一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于：SNP標(biāo)記為位于香豬NCBI豬參考基因組Sscrofa 10.2的chr17:17089983，該SNP位點的兩種等位基因為T或C，三種基因型分別命名為CC、TT和CT型，分別對應(yīng)于chr17:17089983的堿基是純合的CC、TT，或雜合的CT類型，TT和CT基因型對應(yīng)于1胎2胎和3胎的產(chǎn)仔數(shù)較高。
【專利說明】
一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及家畜分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體來說，涉及一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的 SNP標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)仔數(shù)是養(yǎng)豬業(yè)重要的經(jīng)濟性狀(曹清果，2004)，是豬遺傳育種研究的熱點和重 點。香豬是我國珍貴的小型地方豬種，具基因純合度高、肌纖維細(xì)、脂肪顆粒小、肉質(zhì)香糯、 早熟易繁等特點，適于制作高質(zhì)量肉品。我們在貴州從江縣發(fā)現(xiàn)香豬群體中產(chǎn)仔數(shù)存在較 大的差別，是豬繁殖調(diào)控研究和品種選育的良好遺傳材料。
[0003] 豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀是數(shù)量性狀，調(diào)控基因中有幾個主效基，更多的是微效基因。基于 芯片的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)技術(shù)已用于數(shù)量性狀 的基因座(quantitative trait locus，QTL)的篩選研究。全基因組關(guān)聯(lián)分析是指在豬全基 因組范圍內(nèi)篩選出SNP位點，經(jīng)過分群和SNP位點分型，利用統(tǒng)計學(xué)的方法，從中篩選出與某 些性狀相關(guān)聯(lián)的SNP，進而得到控制或者影響豬繁殖性狀的QTL。我們的前期研究中應(yīng)用 Illumina Porcine SNP60K基因芯片，對香豬進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選出某些SNP位 點具有多態(tài)性，與香豬的產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。這些候選位點在較大的香豬群體中是否真實存 在、如何影響香豬的產(chǎn)仔數(shù)，需要建立一種技術(shù)和方法，便于進行群體基因分型研究和應(yīng) 用。本發(fā)明描述一個SNP位點基因型的AS-PCR檢測方法，目的在于適用于改善香豬產(chǎn)仔數(shù)的 分子輔助選擇技術(shù)。
[0004] SNP是一種在動物基因組中存在的數(shù)目多、分布廣泛且相對穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，主要 指基因組核苷酸水平上的變異引起的序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的 插入、缺失等(楊昭慶等，2000)。作為第三代分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于生物、農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物 進化等領(lǐng)域，在分子遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)以及疾病的診斷和治療等方面發(fā)揮著重要 作用（唐立群等，2012)。目前SNP檢測常用方法有：單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism, SSCP)、等位基因特異性 PCR(allele_spec ific PCR，AS-PCR)、直接測序、DNA芯片等(許家磊等，2015)，其中AS-PCR方法適于群體檢測。
[0005] AS-PCR方法的原理是，由于Taq DNA聚合酶對位于引物3'末端的單個堿基的錯配 無法修復(fù)，當(dāng)引物3'末端的堿基與SNP位點的等位基因互補配對時，才能發(fā)生擴增反應(yīng)；當(dāng) 引物3'末端的堿基與SNP位點的等位基因不匹時，則擴增反應(yīng)不能發(fā)生（Suzuki et al.， 1991)。每個SNP位點的檢測需要設(shè)計三條不同的引物，其中一條是通用的引物，另兩條是分 別對應(yīng)SNP位點的兩個等位基因的特異性引物。以每個個體的基因組DNA為模板進行PCR擴 增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，依據(jù)電泳條帶的有和無確定SNP的基因型。理論上，引物 3'末端的堿基與DNA模板發(fā)生完全互補配對時，Taq DNA聚合酶才能使擴增反應(yīng)有效地進 行。然而多項研究表明，在某些情況下即使引物3'末端的堿基與DNA模板不是完全的互補配 對，延伸反應(yīng)仍然可以發(fā)生(Ugozzoli et al.，1991)。為了解決這一問題，人為地在3'末端 倒數(shù)第二或第三位引入錯配的堿基，能夠顯著提高引物的特異性，降低假陽性率(Hayashi et al·，2004)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP標(biāo)記，位于香豬NCBI豬參考基 因組Sscrofa 10.2的(：1^17:17089983(^:339042644)，該5陬位點的兩種等位基因為1'或(：， 三種基因型分別命名為CC、TT和CT型，分別對應(yīng)于chrl7:17089983的堿基是純合的CC、TT， 或雜合的CT類型。
[0008] 本發(fā)明還提供用于檢測香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的SNP標(biāo)記的一組引物，所述的引物分別 為:末位錨定引物U1 (上游引物）：5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAT-3 '，末位錨定引物U2 (上游 引物）：5'-TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAC-3' 和下游引物D3:5'_ AAAGACTGGTAGGTCAAAGAGTATGC-3'，目的序列分別為SEQ ID No.l和SEQ ID Νο·2。
[0009] 本發(fā)明還提供所述SNP標(biāo)記在不同產(chǎn)仔數(shù)香豬群中的檢測方法。
[0010]該方法包括以下步驟：
[0011] (1)提取待測香豬的基因組DNA;
[0012] (2)以待測香豬的基因組DNA為模板，分另_用引物U1、U2和D3，進行AS-PCR檢測， 確定香豬SNP位點chrl7:17089983的基因型；
[0013] (3)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測AS-PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶并判斷基因 型。如待測個體該位點基因型為CT型或TT型，可將待測個體視為有較高產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)勢的香豬 個體，可選擇留作種公豬或種母豬，以提高后代的產(chǎn)仔數(shù);如基因型為CC型，可將待測個體 視為產(chǎn)仔數(shù)較低的個體，不用于提高后代的產(chǎn)仔數(shù)的親本。
[0014] 步驟(2)中進行AS-PCR所使用的擴增體系為20yL，計為：2XTaq PCR Master Mix 1 OyL，1 Ομπιο 1 /L 引物U1 /U20 · 2yL，1 Ομπιο 1 /L 引物D30 · 2yL，ddH20 8 · 6yL，1 Ong/yL基因組DNA lyL。進行AS-PCR采用的反應(yīng)條件：1)預(yù)變性:94.0°C5min;2)擴增反應(yīng):變性:94.0°C30sec， 退火：60.0。(：-66.0 1€3086(3，延伸：72.01€4586(3,30個循環(huán)；72.0。(：1011^11 〇
[0015] 本發(fā)明進一步提供所述SNP標(biāo)記在鑒定產(chǎn)仔數(shù)及與香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的分子標(biāo) 記輔助育種中的應(yīng)用。
[0016] 前述的應(yīng)用包括以下步驟：
[0017] (1)采用AS-PCR技術(shù)檢測SNP位點chrl7:17089983在群體中的基因型分布情況，篩 選出與香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記；
[0018] (2)應(yīng)用SPSS V22.0中的Spearman相關(guān)系數(shù)進行雙側(cè)檢驗，分析該SNP位點的基因 型與母豬每胎產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性。
[0019] (3)根據(jù)SNP位點chrl7:17089983基因型進行高產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)勢香豬的選育。
[0020] 本發(fā)明對香豬SNP位點chrl7:17089983進行基因型檢測，并對該位點的基因型與 香豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀進行相關(guān)性分析。應(yīng)用經(jīng)SPSS V22.0軟件的X2檢驗分析，得出香豬高產(chǎn) 群和低產(chǎn)群該SNP位點基因型的分布頻率差異極顯著（？〈0.001)。將3~?位點(：1^17 : 17089983的基因型與各胎次的產(chǎn)仔數(shù)進行相關(guān)性分析，應(yīng)用SPSS v22.0中的Spearman相關(guān) 系數(shù)進行雙側(cè)檢驗，得出SNP位點chrl7:17089983的基因型與第1胎、第2胎產(chǎn)仔數(shù)呈弱相關(guān) 關(guān)系(〇.2〈0〈〇.4，？〈〇.〇〇1) ;與第3胎產(chǎn)仔數(shù)呈極弱相關(guān)(〇.〇〈0〈〇.2,〇.〇1〈?〈〇.〇5)。說明不 同基因型對香豬各胎次的產(chǎn)仔數(shù)存在影響。香豬第1-3胎平均產(chǎn)仔數(shù)規(guī)律是，TT型香豬的產(chǎn) 仔數(shù)最高，CC型最低，CT型居中；ΤΤ型香豬的第1胎產(chǎn)仔數(shù)平均比CC型多1.33頭仔數(shù)，ΤΤ型香 豬的第2胎產(chǎn)仔數(shù)平均比CC型多1.81頭仔數(shù)，ΤΤ型香豬的第3胎產(chǎn)仔數(shù)平均比CC型多2.88頭 仔數(shù)。說明ΤΤ基因型的香豬的產(chǎn)仔數(shù)高于CC基因型。因此SNP位點chrl7:17089983,可作為 與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記，為香豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。
[0021]本發(fā)明的有益效果：（1)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可不受香豬年齡、性別等因素的限 制，可用于高產(chǎn)仔數(shù)香豬的早期選擇，降低香豬的選育成本。
[0022] (2)本發(fā)明建立的檢測香豬SNP位點chrl7:17089983基因型的方法準(zhǔn)確可靠，操作 簡便。
[0023] (3)香豬SNP位點chrl7:17089983基因型的檢測，為香豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記輔助選 擇技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實施例1中SNP位點chrl7:17089983基因型分型結(jié)果；
[0025]圖2為本發(fā)明實施例2中SNP位點chrl7:17089983在香豬高低產(chǎn)群體間的基因型頻 率分布。
【具體實施方式】
[0026] 以下實例對本發(fā)明做進一步的解釋，但不限定本發(fā)明的范圍，若無特別指明，實施 例中所用的技術(shù)方法和條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)方法和常規(guī)實驗條件，或按 照相關(guān)試劑廠商說明書建議的方法和條件。
[0027] 實施例1香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP標(biāo)記的檢測技術(shù)，步驟如下：
[0028] 1、基因組DNA提取
[0029] 本試驗采用購自天根生化科技(北京)有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取 試劑盒，用于從血液或組織中提取基因組DNA，具體方法如下：
[0030] 1)處理材料
[0031] 提取材料為血液時，可直接使用200yL新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，不足 200yL可加緩沖液GA補足。
[0032] 提取材料為組織時，可取50mg組織(脾組織用量應(yīng)少于10mg)打碎處理為細(xì)胞懸浮 液，然后l〇,〇〇〇rpm(ll，200Xg)離心lmin，倒盡上清，加200yL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。 [0033] 2)加入20yL蛋白酶K，漩渦混勻，提取血液基因組時，即可繼續(xù)進行下一步;提取組 織基因組時，56.0°C消化2-4h(每隔0.5h混勻一次)至組織塊消化完全；
[0034] 3)加入200yL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 · 0 °C消化lOmin;
[0035] 4)加入200yL無水乙醇，漩渦混勻；
[0036] 5)將消化液倒入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30sec，棄廢 液，將吸附柱CB3放回收集管中；
[0037] 6)向吸附柱CB3中加入500yL緩沖液⑶，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3 放回收集管中；
[0038] 7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3 放回收集管中；
[0039] 8)重復(fù)操作步驟7) -次；
[0040] 9)將吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空離心2min，棄廢液，將吸附柱CB3置于室 溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液成份；
[0041 ] 10)將吸附柱轉(zhuǎn)移到干凈的2mL離心管中，向吸附柱中部懸空加入50-200yL洗脫液 TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min;基因組DNA存在于離心管中TE溶液中，4.0°C備用 或-20.0 °C保存。
[0042] 11)為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的TE溶液再重復(fù)加入吸附柱CB3中，放 置 2min，12000rpm 離心 2min;
[0043] 2、目標(biāo)序列的擴增
[0044] 本發(fā)明中SNP位點位于chrl7 :17089983(T/C)，參考NCBI Genbank收錄的相應(yīng)序 列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計三條特異性引物，其中U1與U2為末位錨定引物U1: 5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAT-3 '，U2:5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAC-3 ' ；反向引物D3:5 ' -AAAGACTGGTAGGTCAAAGAGTATGC-3 '。03分別與U1、U2組合進行AS-PCR檢測，每個樣本分別進 行三次重復(fù)檢測，目的片段均為361bp，測序后得出目標(biāo)序列分別為SEQ ID No.l和SEQ ID No. 2〇
[0045] AS-PCR所使用的擴增體系為20yL，計為：2XTaq PCR Master Mix 10yL，10ymol/L 引物U1 或 U2 取0.2yL，1 Ομπιο 1/L 引物D3 取0.2yL，ddH20取 8.6yL，lOng/yL 基因組DNA 取 lyL。
[0046] 進行AS-PCR采用的反應(yīng)條件：1)預(yù)變性:94.0 °C 5min; 2)擴增反應(yīng):變性:94.0 °C 308〇(：，退火：60.0。(：-66.01€3086(3，延伸：72.0 1€4586(3,30個循環(huán)；72.0。(：1011^11〇
[0047] 3、AS-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測及基因型判斷
[0048] AS-PCR結(jié)束后，取5yLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳檢測，0.5yg/mL溴乙錠染色， 凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶。
[0049]每個樣品，以引物D3分別與U1、U2組合進行兩個AS-PCR檢測。若引物U1/D3,引物 U2/D3均擴增出條帶，將基因型定義為CT;若引物U1/D3擴增出36 lbp的條帶，引物U2/D3沒有 條帶出現(xiàn)，將基因型定義為CC型；若引物U1/D3檢測沒有得到條帶，引物U2/D3出現(xiàn)一條 361bp的條帶，將基因型定義為TT型（圖1)。
[0050] 實施例2SNP位點chrl7:17089983基因型與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性與檢測應(yīng)用 [00511按照實施例1的方法，以采自貴州從江縣香豬高低產(chǎn)群共654頭（高產(chǎn)129頭，低產(chǎn) 525頭)為試驗材料，以chrl7:17089983為候選SNP位點，利用AS-PCR技術(shù)檢測該SNP位點的 基因型在兩個群體中的分布情況，應(yīng)用SPSS v22.0軟件中的雙側(cè)檢驗分析該SNP位點的基 因型與每胎產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，該SNP位點在香豬高產(chǎn)群和低產(chǎn)群中，基因型的分 布頻率差異極顯著(P〈0.001)，如表1和圖2所示。
[0052] 表1SNP位點chrl7:17089983的基因型及基因頻率
[0054] 備注:香豬高產(chǎn)群的T等位基因頻率與香豬低產(chǎn)群的T等位基因頻率相比，P〈0.01 表示差異極顯著。
[0055] 應(yīng)用SPSS ν22·0中的Spearman相關(guān)分析，將SNP位點chrl7:17089983的基因型與 個體的繁殖性狀即各胎次產(chǎn)仔數(shù)和乳頭數(shù)進行相關(guān)性分析(表2)。結(jié)果顯示:該SNP位點的 基因型與香豬第1胎、第2胎產(chǎn)仔數(shù)呈弱相關(guān)關(guān)系(0.20〈0.4，？〈0.01);與第3胎產(chǎn)仔數(shù)呈極 弱相關(guān)(〇.〇〇〈〇.2,0.01〈?〈0.05)。說明不同基因型對香豬各胎次的產(chǎn)仔數(shù)存在影響 [0056] 表2SNP位點chrl7:17089983的基因型與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性分析
[0058]使用SPSS軟件統(tǒng)計出每種基因型對應(yīng)的各胎次的平均產(chǎn)仔數(shù)(表3)，表明，第1-3 胎平均產(chǎn)仔數(shù)規(guī)律是，TT型香豬的產(chǎn)仔數(shù)最高，CC型最低，CT型居中；TT型香豬的第1胎產(chǎn)仔 數(shù)平均比CC型多1.33頭仔數(shù)，TT型香豬的第2胎產(chǎn)仔數(shù)平均比CC型多1.81頭仔數(shù)，TT型香豬 的第3胎產(chǎn)仔數(shù)平均比CC型多2.88頭仔數(shù)。說明TT基因型的香豬的產(chǎn)仔數(shù)高于CC基因型。
[0059]表3不同基因型各胎次平均產(chǎn)仔數(shù)

【主權(quán)項】
1. 一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于：SNP標(biāo)記為位于香豬NCBI豬參 考基因組Sscrofa 10.2的chrl7:17089983,該SNP位點的兩種等位基因為T或C，三種基因型 分別命名為CC、TT和CT型，分別對應(yīng)于chrl7:17089983的堿基是純合的CC、TT，或雜合的CT 類型。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于：SNP標(biāo)記 的一組引物，所述的引物分別為:末位錨定引物U1:5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAT-3 '，末位 錨定引 物 U2:5'-TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAC-3' 和下游弓| 物 D3:5'_ AAAGACTGGTAGGTCAAAGAGTATGC-3'，目的序列分別為SEQ ID No.l和SEQ ID Νο·2。3. 如權(quán)利要求1-2之一所述的一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的檢測方法，其特 征在于：包括以下步驟：（1)提取待測香豬的基因組DNA; (2)以待測香豬的基因組DNA為模 板，分別利用引物U1、U2和D3,進行AS-PCR檢測，確定香豬SNP位點chrl7:17089983的基因 型；（3)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測AS-PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶并判斷基因型。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在 于:步驟(2)中進行AS-PCR所使用的擴增體系為20yL，計為:2XTaq PCR Master Mix 10yL， lOymol/L引物U1/U2 0.2yL，10ymol/L引物D3 0.2yL，ddH20 8.6yL，10ng/yL基因組DNA 1μ L;進行AS-PCR采用的反應(yīng)條件：1)預(yù)變性:94.0 °C 5min; 2)擴增反應(yīng):變性:94.0 °C 30sec，退 火：60.0。〇66.01€3086。，延伸：72.01€4586。，30個循環(huán) ；72.0。(：1011^11。5. 如權(quán)利要求1或2所述的一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP分子標(biāo)記在鑒定產(chǎn)仔數(shù)及與香 豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種中的使用方法，其特征在于:包括以下步驟：（1)采 用AS-PCR技術(shù)檢測SNP位點chrl7:17089983在群體中的基因型分布情況，篩選出與香豬產(chǎn) 仔數(shù)性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記；（2)應(yīng)用SPSS v22.0中的Spearman相關(guān)系數(shù)進行雙側(cè)檢驗，分析 該SNP位點的基因型與母豬每胎產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性；（3)根據(jù)SNP位點chrl7:17089983基因型 進行高產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)勢香豬的選育。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969890SQ201610531708
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】王嘉福, 冉雪琴, 牛熙, 王洋
【申請人】貴州大學(xué)