十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法，該方法包括以下步驟：⑴使用改良的CTAB法提取三個(gè)相互之間地理間隔超過(guò)300 km的黃綠卷毛菌居群的基因組DNA；⑵從三個(gè)居群中各隨機(jī)選取一個(gè)個(gè)體的基因組DNA混合，檢測(cè)總DNA的質(zhì)量，并制備基因文庫(kù)，經(jīng)庫(kù)檢合格后，進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測(cè)序；⑶測(cè)序數(shù)據(jù)拼接完成后，使用SR search 軟件檢測(cè)總DNA序列中簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR并運(yùn)用primer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；⑷采用溫度梯度法獲得退火溫度為50~60℃的SSR引物；⑸利用SSR引物對(duì)三個(gè)居群的黃綠卷毛菌基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序、驗(yàn)證，獲得具有多態(tài)性的12對(duì)引物；⑹計(jì)算等位基因數(shù)Na、單倍型多樣性Hd遺傳分化系數(shù)FST、核苷酸多樣性Pi、GST以及π值。本發(fā)明有利于大規(guī)模的研究。
【專利說(shuō)明】
十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)増與測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及真菌小尺度范圍群落結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及十二對(duì)黃 綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃綠卷毛菌隸屬于傘菌目（Agaricales) 口蘑科 (fricholomataceae)，是一種主要分布在青藏高原的產(chǎn)子實(shí)體的外生菌根真菌。由于其子 實(shí)體色澤嫩黃、口味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，長(zhǎng)久以來(lái)一直被作為青藏高原特色美食、有著較高的 經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003] 目前，人類對(duì)青藏高原廣泛分布的、在高寒草甸脆弱生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的 該菌缺乏必要的了解，比如其生殖方式、分布情況和小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)等。
[0004] 基株(genet)是指在一定空間范圍內(nèi)一組在遺傳學(xué)上一致的個(gè)體的集合，對(duì)于菌 根真菌來(lái)說(shuō)通常是指由同一菌絲體發(fā)展而成的子實(shí)體的集合。研究ECM基株，有助于了解其 分布模型、生殖狀況以及在特定環(huán)境中的生態(tài)策略。關(guān)于ECM基株的研究一直受到基因型辨 認(rèn)尤其是同種真菌基因型辨認(rèn)困難問(wèn)題的困擾。傳統(tǒng)的方法是利用同工酶以及營(yíng)養(yǎng)體不親 和性（SI)進(jìn)行研究：遺傳背景相似的菌絲能夠相互融合，而遺傳距離較遠(yuǎn)者接觸后會(huì)形成 反應(yīng)區(qū)域。但是，這種方法要求在實(shí)驗(yàn)之前從子實(shí)體上分離組織進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，很有可能會(huì) 造成實(shí)驗(yàn)材料的損失，并且它反映出的差異主要是和拮抗反應(yīng)相關(guān)的位點(diǎn)而不是整個(gè)基因 組的差異，所以遺傳多樣性很有可能會(huì)被低估。
[0005] 近2 0年來(lái)興起的研究D NA多態(tài)性的方法能夠快速準(zhǔn)確的判定大量同種不同個(gè)體 ECM的基因型，為大規(guī)模研究ECM種群結(jié)構(gòu)及基株分布做出了重要的貢獻(xiàn)。微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR) 包含卜6個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，它存在于大多數(shù)真核生物的基因組中的蛋白質(zhì)編碼與非編 碼區(qū)，有著豐富的數(shù)量以及較高的個(gè)體間的多態(tài)性(每一代每個(gè)位點(diǎn)的變異數(shù)為10- 2-10-6 個(gè)堿基）。而如此高的變異率主要來(lái)自DNA重組時(shí)發(fā)生的錯(cuò)誤、不等交換和在復(fù)制或者修復(fù) 過(guò)程中產(chǎn)生的聚合酶滑動(dòng)造成的。由于SSR具有突變速率快、多態(tài)性高、共顯性且引物具有 一定的種間的通用性，因此近年來(lái)廣泛的應(yīng)用于ECM基株的相關(guān)研究當(dāng)中。但是，目前廣泛 使用的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析方法（分析電泳條帶）極有可能會(huì)受到無(wú)效等位基因 （Null alleles)的干擾從而降低雜合度，而利用微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增結(jié)果直接測(cè)序是一種很好的解決 方案。雖然，之前的研究已經(jīng)開(kāi)發(fā)了該物種的EST-SSR引物，但是編碼區(qū)的SSR序列多態(tài)性較 低，不足以完成小尺度空間遺傳結(jié)構(gòu)研究。因此，有必要重新開(kāi)發(fā)適于測(cè)序分析的核基因 SSR引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利于大規(guī)模研究的十二對(duì)黃綠卷毛菌微 衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法。
[0007] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè) 序方法，包括以下步驟： ⑴使用改良的CTAB法提取三個(gè)相互之間地理間隔超過(guò)300 km的黃綠卷毛菌居群的基 因組DNA; ⑵從三個(gè)居群中各隨機(jī)選取一個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行混合后，檢測(cè)所述總DNA的質(zhì) 量，并制備基因文庫(kù)，經(jīng)庫(kù)檢合格后，進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測(cè)序； (3)測(cè)序數(shù)據(jù)拼接完成后，使用SR search軟件檢測(cè)所述總DNA序列中簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR 并運(yùn)用pr imer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； ⑷采用溫度梯度法獲得退火溫度為50~60 °C并產(chǎn)生唯一、明亮條帶的SSR引物； (5) 利用所述SSR引物對(duì)三個(gè)居群的所述黃綠卷毛菌基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn) 行測(cè)序及多態(tài)性驗(yàn)證，獲得具有多態(tài)性的12對(duì)引物： GSSR3L引物的上游引物有20個(gè)堿基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20個(gè)堿基 GAGCGCAACCCCTGTATATC； GSSR6L引物的上游引物有20個(gè)堿基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20個(gè)堿基 CACTGCACCAAATAGCCAAG； GSSR7L引物的上游引物有20個(gè)堿基AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20個(gè)堿基 CGACACTCGTTTGTGCTGTT； GSSR9L引物的上游引物有21個(gè)堿基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20個(gè)堿 基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT; GSSR11L引物的上游引物有20個(gè)堿基TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20個(gè)堿基 TGCCGTTGGACATTTCTATG； GSSR26L引物的上游引物有20個(gè)堿基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21個(gè)堿基 GACGGAGCTTGAGAAGTTGG； GSSR33L引物的上游引物有23個(gè)堿基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22個(gè)堿 基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC; GSSR36L引物的上游引物有20個(gè)堿基GCACGATCAATATGTTGGAC，其下游引物有21個(gè)堿基 AGACACAGCCGCTACTCGTGA； GSSR45L引物的上游引物有20個(gè)堿基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20個(gè)堿基 AACAAAATCGACCGCCATCA； GSSR46L引物的上游引物有21個(gè)堿基TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20個(gè)堿 基AACAAAATCGACCGCCATCA; GSSR47L引物的上游引物有21個(gè)堿基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21個(gè)堿基 TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT； GSSR49L引物的上游引物有20個(gè)堿基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20個(gè)堿基 TTGGACCCTCTTTTCCATCA； (6) 利用軟件661^1^6.5計(jì)算等位基因數(shù)1、單倍型多樣性價(jià)遺傳分化系數(shù)/^、核苷 酸多樣性A·、ftT以及4直。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明通過(guò)開(kāi)發(fā)用于測(cè)序分析的SSR引物，不但能夠消除傳統(tǒng)分析方法存在的無(wú)效 等位基因的干擾，而且免除了做PAGE膠分析的繁瑣步驟，更有利于大規(guī)模的研究。
[0009] 2、本發(fā)明所得的SSR引物各個(gè)條帶的研究精度能夠精確到1 bp，極大地提高了研 究的準(zhǔn)確性。
[0010] 3、應(yīng)用本發(fā)明所得到的引物擴(kuò)增來(lái)自3個(gè)居群63個(gè)個(gè)體的黃綠卷毛菌，均具有較 高的多態(tài)性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)有5對(duì)具有多態(tài)性的引物其多態(tài)性不僅是微衛(wèi)星重復(fù)單元數(shù)量的變 化造成的，并且各個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)單元也存在堿基的堿基置換（圖1)。這一發(fā)現(xiàn)，能夠使相關(guān) 的研究結(jié)果更加的精確。
【附圖說(shuō)明】
[0011]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0012] 圖1為本發(fā)明涉及到重復(fù)序列突變的測(cè)序峰圖（引物GSSR47L)。
[0013] 圖2為總DNA提取電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法，包括以下步驟： ⑴使用改良的CTAB法提取三個(gè)相互之間地理間隔超過(guò)300 km的黃綠卷毛菌居群的基 因組DNA。
[0015]⑵從三個(gè)居群中各隨機(jī)選取一個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行混合后，檢測(cè)總DNA的質(zhì) 量，并制備基因文庫(kù)，經(jīng)庫(kù)檢合格后，進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測(cè)序。
[0016]⑶測(cè)序數(shù)據(jù)拼接完成后，使用SR search軟件檢測(cè)總DNA序列中簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR 并運(yùn)用pr imer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0017]其中：SR search軟件分為3個(gè)模塊:第一個(gè)模塊是用于檢測(cè)DNA序列所有簡(jiǎn)單重 復(fù)序列，第二個(gè)模塊是對(duì)第一個(gè)模塊的結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾去掉距離過(guò)近的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，第三 個(gè)模塊是運(yùn)用pr imer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0018]⑷采用溫度梯度法獲得退火溫度為50~60°C并產(chǎn)生唯一、明亮條帶的SSR引物。 [0019] (5)利用SSR引物對(duì)三個(gè)居群的黃綠卷毛菌基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè) 序及多態(tài)性驗(yàn)證，獲得具有多態(tài)性的12對(duì)引物： GSSR3L引物的上游引物有20個(gè)堿基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20個(gè)堿基 GAGCGCAACCCCTGTATATC； GSSR6L引物的上游引物有20個(gè)堿基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20個(gè)堿基 CACTGCACCAAATAGCCAAG； GSSR7L引物的上游引物有20個(gè)堿基AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20個(gè)堿基 CGACACTCGTTTGTGCTGTT； GSSR9L引物的上游引物有21個(gè)堿基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20個(gè)堿 基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT; GSSR11L引物的上游引物有20個(gè)堿基TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20個(gè)堿基 TGCCGTTGGACATTTCTATG； GSSR26L引物的上游引物有20個(gè)堿基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21個(gè)堿基 GACGGAGCTTGAGAAGTTGG； GSSR33L引物的上游引物有23個(gè)堿基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22個(gè)堿 基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC; GSSR36L引物的上游引物有20個(gè)堿基GCACGATCAATATGTTGGAC，其下游引物有21個(gè)堿基 AGACACAGCCGCTACTCGTGA； GSSR45L引物的上游引物有20個(gè)堿基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20個(gè)堿基 AACAAAATCGACCGCCATCA； GSSR46L引物的上游引物有21個(gè)堿基TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20個(gè)堿 基AACAAAATCGACCGCCATCA; GSSR47L引物的上游引物有21個(gè)堿基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21個(gè)堿基 TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT； GSSR49L引物的上游引物有20個(gè)堿基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20個(gè)堿基 TTGGACCCTCTTTTCCATCA。
[0020] (6)利用軟件661^1616.5計(jì)算等位基因數(shù)#3、單倍型多樣性仏遺傳分化系數(shù)丹丁、 核苷酸多樣性Λ、ftT以及4直。
[0021] 實(shí)施例十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法，包括以下步驟： ⑴使用改良的CTAB法提取下述三個(gè)菌群的63個(gè)個(gè)體的黃綠卷毛菌居群的基因組DNA (參見(jiàn)表1)。
[0022] 表1黃綠卷毛菌(/7. 2uieorire/3s)樣品采集信息
具體步驟如下： ① 稱取0.5 g硅膠干燥并經(jīng)烘箱45 °C烘干后的子實(shí)體菌柄與菌蓋交界處的內(nèi)部組織， 在研缽中加入液氮預(yù)冷，加入0.2 g PVP粉，將材料放到液氮中研磨均勻，直至全部研磨至 粉末； ② 轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，加入600 yL 65°C預(yù)熱的BI溶液，65°C水浴震蕩10 min，4°C、 10000 rmin離心10 min，棄上清液A; ③ 加入1 ml 65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液和12 μ?3-巰基乙醇，放入65°C恒溫水浴鍋中 60 min，期間10 min將離心管取出搖勾； ④ 加入8 yL β-巰基乙醇和1000 yL 3XCTAB，輕彈使沉淀懸浮，放入65°C水浴恒溫震 蕩箱中搖60 min，期間每隔10 min將離心管取出搖勾； ⑤ 加入600 yL的CI，緩慢搖晃10 min，使內(nèi)含物充分混勻形成乳濁液，4°C、10000 rmin 低溫高速離心10 min使其分層，取上清液B到另一個(gè)1.5 ml離心管中； ⑥ 重復(fù)上一步2遍； ⑦ 在上清液B中加入600 yL在-20 °C預(yù)冷的異丙醇，搖勻，放到-20 °C冰箱中沉淀1~2 h; ⑧ 4°C、10000 rmin低溫高速離心10 min，棄上清液C，收集沉淀； ⑨ 重復(fù)上一步2~3遍，然后將沉淀放入37 °C恒溫箱干燥或室溫自然風(fēng)干； ⑩ 用100此三蒸水溶解沉淀，4 °C過(guò)夜，再用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的產(chǎn)量與質(zhì)量，見(jiàn) 圖2。
[0023] ⑵從三個(gè)居群中各隨機(jī)選取一個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行混合后，檢測(cè)總DNA的質(zhì) 量，并制備基因文庫(kù)，經(jīng)庫(kù)檢合格后，進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測(cè)序。
[0024] ⑶測(cè)序數(shù)據(jù)拼接完成后，使用SR search軟件檢測(cè)總DNA序列中簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR 并運(yùn)用pr imer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0025] 其中： SR search軟件分為3個(gè)模塊:第一個(gè)模塊是用于檢測(cè)DNA序列所有簡(jiǎn)單重復(fù)序列，第 二個(gè)模塊是對(duì)第一個(gè)模塊的結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾去掉距離過(guò)近的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，第三個(gè)模塊是運(yùn) 用pr imer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0026] SSR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如下： ① SSR重復(fù)單元的最小長(zhǎng)度為2。
[0027]②SSR重復(fù)單元的最大長(zhǎng)度為6。
[0028]③SSR序列的最小長(zhǎng)度為12。
[0029] ④SSR上下游序列長(zhǎng)度為100 bp。
[0030] ⑤兩個(gè)SSR的最小距離為12 bp。
[0031] ⑷采用溫度梯度法獲得退火溫度為50~60°C并產(chǎn)生唯一、明亮條帶的SSR引物。具 體如下： PCR擴(kuò)增體系： 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：25 yL 內(nèi)含ddH20 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP(10mM) 0.5 yL，前引物（10mM)0.5 yL，后引物（10 mM)0.5 yL，Taq polymerase(5UAiL)0.5 yL，0.2 yL DNA模板（15 ng)1.5 yL。
[0032] 擴(kuò)增條件：95°C預(yù)變性5 min，然后94°C變性30 s，50~60°C退火40 s，72°C延伸55 s，共34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0033] 該體系反應(yīng)完成之后用凝膠成像電泳檢測(cè)所的產(chǎn)物，看是否有良好條帶，對(duì)于有 良好條帶的SSR引物，即為符合篩選要求的SSR引物，選擇其中較亮條帶對(duì)應(yīng)的退火溫度進(jìn) 行下一步操作。
[0034] (5)利用能夠產(chǎn)生唯一、明亮條帶的SSR引物對(duì)三個(gè)居群的黃綠卷毛菌基因組DNA分 別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序及多態(tài)性驗(yàn)證，獲得具有多態(tài)性的12對(duì)引物。具體步驟如下： 利用所得符合條件的SSR引物用3個(gè)居群的63個(gè)DNA樣本(表1)分別在最適退火溫度下 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0035] 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：25 yL 內(nèi)含ddH20 19.3 yL，10XBuffer(+Mg2+)2.5 yL，dNTP (10mM)0.5 yL，前引物（10 mM)0.5 yL，后引物（10 mM)0.5 yL，Taq polymerase(5UAiL)0.5 yL，0.2 yL DNA模板（15 ng)1.5 yL。
[0036] 擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性5 min，然后94°C變性30 s，最適退火溫度40 s，72°C延伸55 s，共34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。
[0037] PCR完成后，樣品經(jīng)純化后在中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn)室測(cè)序，得到12對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物（表2)之后上傳至GenBank獲得GenBank accession numbers 〇
[0038] 表2 12對(duì)SSR引物序列及多增片段長(zhǎng)度
(6)利用軟件661^1^6.5計(jì)算等位基因數(shù)1、單倍型多樣性說(shuō)遺傳分化系數(shù)/^^、核苷 酸多樣性Λ、&τ以及4直。
[0039] ?0財(cái)廣增、測(cè)序后用〇^〇11^和]\^64 5.1等軟件進(jìn)行校正和比對(duì)。用661^1616.5計(jì) 算等位基因數(shù)1、單倍型多樣性z/d遺傳分化系數(shù)&T、核苷酸多樣性Λ、&Τ以及π值。結(jié)果 顯示，所有篩選得到的12對(duì)SSR引物在三個(gè)居群中均具有較高的多態(tài)性，能夠滿足進(jìn)一步研 究的要求。（表3、表4)。
[0040] 表3各引物多態(tài)性參數(shù)計(jì)算
表4利用三個(gè)居群的黃綠卷毛菌驗(yàn)證微衛(wèi)星引物的多態(tài)性
【主權(quán)項(xiàng)】
1.十二對(duì)黃綠卷毛菌微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與測(cè)序方法，包括以下步驟： ⑴使用改良的CTAB法提取三個(gè)相互之間地理間隔超過(guò)300 km的黃綠卷毛菌居群的基 因組DNA; ⑵從三個(gè)居群中各隨機(jī)選取一個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行混合后，檢測(cè)所述總DNA的質(zhì) 量，并制備基因文庫(kù)，經(jīng)庫(kù)檢合格后，進(jìn)行Illumina HiSeqTM2500測(cè)序； (3)測(cè)序數(shù)據(jù)拼接完成后，使用SR search軟件檢測(cè)所述總DNA序列中簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR 并運(yùn)用pr imer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； ⑷采用溫度梯度法獲得退火溫度為50~60 °C并產(chǎn)生唯一、明亮條帶的SSR引物； (5) 利用所述SSR引物對(duì)三個(gè)居群的所述黃綠卷毛菌基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn) 行測(cè)序及多態(tài)性驗(yàn)證，獲得具有多態(tài)性的12對(duì)引物： GSSR3L引物的上游引物有20個(gè)堿基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20個(gè)堿基 GAGCGCAACCCCTGTATATC； GSSR6L引物的上游引物有20個(gè)堿基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20個(gè)堿基 CACTGCACCAAATAGCCAAG； GSSR7L引物的上游引物有20個(gè)堿基AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20個(gè)堿基 CGACACTCGTTTGTGCTGTT； GSSR9L引物的上游引物有21個(gè)堿基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20個(gè)堿 基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT; GSSR11L引物的上游引物有20個(gè)堿基TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20個(gè)堿基 TGCCGTTGGACATTTCTATG； GSSR26L引物的上游引物有20個(gè)堿基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21個(gè)堿基 GACGGAGCTTGAGAAGTTGG； GSSR33L引物的上游引物有23個(gè)堿基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22個(gè)堿 基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC; 6331?361^引物的上游引物有20個(gè)堿基60六06411^了六了61^6六(：，其下游引物有21個(gè)堿基 AGACACAGCCGCTACTCGTGA； GSSR45L引物的上游引物有20個(gè)堿基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20個(gè)堿基 AACAAAATCGACCGCCATCA； GSSR46L引物的上游引物有21個(gè)堿基TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20個(gè)堿 基AACAAAATCGACCGCCATCA; GSSR47L引物的上游引物有21個(gè)堿基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21個(gè)堿基 TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT； GSSR49L引物的上游引物有20個(gè)堿基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20個(gè)堿基 TTGGACCCTCTTTTCCATCA； (6) 利用軟件Genalex 6.5計(jì)算等位基因數(shù)凡、單倍型多樣性他遺傳分化系數(shù)FST、核苷酸 多樣性Pi、&τ以及x值。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105969862SQ201610328310
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月18日
【發(fā)明人】邢睿, 高慶波, 張發(fā)起, 陳世龍
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所