氏度。蛋白酶經(jīng)固定化后，其最適反應(yīng)溫度大致在40?45°C范圍內(nèi)，當(dāng)溫度為40°C時，相對酶活最高。與游離酶相較而言，固定化酶的最適反應(yīng)溫度比游離酶的最適反應(yīng)溫度增加了5°C左右。
[0093] 1.4.3熱穩(wěn)定性[〇〇94] 將制備好的固定化酶和游離酶放在不同的溫度條件(40°C，50°C，60°C，70°C，80 °C)下熱處理半小時后，迅速冷卻至4?5 °C左右，分別測定固定化酶和游離酶酶活，并計算其相對酶活。結(jié)果如圖2C所示。[〇〇95]結(jié)果表明，游離酶和固定化酶隨著熱處理溫度的升高，相對酶活呈下降趨勢，當(dāng)熱處理溫度大于50°C時，游離酶和固定化酶的相對酶活迅速下降，當(dāng)熱處理溫度大于60°C時， 游離酶和固定化酶酶活很低，甚至沒有酶活。因而，經(jīng)固定化后，該蛋白酶的熱穩(wěn)定性并未有所提尚，這可能與該蛋白酶本身熱穩(wěn)定性好壞有關(guān)。[〇〇96] 1.4.4操作穩(wěn)定性
[0097]操作穩(wěn)定性是衡量固定化酶穩(wěn)定性及能否在實際應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)之一，因而，測定固定化酶的操作穩(wěn)定性是非常必要的。將制備好的固定化酶，在所有條件一樣的情況下連續(xù)使用6次，測定固定化酶每次使用酶活，以第一次使用的酶活為100%，其余五次與之相比，求其相對酶活。測定結(jié)果如圖2D所示。
[0098]結(jié)果表明，固定化酶隨著使用次數(shù)的增加相對酶活逐漸有所下降，這可能與固定化酶在使用過程中酶活自身下降，或者部分酶和載體結(jié)合不牢造成部分酶脫落有關(guān)。盡管如此，固定化酶在重復(fù)利用6次之后，其相對酶活仍然在90%以上。因而，蛋白酶經(jīng)固定化后，操作穩(wěn)定性較好，在實際工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的潛力。[〇〇99] 1.4.5貯藏穩(wěn)定性
[0100]貯藏穩(wěn)定性是衡量酶蛋白工業(yè)價值大小的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。將固定定化酶(浸泡于2 倍體積的無菌水中)和游離酶放置在4°C條件下貯藏28天，然后分別測定固定化酶和游離酶的剩余酶活，以第1天測得的酶活為100%，第28天的酶活與之相比，求其相對酶活。結(jié)果如圖2E所示。
[0101]由圖2E可以看出，固定化酶和游離酶在4°C條件下保存28天后，固定化酶相對酶活仍然保持在98.41%，游離酶的相對酶活為92.26%。由此可見，菊芋果聚糖外切水解酶 (Htl-FEHII)經(jīng)固定化后貯藏穩(wěn)定性有所增強(qiáng)?？赡苁且驗榫沼蠊厶峭馇兴饷附?jīng)固定化后，酶蛋白周圍的微環(huán)境有所變化，使酶蛋白結(jié)構(gòu)和酶蛋白活性中心得到保護(hù)，酶蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，不易使酶失去活性。[〇1〇2]本實施例采用D201大孔陰離子樹脂為載體，戊二醛為交聯(lián)劑對菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)進(jìn)行固定化，對其固定化條件進(jìn)行探索與優(yōu)化，并對固定化果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析。[〇1〇3]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)固定化酶的最適制備條件結(jié)果如下:稱取已處理好的樹脂 0.2g，然后Ph4.5醋酸鈉緩沖溶液和0.lml的濃縮酶液，放置在搖床上40°C吸附3小時，迅速冷卻后，加入戊二醛溶液，使其終濃度為0.125%，10°C交聯(lián)2小時后，用蒸餾水洗滌后放在4 °C冰箱中備用。通過此條件制備的固定化酶，酶活回收率能夠達(dá)到73.53%.[〇1〇4]按照固定化酶最佳制備參數(shù)條件下制備固定化酶，并對其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析: 固定化酶的最適反應(yīng)溫度為40°C，比游離酶提高了 5°C。最適pH為6.5，與游離酶相較，pH值向右移動了 0.5個單位。菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)經(jīng)固定化后，其熱穩(wěn)定性并沒有提高，但操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性較好，在實際工業(yè)應(yīng)用中具有較好的潛力。
[0105]實施例2菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII )的包埋法固定化
[0106]本實施例采用海藻酸鈉包埋法對外切水解酶(Htl-FEHII)進(jìn)行固定，探究了海藻酸鈉包埋法制備固定化酶的最適條件，并對游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析比較，同時通過與吸附交聯(lián)法進(jìn)行了比較，確定了采用大孔陰離子樹脂吸附交聯(lián)法固定重組酶Htl-FEHII，酶活回收率較高，操作穩(wěn)定性好，具有實際工業(yè)應(yīng)用價值。
[0107]2.1試驗材料與方法
[0108]2.1.1試驗材料
[0109]海藻酸鈉、無水氯化鈣均購于南京壽德公司，菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FHin ) 采用現(xiàn)有方法制備。
[0110]2.1.2方法
[0111]固定化酶制備方法:首先用蒸餾水將海藻酸鈉溶解，帶氣泡消失后，加入酶液，混勻，氣泡完全消失后，用一次性注射器將上述混勻的溶液逐滴滴入氯化鈣溶液中，靜置固定一定時間后，用紗布濾出小球，然后用蒸餾水洗滌2至3次，稍微干燥后，放在4°C冰箱中備用。
[0112]2.2研究原理
[0113]海藻酸鈉中的鈉離子和氯化鈣溶液中的鈣離子能在在比較溫和的條件下發(fā)生陽離子交換，從而形成具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣凝膠，從而將所加酶液包埋在所形成的微球中。[〇114]2.3海藻酸鈉包埋法制備固定化酶制備條件的選擇
[0115]2.3.1海藻酸鈉溶液
[0116]首先用蒸餾水配制不同濃度的海藻酸鈉溶液(0.5 %，1 %，2 %，3 %，4% )(質(zhì)量體積比mg/ml)，然后加入0.1ml的酶液，待氣泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入 2%氯化鈣溶液(質(zhì)量體積比mg/ml)中，靜置固定2小時后，小球形成。用紗布將小球輕輕濾出，然后用蒸餾水洗滌2至3次，測定固定化酶酶活后并計算相對酶活，選擇最適條件進(jìn)行下一步操作。結(jié)果如圖3A所示。
[0117]—般而言，在一定海藻濃度范圍內(nèi)，固定化酶酶活隨著海藻酸鈉濃度增加而增加， 超過一定的濃度范圍，固定化酶酶活開始下降。由圖中可以看出，當(dāng)海藻酸鈉濃度為2%，固定化酶相對酶活最高，此時制備的固定化酶的效果最好，高于或低于此濃度，固定化效果都不理想。海藻酸鈉濃度一定，則與氯化鈣溶液交換的鈣離子數(shù)量也是一定的。海藻酸鈉溶液濃度過低，與氯化鈣溶液中的鈣離子交換數(shù)量較少，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為疏松，網(wǎng)絡(luò)孔徑較大，固定化酶機(jī)械強(qiáng)度差，易變形。這些都可能會引起酶蛋白從載體上泄露或脫落，從而導(dǎo)致固定化酶酶活下降。反之，若海藻酸鈉濃度過高，粘性大，雖然形成的固定化酶機(jī)械強(qiáng)度較好且不易變形，但海藻酸根與鈣離子形成的海藻酸鈣凝膠網(wǎng)路結(jié)構(gòu)會過于致密，網(wǎng)絡(luò)孔徑小，增加了位阻效應(yīng)，從而致使酶和底物不能充分結(jié)合，同樣也會降低固定化酶酶活。同時，高濃度的海藻酸鈉粘性較大，制備的固定化酶小球易有拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生，不利于固定化操作。因而選擇2 %的海藻酸鈉溶液進(jìn)行下一步固定化酶的制備。
[0118]2.3.2固定化時間
[0119]首先用蒸餾水配制2 %的海藻酸鈉溶液，冷卻后，加入0.1ml的酶液(3.40mg/ml)， 待氣泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入2% (質(zhì)量體積比mg/ml)氯化鈣溶液中，分別靜置固定化〇.5小時，1小時，1.5小時，2小時，2.5小時，小球形成，用蒸餾水洗滌2至3次，測定固定化酶酶活后并計算相對酶活，選擇最適條件進(jìn)行下一步操作。結(jié)果如圖3B所不。
[0120]由圖中可以看出，當(dāng)固定化時間為2h時，固定化酶的相對酶活最高，若固定化時間少于2h，的固定化酶的相對酶活隨著固定化時間的增加而增加，超過2小時，固定化酶的相對酶活開始下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是:固定化時間過短，海藻酸鈉與氯化鈣溶液中的鈣離子交換數(shù)量較少，形成的海藻酸鈣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為疏松，在洗滌和操作過程中，酶易于從載體上脫落，致使固定化酶的酶活下降:若固定化時間過長，海藻酸鈉與鈣離子交換數(shù)量過多，形成的海藻酸鈣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)過于緊密，從而增大了空間位阻效應(yīng)，不利于酶和底物充分結(jié)合，因而導(dǎo)致固定化酶酶活不再增加甚至下降。因而，當(dāng)固定化時間為2小時，得到的固定化酶的效果最好。
[0121]2.3.3氯化鈣濃度
[0122]首先用蒸餾水配制1 %的海藻酸鈉溶液，冷卻后，加入0.1ml酶液，混勻后，待氣泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入不同濃度的氯化鈣溶液中(1 %、1.5%、2%、 3%、4%)，靜置固定化2小時，小球形成，洗滌2至3次后，測定固定化酶酶活后計算相對酶活，選擇最適條件進(jìn)行下一步操作。結(jié)果如圖3C所示。
[0123]測定結(jié)果表明，當(dāng)氯化I丐濃度為1.5%時，固定化酶的相對酶活最高，當(dāng)氯化|丐濃度低于1.5%時，固定化酶的酶活隨著氯化鈣濃度的增加而增加。反之，則固定化酶的相對酶活則會隨著氯化鈣濃度的增加而降低。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是:氯化鈣濃度過低，海藻酸鈉與鈣離子交換數(shù)量較少，所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為疏松，且固定化酶機(jī)械強(qiáng)度差，易變形，， 酶蛋白容易從載體上脫落，從而導(dǎo)致固定化酶的酶活下降。反之，氯化鈣濃度過高，海藻酸鈉與鈣離子交換數(shù)量多，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為緊密，導(dǎo)致酶蛋白不能與底物充分結(jié)合，從而降低了固定化酶酶活。
[0124]2.3.4 加酶量
[0125]首先用蒸餾水配制2%的海藻酸鈉溶液，冷卻后，分別加入的酶液，待氣泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入1.5%氯化鈣溶液中，靜置固定化2小時后，小球形成，用蒸餾水洗滌2至3次，測定固定化酶酶活后并計算相對酶活，選擇最適條件進(jìn)行下一步操作。結(jié)果如圖3D所示。
[0126]由圖中結(jié)果可以看出，當(dāng)加酶量0.3ml為時，固定化酶相對酶活最高。當(dāng)加酶量小于0.3ml時，固定化酶酶活隨著加酶量的增加而增加，載體上的結(jié)合位點(diǎn)仍處于未飽和狀態(tài)。當(dāng)加酶量大于〇.3ml時，固定化酶酶活隨著加酶量的增加而減少，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是:加酶量增加到一定量時，載體上結(jié)合位點(diǎn)蛋白達(dá)到飽和，從而導(dǎo)致酶分子相互聚集，使酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。
[0127]當(dāng)海藻酸鈉包埋法與吸附交聯(lián)法相比，海藻酸鈉包埋法的固定化酶加酶量為 0.3ml時(3.40mg/ml)，固定化酶的回收率為53.60 %，而吸附交聯(lián)法的固定加酶量為0.lml (3.40mg/ml)時，其酶活回收率在70%上。海藻酸鈉包埋法加酶量多但回收率低，吸附交聯(lián)法的加酶量比海藻酸鈉包埋法加酶量少，其回收率要比海藻酸鈉回收率高。因而，包埋法并不是一種特別好的固定化酶制備方法。
[0128]2.4固定化酶酶學(xué)性質(zhì)分析
[0129]2.4.1最適溫度
[0130]將按最佳制備條件制定的固定化酶，分別置于不同的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，以測定酶活最高的一組為100%，計算相對酶活，確定固定化酶與底物反應(yīng)的最適溫度。結(jié)果如圖4A所示，由圖可以看出，海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶最適反應(yīng)溫度為35°C，與游離酶反應(yīng)溫度相同。
[0131] 2.4.2最適 pH
[0132]在固定化酶最佳制備條件下制定固定化酶，將其置于不同的pH值醋酸鈉緩沖液中，以最高一組為100%，計算相對酶活，確定固定化酶的最適反應(yīng)pH，結(jié)果如圖4B所示。
[0133]由圖中可以看出，游離酶的最適pH值為6.0，海藻酸鈉包埋法固定化酶最適pH為 7.0，較游離酶而言，均向右偏移了 1個單位。海藻酸鈉對pH值的改變極具敏感性，固定化酶最適pH向右偏移。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是因為，可能是由于海藻酸鈉是一種陰離子電解質(zhì)， 而大孔陰離子樹脂屬于陰離子載體，當(dāng)選用以陰離子材料為載體時，固定化酶的pH相較游離酶而言往往會往堿性方向偏移。也有可能是因為由于載體使固定化酶的構(gòu)象發(fā)生了變化，從而致使固定化酶的相對酶活高于游離酶。
[0134] 2.4.3熱穩(wěn)定性
[0135]將在最佳制備化酶條件下制備的固定化酶分別放入40°C，50°C』0°C，70°C，80°C 中熱處理〇.5h，然后測定游離酶和固定化酶酶活，并計算其相對酶活及分析比較，結(jié)果如圖 4(:所示。
[0136] 結(jié)果表明，游離酶和固定化酶酶活均隨著溫度的升高而下降，當(dāng)溫度達(dá)到60°C時， 游離酶和固定化酶幾乎沒有酶活，這說明經(jīng)過固定化后，重組酶Htl-FHl的熱穩(wěn)定性并沒有提高。此結(jié)果與吸附交聯(lián)法制定的固定化酶一致。
[0137] 2.4.4操作穩(wěn)定性
[0138]按照固定化酶的最佳制備條件制備固定化酶，然后在最適反應(yīng)條件下連續(xù)使用6 次，以第一次使用測得的固定化酶為1〇〇%，其余5次酶活與之相比，計算相對酶活并進(jìn)行分析，共設(shè)三個重復(fù)，測定結(jié)果如圖4D所示:
[0139]操作穩(wěn)定性是衡量固定化酶能否在工業(yè)中具有實用價值的標(biāo)準(zhǔn)之一。由圖中可以看出，海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶隨著使用次數(shù)的增加，其酶活不斷下降，這可能是因為，在固定化酶，酶重復(fù)過程中，酶蛋白不斷從載體上脫落，也有可能是因為隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加，固定化酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致其酶活下降。
[0140] 2.4.5貯藏穩(wěn)定性
[0141]將固定定化酶(浸泡于2倍體積的無菌水中)和游離酶放置在4°C條件下貯藏28天， 然后分別測定固定化酶和游離酶的剩余酶活，以第1天測得的酶活為100%，第28天的酶活與之相比，求其相對酶活。結(jié)果如圖4E所示。
[0142]由圖中可以看出，固定化酶和游離酶在4°C條件下保存28天后，固定化酶相對酶活仍然保持在94.37%，游離酶的相對酶活為91.41 %。由此可見，菊芋果聚糖外切水解酶 (Htl-FEHII)經(jīng)固定化后貯藏穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。[〇143] 2.5吸附交聯(lián)法與海藻酸鈉包埋法制備固定化酶比較
[0144] 1最適溫度和pH值
[0145]與海藻酸鈉包埋法相比，采用陰離子樹脂吸附交聯(lián)法制備的固定化酶最適溫度要比海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶的最適溫度高了 5°C，最適pH值均為6.5，比較游離酶而言，均向右偏移了 0.5個單位。
[0146]2回收利用率
[0147]海藻酸鈉最最適加酶量條件下，固定化酶回收利用率為53.60%，而陰離子交換樹脂吸附交聯(lián)法制備的固定化酶，固定化酶的回收利用率在70%以上，要高于海藻酸鈉包埋法的回收利用率。
[0148]3操作穩(wěn)定性比較
[0149]采用海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶在重復(fù)使用6次后，其相對酶活僅為 21.60%，而采用陰離子交換樹脂吸附交聯(lián)法制備的固定化酶在重復(fù)使用6次后，其相對酶活達(dá)到了90 %以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出了海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶。
[0150]4貯藏穩(wěn)定性[〇151]與游離酶相比，海藻酸鈉包埋法和陰離子樹脂吸附交聯(lián)法制備的固定化酶的貯藏穩(wěn)定性均有所提高，但采用陰離子交換樹脂制備的固定化酶的相對酶活要高于海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶，因而，其貯藏穩(wěn)定性要比海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶要好。
[0152]綜上所述，陰離子樹脂吸附交聯(lián)法制備的固定化酶的回收利用率、操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性均比海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶效果。因而，前者制備的菊芋果聚糖外切水解酶(Htl-FEHII)更具有實際應(yīng)用價值。
[0153]本發(fā)明采用海藻酸鈉包埋法對重組酶Htl-FEHII進(jìn)行了固定化，確定了海藻酸鈉包埋法制備重組酶Htl-FEHII固定化酶的條件，并對其進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析，并與吸附交聯(lián)法做了比較，以確定這兩種方法中哪一種更適用于重組酶Htl-FEHII的固定化。
[0154]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，采用海藻酸鈉包埋法固定化重組酶Htl-FEHII的最適條件如下:海藻酸鈉溶液為2 %，氯化鈣溶液濃度為1.5%，加酶量為0.3ml，固定化時間為2小時時， 其固定化效果最好。采用海藻酸鈉法在最適固定化條件下制備的固定化酶的回收率為 53.60%
[0155]在海藻酸鈉包埋法最適條件確定后制備固定化酶，并對游離酶和海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶進(jìn)行了分析比較。研究發(fā)現(xiàn)，游離酶的最適反應(yīng)溫度為35°C，經(jīng)固定化后， 固定化酶的最適反應(yīng)溫度仍為35°C，游離酶的最適PH值為6.0，經(jīng)固定化后，最適pH值為 6.5,比游離酶向右偏移了 0.5個單位。采用海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶與游離酶相比， 固定化酶的熱穩(wěn)定并沒有提高，這可能與重組酶Htl-FEH本身熱穩(wěn)定性不穩(wěn)定有關(guān)。
[0156]通過海藻酸鈉包埋法與大孔陰離子樹脂吸附交聯(lián)法制備的固定化酶比較，研究表明，大采用D201大孔陰離子樹脂吸附交聯(lián)法要比海藻酸鈉包埋法制備的固定化酶更具有優(yōu)勢，且在工業(yè)中的實際運(yùn)用價值更高。
【主權(quán)項】
1.一種固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于它采用以下兩種方法中的任意一種 制備:方法一:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔陰離子樹脂為載體，在10?45°C， pH4.0?6.0條件下吸附并冷卻后，以終濃度為0.1 %?0.5%的戊二醛溶液為交聯(lián)劑在2? 25°C條件下交聯(lián)后洗滌干燥得固定化酶；方法二:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸鈉溶液中混勻制成混合溶液，將 混合溶液滴入氯化鈣溶液中，靜置固定后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于方法一的詳細(xì)步驟為:稱取預(yù)處理好的D201大孔陰離子樹脂，加入pH4.0?6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，在10?45°C條件下吸附并冷卻后，加入終濃 度為0.1 %?0.5 %的戊二醛溶液，2?25 °C交聯(lián)后洗滌并干燥得固定化酶；方法二的詳細(xì)步驟為:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到濃度為0.5 %?3 %的海藻 酸鈉溶液中混合均勻制成混合溶液，將混合溶液滴入濃度為1 %?4 %的氯化鈣溶液中，靜 置固定0.5?2.5h后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于方法一中所述吸附的溫度為20?40°C，pH值為4.5?5.0，時間為0.5?6h;所述戊二醛 溶液的終濃度為〇.1 %?〇.25%，所述交聯(lián)的溫度為2?15°C，時間為0.5?8h;方法二中所述海藻酸鈉溶液的濃度為0.5 %?2.5 %，所述氯化鈣溶液的濃度為1 %? 2%，所述靜置固定的時間為0.5?2。4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任意一項所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于所述的方法一為:稱取預(yù)處理好的D201大孔陰離子樹脂加入pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，40 °C吸附3小時，迅速冷卻后，加入戊二醛溶液，使其 終濃度為〇.125%，10°C交聯(lián)2小時后，用蒸餾水洗滌干燥后放在4°C冰箱中備用；所述的方法二為:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到濃度為2%的海藻酸鈉溶液中 混合均勻制成混合溶液，將混合溶液滴入濃度為1.5%的氯化鈣溶液中，靜置固定2h后，過 濾并將濾餅用蒸餾水洗滌干燥得固定化酶。5.—種固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，其特征在于為以下兩種方法中的任 意一種:方法一:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔陰離子樹脂為載體，在10?45°C， pH4.0?6.0條件下吸附并冷卻后，以終濃度為0.1 %?0.5%的戊二醛溶液為交聯(lián)劑在2? 25°C條件下交聯(lián)后洗滌干燥得固定化酶；方法二:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸鈉溶液中混勻制成混合溶液，將 混合溶液滴入氯化鈣溶液中，靜置固定后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，其特征在于方法一的詳細(xì)步驟為:稱取預(yù)處理好的D201大孔陰離子樹脂，加入pH4.0?6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，在10?45°C條件下吸附并冷卻后，加入終濃 度為0.1 %?0.5 %的戊二醛溶液，2?25 °C交聯(lián)后洗滌并干燥得固定化酶；方法二的詳細(xì)步驟為:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到濃度為0.5 %?3 %的海藻 酸鈉溶液中混合均勻制成混合溶液，將混合溶液滴入濃度為1 %?4 %的氯化鈣溶液中，靜置固定0.5?2.5h后，過濾并將濾餅洗滌干燥得固定化酶。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，其特征在于 方法一中所述吸附的溫度為20?40°C，pH值為4.5?5.0，時間為0.5?6h;所述戊二醛溶液的濃度為0.1 %?0.25%，所述交聯(lián)的溫度為2?15°C，時間為0.5?8h;方法二中所述海藻酸鈉溶液的濃度為0.5 %?2.5 %，所述氯化鈣溶液的濃度為1 %? 2%，所述靜置固定的時間為0.5?2。8.根據(jù)權(quán)利要求5?7中任意一項所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制備方法，其 特征在于所述的方法一為:稱取預(yù)處理好的D201大孔陰離子樹脂加入pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩 沖溶液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，40 °C吸附3小時，迅速冷卻后，加入戊二醛溶液，使其 終濃度為〇.125%，10°C交聯(lián)2小時后，用蒸餾水洗滌干燥后放在4°C冰箱中備用；所述的方法二為:將菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到濃度為2%的海藻酸鈉溶液中 混合均勻制成混合溶液，將混合溶液滴入濃度為1.5%的氯化鈣溶液中，靜置固定2h后，過 濾并將濾餅用蒸餾水洗滌干燥得固定化酶。
【文檔編號】C12N11/04GK105969756SQ201610356899
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】梁明祥, 金麗巾
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)