一種線粒體靶向超氧陰離子探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種線粒體靶向超氧陰離子探針及其制備方法。該線粒體靶向超氧陰離子探針的結(jié)構(gòu)式可為式Ⅰ或式Ⅰ′所示化合物，也可以為式Ⅱ或式Ⅱ′所示化合物。本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了一系列線粒體靶向超氧陰離子探針，本發(fā)明探針能夠定向靶向性的到達(dá)細(xì)胞的線粒體，對細(xì)胞線粒體具有高度的選擇性；本發(fā)明探針能實(shí)時(shí)和高選擇性地檢測出線粒體內(nèi)超氧陰離子的產(chǎn)生，對線粒體中其他活性氧則沒有反應(yīng)，對超氧陰離子的檢測具有專一性。
【專利說明】
一種線粒體靶向超氧陰離子探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種線粒體靶向超氧陰離子探針及其制備方法，屬于分子檢測和分子 成像領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體是一種廣泛存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，直徑在 0.5到10微米左右。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP)的主要場所，為 細(xì)胞的活動提供了能量，所以有"細(xì)胞動力工廠"之稱。除了為細(xì)胞供能外，線粒體還參與 諸如調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞程序性死亡；細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝的調(diào)控；合成膽 固醇及某些血紅素；負(fù)責(zé)細(xì)胞信息傳遞并擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。
[0003] 自由基是一些能夠獨(dú)立存在的，具有一個(gè)或多個(gè)未成對電子的原子或分子。當(dāng)兩 個(gè)電子自旋方向相反，成對在同一個(gè)軌道上，那么它們就更加穩(wěn)定。生物體內(nèi)自由基是來自 機(jī)體正常生理代謝過程和生存環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生的不穩(wěn)定中間產(chǎn)物，它是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要 信使分子，與生物體內(nèi)各種生理作用及病理現(xiàn)象密切相關(guān)。大量研究表明，動物細(xì)胞內(nèi)的自 由基有99%來自線粒體的電子傳遞鏈上。體內(nèi)重要的一類自由基是活性氧自由基，也稱為 活性氧，一般包括〇 2 ·、· 〇H、R00 ·、R0 ·等。
[0004] 活性氧，顧名思義，就是比起普通的氧分子，它們有著更高的氧化還原活性。活性 氧不僅包括一些自由基，如羥自由基（·〇Η)，超氧陰離子（0 2·)，過氧羥自由（·Η02)，過氧 自由基（R00 ·)和烷氧基自由基（R0 ·)，也包括了一些非自由基，即過氧化氫（Η202)，單線 態(tài)氧（1〇2)和次氯酸（H0C1)?；钚匝跏侵冈谏矬w內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成 自由基的過氧化物的總稱，機(jī)體內(nèi)氧化代謝可不斷形成活性氧，在一定的空間、時(shí)間和一定 的限度內(nèi)活性氧有積極的生理作用。
[0005] 自由基分為氧化性和還原性自由基，在體內(nèi)處于平衡狀態(tài)，調(diào)控體內(nèi)的氧化-還 原平衡，一旦一方過量失去平衡就會對細(xì)胞造成損傷，帶來一系列疾病。自由基可攻擊生命 大分子物質(zhì)及細(xì)胞壁，造成機(jī)體的多種損傷和病變，加速機(jī)體的衰老；自由基摧毀細(xì)胞膜， 導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生變性，使得細(xì)胞不能從外部吸收營養(yǎng)，也排泄不出細(xì)胞體內(nèi)的代謝廢物，并 喪失了對細(xì)菌和病毒的抵御能力。從而使人體免疫力低下、疲勞和器官病變。如果導(dǎo)致細(xì) 胞死亡或細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)無法代謝就會形成色素沉積，產(chǎn)生黃褐斑、蝴蝶斑、老年斑等；自由基 攻擊正在復(fù)制中的基因，造成基因突變，誘發(fā)癌癥發(fā)生；自由基氧化血液中的脂蛋白造成膽 固醇向血管壁的沉積，引起心臟病、中風(fēng)、動脈硬化、腦血栓、腦溢血、偏癱或高血壓等心腦 血管病癥。侵蝕腦細(xì)胞使人易患老年性癡呆；自由基作用于人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致膠原蛋 白酶和硬彈性蛋白酶的釋放，這些酶作用于皮膚中的膠原蛋白酶和硬彈性蛋白并使這兩種 蛋白產(chǎn)生過度交聯(lián)并降解，結(jié)果使皮膚失去彈性，出現(xiàn)皺紋及囊泡，使體內(nèi)毛細(xì)血管脆性增 加，使血管容易破裂，這可導(dǎo)致靜脈曲張，水腫等與血管通透性升高有關(guān)的疾病的發(fā)生；自 由基引起關(guān)節(jié)膜及關(guān)節(jié)滑液的降解，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎；侵蝕胰臟細(xì)胞引起糖尿?。粨p傷肝 臟器官導(dǎo)致肝炎。
[0006] 人體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的適量的活性氧是相當(dāng)重要的，它們涵蓋了不同的生命活動，諸 如在信號轉(zhuǎn)換，神經(jīng)傳遞，肌肉舒展放松及蠕動，血小板凝集，血壓調(diào)節(jié)，免疫系統(tǒng)控制，學(xué) 習(xí)和記憶，能量產(chǎn)生，細(xì)胞常規(guī)生長，重要的生命化合物的合成和機(jī)體的新陳代謝中，都發(fā) 揮了重要的作用。然而，當(dāng)活性氧產(chǎn)生過量或機(jī)體自身的抗氧化劑的量大量減少時(shí)，活性氧 就變得相當(dāng)有害了。它們通過氧化生物分子，使得細(xì)胞脂質(zhì)膜、蛋白質(zhì)組織、酶、碳水化合物 或DNA等氧化損傷，造成細(xì)胞損壞或死亡?？傊谝话慵?xì)胞環(huán)境中，活性氧對于生命體是 必不可少的，但過量的活性氧就會造成危害。
[0007] 自由基的種類很多，用來說明衰老發(fā)生機(jī)制的自由基，主要是超氧自由基、羥自由 基和類脂質(zhì)過氧化自由基。在線粒體內(nèi)膜，分子氧（〇 2)首先接受一個(gè)電子被還原成超氧自 由基（〇2)，生成的超氧再進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成H0 ·、0N00 -、R00 ·和R0 ·等活性更高的氧自由基 (R0S)。超氧自由基作用的產(chǎn)物，都是強(qiáng)氧化劑，可使類脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸氧化為類脂 過氧化物。它們都是引發(fā)脂質(zhì)過氧化自由基反應(yīng)的氧化劑，在正常情況下，由于生物體內(nèi)存 在自由基清除劑，如性激素、S0D、過氧化氫酶等使生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持相對 平衡，并參與許多正常的生理生化反應(yīng)。若自由基清除劑的合成惡性化或自由基反應(yīng)發(fā)生 紊亂，則會導(dǎo)致機(jī)體一系列的病理改變。超氧自由基能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快肌體的衰 老過程，并可誘發(fā)癌癥、心血管疾病等，嚴(yán)重危害人體健康，人體通過超氧化物歧化酶（S0D) 將其轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧氣除去。由此可見，超氧自由基是誘導(dǎo)自由基反應(yīng)鏈啟動的首要 自由基，它與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而線粒體是超氧陰離子產(chǎn)生的主要場所，能夠 定向靶向性地在超氧陰離子產(chǎn)生地線粒體中實(shí)現(xiàn)對超氧的檢測對研究自由基以及超氧引 起的相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種線粒體靶向超氧陰離子探針及其制備方法，本發(fā)明線粒 體靶向超氧陰離子探針能夠?qū)崿F(xiàn)定向靶向性檢測線粒體內(nèi)超氧陰離子檢測。
[0009] 本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)式為式I或式P，
[0011] 式I和式I '中：X M+-L-D和X M+均為線粒體靶向分子基團(tuán)；
[0012] M+為R 3P+、R3N+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基；
[0013] X 為 Cl、Br 或 I ;
[0014] L為碳原子數(shù)2~10的鏈狀烷基、_(0CH2CH2)n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直 鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；
[0015] D為-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的 任意一中：_CONH_、_CH2_NH _ 和 _C0_0_〇
[0016] 本發(fā)明中氨基酸指的是廣義上的氨基酸，即含有氨基和羧基的化合物。
[0017] 本發(fā)明上述式I所示化合物中，M+為R3P+，R為苯基；X為Br ;L為碳原子數(shù)為4 的鏈狀烷基；D為-C0-0-;即式I所示化合物的結(jié)構(gòu)式具體可如下：
[0018]
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述式I或式廠所示化合物的制備方法，該制備方法以熒 光素為原料，利用帶正電基團(tuán)可靶向跨過線粒體膜導(dǎo)入線粒體的特點(diǎn)，將帶正電荷的官能 團(tuán)結(jié)合到熒光素上，得到上述式I或式廠線粒體靶向超氧陰離子探針；
[0020] 式I的制備方法包括如下步驟：
[0021] (1)在有機(jī)溶劑I中，熒光素與二苯基次磷酰氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn)物I ;
[0024] 所述有機(jī)溶劑I為DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0025] (2)在有機(jī)溶劑II中，所述中間產(chǎn)物I與X-L-D-Y進(jìn)行反應(yīng)II，得到中間產(chǎn)物II ;
[0026]
[0027] X-L-D-Y和中間產(chǎn)物II中，X為-Cl、-Br、-I或-H;L為碳原子數(shù)2~10的鏈狀烷 基、_(0CH2CH 2)n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸 基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D為-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基 團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0- ;Y為-OH、-Cl、-Br或-I ;
[0028] 所述有機(jī)溶劑II為DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0029] (3)在有機(jī)溶劑III中，所述中間產(chǎn)物II與Μ進(jìn)行反應(yīng)III，得到式I所示化合物；
[0030] 所述Μ中，Μ為R3P、R3N，R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基；
[0031] 所述有機(jī)溶劑III為DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0032] 式I '的制備方法包括如下步驟：
[0033] (1)在有機(jī)溶劑I中，熒光素與二苯基次磷酰氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn)物I ;
[0034]
[0035] 所述有機(jī)溶劑I為DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0036] (2)在有機(jī)溶劑III中，所述中間產(chǎn)物I與MX進(jìn)行反應(yīng)ΙΙΓ，得到式I '所示化合 物；
[0037] 所述MX中，M為R3P、R3N，R為碳原子數(shù)2-6的鏈狀烷基或苯基 ；X為-Cl、-Br或-I;
[0038] 所述有機(jī)溶劑III為DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0039] 上述的制備方法，式I的制備方法步驟（1)中，所述熒光素與所述二苯基次磷酰 氯的摩爾比可為5~1 :1，具體可為2 :1 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~120°C，時(shí)間為8~ 40h ；
[0040] 步驟（2)中，所述中間產(chǎn)物I與所述X-L-D-Y的摩爾比可為1 :1~5,具體可為1 : 1 ;所述反應(yīng)II的溫度為〇~50°C，時(shí)間為8~20h ;
[0041] 步驟⑶中，所述中間產(chǎn)物II與所述Μ的摩爾比可為1 :1~5,具體可為1 :3 ;所 述反應(yīng)III的溫度均為30~120°C，時(shí)間均為10~40h ;
[0042] 式I '的制備方法步驟（1)中，所述熒光素與所述二苯基次磷酰氯的摩爾比可為 5~1 :1 ;所述反應(yīng)I的溫度可為40~120。。，時(shí)間可為8~40h ;
[0043] 步驟⑵中，所述中間產(chǎn)物I與MX的摩爾比可為1 :1~5 ;所述反應(yīng)ΙΙΓ的溫度 可為30~120°C，時(shí)間均可為10~40h。
[0044] 上述的制備方法，所述反應(yīng)I、所述反應(yīng)II、所述反應(yīng)III和所述反應(yīng)ΙΙΓ結(jié)束后均 包括冷卻至0~20°C的步驟。
[0045] 本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)式為式II或式II'，
[0046]
[0047] 式II和式II '中，XM+-L-D、XM+、XM' +_L' -D'和XM' +均為線粒體靶向分子 基團(tuán)；
[0048] M+和，+均為R 3P+、R3N+，R為碳原子數(shù)2-6的鏈狀烷基或苯基；
[0049] X 為 Cl、Br、I ;
[0050] L和L'均為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(0CH2CH2) n-或2~10個(gè)氨基酸基 團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；
[0051] D和IV均為-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述 基團(tuán)中的任意一中：-C0NH-、-CH 2-NH-和-C0-0-，或IV與中的端位基團(tuán)共同形成下述 基團(tuán)中的任意一中：-conh-、-ch2-nh-和-co-o- 〇
[0052] 本發(fā)明上述式II所示化合物，M+為R3P+，R為甲基；X為Br ;L為-CH2CH2C0NHCH2CH 2C0NHCH(CH(CH3)2)-;D 為-C〇-〇-;M，+為 R3P+，R 為苯基；X，為 Br ;L，為碳原子數(shù) 3 的 鏈狀烷基；D'為-C0NH-;即式I所示化合物的結(jié)構(gòu)式具體可如下：
[0053]
[0054] 本發(fā)明還提供了上述化合物式II或式II'的制備方法，式II的制備方法包括如下 步驟：
[0055] (1)在有機(jī)溶劑IV中，在縮合劑的作用下4-硝基熒光素與X-L-D-Y進(jìn)行反應(yīng)IV，得 到中間產(chǎn)物III，
[0056]
[0057] X-L-D-Y和中間產(chǎn)物III中，X為-Cl、-Br或-I ;L為碳原子數(shù)2~10的鏈狀烷 基、_(0CH2CH2)n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸 基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D為-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基 團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0- ;Y為-OH、-Cl、-Br或-I ;
[0058] 所述有機(jī)溶劑IV為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0059] 所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺（EDC)、可溶于水的碳二亞胺（DCC)、4_二甲氨基 吡啶（DMAP)或0-苯并三氮唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸（TBTU);
[0060] (2)在有機(jī)溶劑V中，所述中間產(chǎn)物III與二苯基次磷酰氯進(jìn)行反應(yīng)V，得到中間產(chǎn) 物IV，
[0061]
[0062] 中間產(chǎn)物IV中，X為-Cl、-Br或-I ;L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、_(0CH2CH2) n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10 個(gè)氨基酸脫水縮合；D為-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述 基團(tuán)中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0-;
[0063] 所述有機(jī)溶劑V為DMS0、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0064] (3)在有機(jī)溶劑VI中，所述中間產(chǎn)物IV與R-X'進(jìn)行反應(yīng)VI，得到中間產(chǎn)物V，
[0065]
[0066] R-X'和中間產(chǎn)物V中，M+為R3P+、R3N +，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基； X為Cl、Br或I ;X'為-Cl、-Br或-I ;L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、_(0CH2CH2) n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10 個(gè)氨基酸脫水縮合；D為-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述 基團(tuán)中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0-;
[0067] 所述有機(jī)溶劑VI為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0068] (4)在有機(jī)溶劑W中，所述中間產(chǎn)物V進(jìn)行反應(yīng)VL還原劑將硝基還原為氨基，得 到中間產(chǎn)物VI，
[0069]
[0070] 中間產(chǎn)物VI中，M+為R3P+、R 3N+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基；X為 Cl、Br或I ;L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、_(0CH2CH2)n-或2~10個(gè)氨基酸基 團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合； D為-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一 中：-C0NH-、-CH 2-NH-和-C0-0-;
[0071] 所述有機(jī)溶劑W為DMS0、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0072] 所述還原劑為LiAlH4;
[0073] (5)在有機(jī)溶劑VID中，所述中間產(chǎn)物VI與M' -L' -D' -Y進(jìn)行反應(yīng)W，得到式II，
[0074] M' -1/ -D' -Y中，M'為-PR3、-NR3, R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或 苯基；為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(0CH2CH2) n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組 成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D' 為-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D'與L'中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一 中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0- ;Y 為-OH、-Cl、-Br 或-I ;
[0075] 所述有機(jī)溶劑W為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種。
[0076] 式II'的制備方法包括如下步驟：
[0077] (1)在有機(jī)溶劑V中，所述4-硝基熒光素與二苯基次磷酰氯進(jìn)行反應(yīng)V'，得到 中間產(chǎn)物W，
[0078]
[0079] 所述有機(jī)溶劑V '為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0080] (2)在有機(jī)溶劑VI中，所述中間產(chǎn)物IV與M-X'進(jìn)行反應(yīng)VT，得到中間產(chǎn)物 V、
[0081]
[0082] 11'和中間產(chǎn)物\^中1為1?3?、1?3礦，1?為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基3 ; M*R3P、R3N+，R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基3;X為Cl、Br或I ;X'為-Cl、-Br 或-I ;
[0083] 所述有機(jī)溶劑VI為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0084] (3)在有機(jī)溶劑W中，所述中間產(chǎn)物V進(jìn)行反應(yīng)W，還原劑將硝基還原為氨基， 得到中間產(chǎn)物VT，
[0085]
[0086] 中間產(chǎn)物VT中，M+為R3P+、R 3N+，R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基；X為C1、 Br 或 I ;
[0087] 所述有機(jī)溶劑W為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0088] 所述還原劑為LiAlH4;
[0089] (4)在有機(jī)溶劑VID中，所述中間產(chǎn)物VT與Μ' X'進(jìn)行反應(yīng)VDT，得到式II'，
[0090] Μ' X'中，M'為R3P、R3N，R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基，X'為-Cl、-Br 或-I ;X 為 Cl、Br 或 I ;
[0091] 所述有機(jī)溶劑W為DMS0、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種。
[0092] 上述的制備方法，式II的制備方法步驟（1)中，所述4-硝基熒光素、所述X-L-D-Y 與所述縮合劑的摩爾比為1~3 :1 :1~6,具體可為3 :1 :3. 6 ;所述反應(yīng)IV的溫度為0~ 40°C，時(shí)間為5~40h，具體可為10h ;
[0093] 步驟（2)中，所述中間產(chǎn)物III與所述二苯基次磷酰氯的摩爾比為1~3 :1，具體可 為1 :1. 5 ;所述反應(yīng)V的溫度為40~120°C，具體可40~100°C，時(shí)間為8~40h，具體可為 20h ；
[0094] 步驟⑶中，所述中間產(chǎn)物IV與所述R-X'的摩爾比為1 :3~10,具體可為1 :5 ; 所述反應(yīng)VI的溫度為40~120°C,時(shí)間為8~40h,具體可為15h ;
[0095] 步驟⑷中，所述中間產(chǎn)物V與所述還原劑的摩爾比為1 :1~3,具體可為1 :2 ; 所述反應(yīng)W的溫度為-40~0°C，具體可為-20°c，時(shí)間為8~40h，具體可為15h ;
[0096] 步驟（5)中，所述中間產(chǎn)物VI與所述，-17 -Y的摩爾比為1 :1~5,具體 可為1 :1. 5 ;所述反應(yīng)VID的溫度為10~50°C，時(shí)間為15~40h ;
[0097] 式II'的制備方法步驟（1)中，所述4-硝基熒光素與所述二苯基次磷酰氯的摩爾 比為1~3 :1 ;所述反應(yīng)V的溫度為40~120°C，時(shí)間為8~40h ;
[0098] 步驟⑵中，所述中間產(chǎn)物IV與所述M-X'的摩爾比為1 :3~10 ;所述反應(yīng)VT 的溫度為80~120°C，時(shí)間為20~40h ;
[0099] 步驟⑶中，所述中間產(chǎn)物V與所述還原劑的摩爾比為1 :1~3 ;所述反應(yīng)VT 的溫度為-40~0°C，時(shí)間為8~40h ;
[0100] 步驟⑷中，所述中間產(chǎn)物VT與所述Μ' X'的摩爾比為1:1~5;所述反應(yīng)VT 的溫度為10~40°C，時(shí)間為15~40h。
[0101] 上述的制備方法，所述反應(yīng)IV結(jié)束后還包括冷卻至0~10°C的步驟；
[0102] 所述反應(yīng)VI、所述反應(yīng)VT、所述反應(yīng)νπ和所述反應(yīng)w結(jié)束后均包括冷卻至 0~20°C的步驟；
[0103] 所述反應(yīng)V、所述反應(yīng)V'、所述反應(yīng)W和所述反應(yīng)VT結(jié)束后均包括冷卻至 0~30°C的步驟。
[0104] 本發(fā)明還提供了上述式I或式II所示化合物在制備線粒體靶向超氧自由基探針 中的應(yīng)用。
[0105] 本發(fā)明還提供了上述式I或式II所示化合物在線粒體靶向超氧自由基檢測和線 粒體靶向成像中的應(yīng)用。
[0106] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0107] (1)本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了一系列線粒體靶向超氧陰離子探針。
[0108] (2)本發(fā)明探針能夠定向靶向性的到達(dá)細(xì)胞的線粒體，對細(xì)胞線粒體具有高度的 選擇性。
[0109] (3)本發(fā)明探針能實(shí)時(shí)和高選擇性地檢測出線粒體內(nèi)超氧陰離子的產(chǎn)生，對線粒 體中其他活性氧則沒有反應(yīng)，對超氧陰離子的檢測具有專一性。
[0110] (4)本發(fā)明制備方法簡單可靠，能得到一系列線粒體靶向超氧陰離子探針的化合 物。
【附圖說明】
[0111] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制備線粒體靶向超氧自由基探針的合成路線圖。
[0112] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針的核磁氫譜圖。
[0113] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針的核磁碳譜圖。
[0114] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針的高分辨質(zhì)譜圖。
[0115] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針與超氧化鉀的檢測試驗(yàn) 中，熒光探針的熒光強(qiáng)度隨超氧化鉀濃度的變化圖。
[0116] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針的活性氧選擇性實(shí)驗(yàn) 中，探針與不同活性氧作用的柱狀圖。
[0117] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針對H9C2的細(xì)胞毒性中， 不同濃度探針對H9C2的細(xì)胞毒性的柱形圖。
[0118] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)超氧檢測和線 粒體靶向定位試驗(yàn)成像照片，其中圖a為無刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖b為 無刺激的本發(fā)明線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，圖c為無刺激的線 粒體探針MitoTracker-Red成像的照片，圖d為無刺激的Mito-Superoxide-trackerl和沒 有刺激的MitoTracker-Red疊加后的照片，圖e為加百草枯刺激的線粒體探針Hochest成 像的照片，圖f為加百草枯刺激的加百草枯刺激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，圖g為加百草枯刺激的線粒體探針MitoTracker-Red成像的照片，圖h為加 百草枯刺激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 1和MitoTracker-Red疊加后的照 片。
[0119] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)多柔比星刺 激產(chǎn)生超氧檢測試驗(yàn)，其中圖a為無刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖b為無刺 激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，圖c為無刺激的線粒體探針 Mit〇-S0X成像的照片，圖d為無刺激的Mito-Superoxide-tracker 1和Mit〇-S0X疊加 成像的照片，圖e為多柔比星刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖f為線粒體探針 Mito-Superoxide-tracker 1受多柔比星刺激成像的照片，圖g為線粒體探針Mit〇-S0X 受多柔比星刺激成像的照片，圖h為受多柔比星刺激的Mito-Superoxide-tracker 1和 Mito-SOX加后的照片。
[0120] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例2中制備線粒體靶向超氧自由基探針的合成路線圖。
[0121] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例2制備的線粒體靶向超氧自由基探針與超氧化鉀的檢測試 驗(yàn)中，熒光探針的熒光強(qiáng)度隨超氧化鉀濃度的變化圖。
[0122] 圖12為本發(fā)明實(shí)施例2制備的線粒體靶向超氧自由基探針對H9C2的細(xì)胞毒性 中，不同濃度探針對H9C2的細(xì)胞毒性的柱形圖。
[0123] 圖13為本發(fā)明實(shí)施例2制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)超氧檢測和 線粒體靶向定位試驗(yàn)成像照片，其中圖a為沒有刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖 b為沒有刺激的本發(fā)明線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，圖c為沒有 刺激的線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖d為沒有刺激的Mit〇-Superoxide-tracker2 和Mito-SOX疊加后的照片，圖e為加 D0X刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖f為 加 D0X刺激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，圖g為加 D0X刺激的 線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖h為加 D0X刺激后的Mito-Superoxide-tracker 2和 Mito-SOX疊加后的照片。
[0124] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例2制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)多柔比星 刺激產(chǎn)生超氧檢測試驗(yàn)，其中圖a為線粒體探針Hochest成像的照片，圖b為線粒體探針 Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，圖c為線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖d 為線粒體探針沒有刺激的Mito-Superoxide-tracker 2和Mito-SOX疊加后成像的照片，圖 e為線粒體探針Hochest成像的照片，圖f為線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 2成 像的照片，圖g為線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖h為線粒體探針在多柔比星刺激后 Mito-Superoxide-tracker 2 和 Mito-SOX 疊加后的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0125] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0126] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0127] 實(shí)施例1、線粒體革巴向超氧自由基探針Mito-Superoxide-tracker 1的制備和應(yīng) 用
[0128] ( 一）、線粒體革巴向超氧自由基探針Mito-Superoxide-tracker 1的制備
[0129] 按照如圖1所示的合成路線制備線粒體靶向超氧自由基探針 Mito-Superoxide-tracker 1〇
[0130] (1)將熒光素溶解在THF中，在20~80°C下慢慢滴加二苯磷酰氯到反應(yīng)液中，熒 光素與二苯磷酰氯的摩爾比為2 :1，在30~80°C攪拌反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到20°C，蒸干 有機(jī)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物I。
[0131] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下"H-NMRGOOMHz, DMS0, TMS) : δ 8. 00-7. 98 (d, J = 7. 2Hz ,1H), 7. 95-7. 90 (m, 4H), 7. 78-7. 75 (t, J = 7. 2Hz, 1H), 7. 73-7. 69 (t, J = 7. 2Hz, 1H) ,7. 65-7. 62 (t, J = 7. 2Hz,2H), 7. 60-7. 55(m, J = 7. 2Hz, 4H), 7. 33-7. 31 (m, 1H), 7. 27-7. 25(d, J = 7. 6Hz, 1H) ,7. 06-7. 04(d, J = 7. 2Hz, 1H), 6. 77-6. 75 (d, J = 8. 8Hz ，lH)，6.69-6.67(m，lH)，6.56-6.54(t，J = 7.6Hz，2H) ;13C 匪R(400MHz，DMS0，TMS) :δ 169. 0, 160. 1, 152. 7, 151. 9, 151. 6, 136. 2, 133. 5, 132. 0, 131. 9, 131. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 6, 129. 5, 126. 3, 125. 3, 124. 5, 116. 0, 113. 6, 109. 6, 102. 7, 82. 4 ；m/z (HRMS) :Calcd. M-lfor C32H2006P 531. 10030, found 531. 09995〇
[0132] 經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定所合成的化合物確為中間產(chǎn)物I。
[0133] (2)將中間產(chǎn)物I溶解在THF中，在-10~10°C下慢慢滴加5-溴戊酰氯到反應(yīng)液 中，中間產(chǎn)物I與5-溴戊酰氯的投料摩爾比為1 :1，在-10~10°C攪拌反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束 冷卻到20°C，蒸干反應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物II。
[0134] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：1!1匪1?(4001!^，]^0!1，了]\^):3 8.02-8.01((1 ,J = 7. 2Hz, 1H) , 7. 94-7. 89 (m, J = 8. 4Hz, 4H) , 7. 77-7. 69 (m, 2H) , 7. 65-7. 62 (m, 2H) , 7. 58-7. 53 (m, 4H) , 7. 26-7. 25 (m, 1H) , 7. 19-7. 17 (d, J = 7.6Hz, 1H) , 7. 15-7. 14 (m, 1H) , 7. 01-6. 99 (dt, J = 8. 8Hz, 1H) , 6. 88-6. 86 (dd, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 82-6. 76 (dd, J = 8. 8Hz, 2H), 3. 51-3. 48 (t, J = 6. 4Hz, 2H), 2. 66-2. 62 (t, J =7. 61Hz, 2H), 2. 00-1. 93 (m, 2H), 1. 90-1. 82 (m, 2H) ；13C NMR (400MHz, DMSO, TMS) :δ 171. 4, 169. 4, 152. 7, 152. 4, 152. 2, 151. 6, 151. 3, 135. 4, 133. 0, 131. 4, 130. 1, 129. 2, 12 8. 6, 125. 9, 124. 6, 123. 7, 117. 9, 116. 9, 116. 2, 115. 7, 110. 1, 108. 9, 81. 6, 32. 5, 32. 3, 31. 6 ，22. 9 ;m/z (HRMS) :Calcd. M+Na, for C37H2SBrNa07P 717. 06482, found717. 06484。
[0135] (3)將中間產(chǎn)物II溶解在CH3CN中，在80°C下慢慢加三苯基磷到反應(yīng)液中，中間產(chǎn) 物II與三苯基磷的投料摩爾比為1 :3,在80°C攪拌反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到20°C，蒸干反 應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得產(chǎn)物Mito-Superoxide-tracker 1。
[0136] 如圖2(核磁氫譜）、圖3(核磁碳譜）中和圖4(高分辨質(zhì)譜）所示，結(jié)構(gòu)確證結(jié)果 如下： 1!1匪1?(4001抱，]^0!1，丁]^):3 8.03-8.01((1，了 = 7.6抱，1!1)，7.94-7.92(111，1!1)，7.92-7. 91 (d, J = 4. 8Hz, 2H), 7. 89-7. 87 (d, J = 9. 2Hz, 2H), 7. 86-7. 85 (d, J = 6. 0Hz, 2H), 7. 85-7. 84 (m, 1H), 7. 83-7. 81 (m, 3H), 7. 79-7. 78 (m, 2H), 7. 76-7. 74 (m, 7H), 7. 72-7. 70 (m, 2H), 7. 66-7. 62 (m, 2H), 7. 57-7. 53 (m, 4H), 7. 28-7. 27 (m, 1H), 7. 19-7. 17 (d, J = 7. 6Hz, 1H), 7. 04-7. 03 (m, 1H), 7. 01-6. 99 (dd, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 79-6. 78 (m, 2H), 3. 51-3. 44 (m, 2H), 2. 69-2. 66(t, J = 7. 2Hz,2H), 1.97-1. 92 (t,J = 7. 2Hz,2H), 1.85-1. 75 (m,2H) ;13C NMR (400MHz, DMS 0, TMS) : 171. 5, 171. 1, 169. 3, 152. 6, 152. 2, 151. 5, 151. 2, 135. 6, 134. 9, 133. 4, 133. 3, 133. 1, 131. 4, 130. 2, 129. 2, 128. 8, 128. 7, 128. 6, 125. 8, 124. 7, 123. 7, 118. 8, 117. 9, 117. 0, 116. 6, 116. 3, 110. 0, 108. 8, 81. 6, 32. 4, 25. 2, 21. 4, 19. 4 ；m/z (HRMS) :Calcd. M-Br, for C55H4307P28 7 7 . 24 7 8 5, found 877. 24737。
[0137] 由圖2 (核磁氫譜）、圖3 (核磁碳譜）中和圖4 (高分辨質(zhì)譜），可確認(rèn)本實(shí)施例制 備得到的化合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0138]
[0139] (二）應(yīng)用
[0140] (1)線粒體靶向超氧自由基探針與超氧化鉀的檢測試驗(yàn)
[0141] 將（一）中制備的探針 Mito-Superoxide-Tracker 1 溶解在 DMS0 中，配成 ImM 溶液待用；超氧化鉀溶解在DMS0中，配成ImM溶液待用，再用DMS0稀釋成ΙμΜ溶液； 取 8 份 10 μ L 的 ImM 的 Mito-Superoxide-Tracker 1 的 DMS0 溶液，各溶解在 500 μ L 憐 酸鹽緩沖溶液（PBS，磷酸根離子的濃度0. 1Μ，pH = 7.4)中，然后分別加入0、10、20、 40、80、200、400和800111^體積1111超氧化鉀溶液，最后均用？85(磷酸根離子的濃度 0. 1M，pH = 7. 4)定容至lml溶液，分別得到濃度為0、10、20、40、80、200、400和800nM的 超氧化鉀溶液，反應(yīng)5min，檢測。檢測結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，線粒體靶向超氧自 由基探針Mito-Superoxide-Tracker 1的突光強(qiáng)度隨超氧化鉀濃度的增加而增強(qiáng)，突 光強(qiáng)度增強(qiáng)，說明Mito-Superoxide-Tracker 1的量減少與超氧的加入量成正比，證明 Mito-Superoxide-Tracker 1能與超氧化鉀反應(yīng)，與超氧化鉀的量減少成正比。
[0142] (2)線粒體靶向超氧自由基探針的活性氧選擇性實(shí)驗(yàn)
[0143] 將（一）中制備的探針 Mito-Superoxide-Tracker 1 溶解在 DMS0 中，配成 ImM 溶液待用；將活性氧〇2 ?、甘肽谷胱（GSH)、次氯酸鈉（NaCIO)、過氧化氫（H202)、羥自由基 (·0Η)和叔丁基過氧化氫（t-Bu00H)配成ImM PBS，用ImM PBS溶液作為對照組（control); 取 7 份 10 μ L 的 ImM 的 Mito-Superoxide-Tracker 1 的 DMS0 溶液溶解在 500 μ L PBS (濃 度0. 1M，pH= 7.4)中，分別加入5yL上述不同活性氧溶液，用PBS定容至lOOOyL，避光 孵育5min ;然后將孵育好的上述反應(yīng)液在熒光檢測器下，用490nm的光激發(fā)，收集530nm處 突光強(qiáng)度。檢測結(jié)果如圖6所示，由圖6可知，Mito-Superoxide-Tracker 1能選擇性地與 超氧陰離子反應(yīng)，而與其他活性氧則不反應(yīng)。
[0144] (3)細(xì)胞毒性測試
[0145] 1)接種細(xì)胞：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔 1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μ L。
[0146] 2)培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)24h。
[0147] 3)加藥：將本實(shí)施例制備的探針溶解在培養(yǎng)基中，加入96孔板，每孔體積200 μ L， 探針的濃度分別為 12. 511]?、2511]\1、5011]\1、10011]\1、30011]\1、50011]\1、100011]\1和 500011]\1，不加探針的 為對照組（con)，培養(yǎng)24h。
[0148] 4)呈色：培養(yǎng)24天后，每孔加 MTT溶液（5mg/mL用pH為7. 4的PBS配制）20 μ L， 繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)；小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔 內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μ L DMS0,振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
[0149] 5)比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，如 圖7所示，以探針的濃度為橫坐標(biāo)，490nm處熒光吸收值為縱坐標(biāo)繪制曲線，由圖7可知，證 明本發(fā)明探針在10 μ Μ時(shí)幾乎沒有顯示出細(xì)胞毒性。
[0150] (4)細(xì)胞超氧檢測共聚焦成像
[0151] 1)按標(biāo)準(zhǔn)操作法培養(yǎng)好H9C2小鼠心肌細(xì)胞待用。
[0152] 2)分別按每孔1萬個(gè)的密度將細(xì)胞種在confocal皿內(nèi)，加2ml 1640培養(yǎng)基貼壁 培養(yǎng)24h，取三份放置于三個(gè)培養(yǎng)皿中，分別按照3)-5)進(jìn)行三種培養(yǎng)。
[0153] 3)取細(xì)胞核靶向探針Hochest溶解在PBS中，稀釋成2ug/ml于培養(yǎng)基中，加入到 細(xì)胞中培養(yǎng)30min，移走藥液，用PBS洗滌一遍。
[0154] 4)取制備的探針Mito-Superoxide-Tracker 1溶解在PBS中，配置成10 μ Μ溶液， 稀釋成800ηΜ的培養(yǎng)基中，加入到細(xì)胞中培養(yǎng)30min，移走藥液，用PBS洗滌一遍。
[0155] 5)線粒體超氧探針MitoTracker-Red配成10nM培養(yǎng)液，加入到細(xì)胞中培養(yǎng) 30min。移走藥液，用PBS洗滌一遍。
[0156] 6)在上述三個(gè)皿中分別加培養(yǎng)基稀釋好的10 μ Μ的百草枯、10 μ Μ的D0X、30mM的 高濃度葡萄糖，孵育30min，移走藥液，PBS洗滌一遍。
[0157] 7)加藥的細(xì)胞在激光共聚焦下用405nm、488nm和559nm同時(shí)激發(fā)，結(jié)果如圖8所 示，由圖8可知，本發(fā)明制備的探針的綠色突光與線粒體成像探針MitoTracker-Red的紅色 熒光能夠很好的重合疊加，證明本發(fā)明的探針能選擇性地在線粒體成像。
[0158] (5)線蟲成像測試
[0159] 1)按標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)好線蟲待用，待線蟲長到成年且生長狀態(tài)良好，用M9溶液洗出 部分線蟲待用。
[0160] 2)取本實(shí)施例制備得到的探針溶解在M9溶液中，配置成800nM溶液，加入到線蟲 中培養(yǎng)30min。
[0161] 3)線粒體成像探針Mito - SOX配成1 μ Μ培養(yǎng)液，加入到線蟲中培養(yǎng)30min。
[0162] 4)在加有線蟲的同時(shí)進(jìn)行步驟2)和3)培養(yǎng)皿各個(gè)3個(gè)中分別加藥，即加入培養(yǎng) 基稀釋好的50 μ Μ的百草枯，孵育30min，移走藥液，PBS洗滌一遍。
[0163] 5)將加藥的線蟲在激光共聚焦下用488nm和559nm同時(shí)激發(fā)，結(jié)果如圖9所示，由 圖9可知，本發(fā)明的探針的綠色熒光與線粒體成像探針Mito - S0X的紅色熒光能夠很好的 重合疊加，證明我們發(fā)明的探針能選擇性地在線粒體成像。
[0164] 實(shí)施例2、線粒體革巴向超氧自由基探針Mito-Superoxide-tracker 2的制備和應(yīng) 用
[0165] 按照如圖10所示的合成路線制備線粒體靶向超氧自由基探針 Mit〇-Superoxide-tracker 2〇
[0166] ( 一）線粒體革巴向超氧自由基探針Mito-Superoxide-tracker 2的制備
[0167] (1)將4-硝基熒光素溶解在THF中，在20°C下慢慢滴加三肽到反應(yīng)液中，按4-硝 基熒光素與三肽的摩爾比為3 :1投料，加入EDC縮合劑，4-硝基熒光素與縮合劑按1 :1. 2 投料，在0~40°C攪拌反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到0~10°C，蒸干反應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié) 晶分離純化得中間產(chǎn)物III。
[0168] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：? NMR(300MHz，DMS0, TMS) : δ 8. 65(s, 2H), 8. 5 1 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H) , 8. 32 (s, 1H) , 8. 18 (s, 1H) , 7. 6 5-7.60(d,J = 7. 5Hz, 1H) , 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H) , 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 2. 62-2. 51 (t, J =7. 0Hz, 1H) , 0. 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ；13C NMR (300MHz, DMS0, TMS) :δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 133. 5, 130. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1，18. 9 ;m/z (HRMS) :Calcd. M，F(xiàn)or C31H30N4010618. 24, found 618. 6478。
[0169] (2)將中間產(chǎn)物III溶解在THF中，在40~60°C下慢慢滴加二苯磷酰氯到反應(yīng)液 中，中間產(chǎn)物III與二苯磷酰氯的投料摩爾比為1 :1. 5,在40~100°C攪拌反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié) 束攪拌冷卻到25°C，蒸干反應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物IV。
[0170] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下"H NMR (300MHz, DMS0, TMS): δ 8.65 (s，2H), 8.51 (m，J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 2. 62-2. 51 (t, J = 7. OHz, 1H), 0. 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ；13C NMR (300MHz, DMSO, TMS) : δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125 .8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/ z (HRMS) :Calcd. M, for C43H39N40nP 818. 20, found 818. 7653〇
[0171 ] (3)將中間產(chǎn)物IV溶解在THF中，在60°C下慢慢滴加溴甲烷到反應(yīng)液中，中間產(chǎn)物 IV與溴甲烷的投料摩爾比為1 :5,在40~80°C攪拌反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到10~20°C， 蒸干反應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物V。
[0172] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下"H NMR (300MHz, DMSO, TMS): δ 8.65 (s，2H), 8.51 (m，J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 9 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 68-3. 58(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35 (t, J =7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 30-3. 28 (s, 9H), 2. 62-2. 51 (t, J = 7. 0Hz, 1H), 0· 98-0. 82(d, J = 7. 5Hz, 6H) ;13C 匪R(300MHz, DMS0, TMS) : δ 173. 3, 169. 8， 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 8, 129. 5, 129. 2 ,128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 54. 1, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/z (HRMS) :Calcd. M, for C46H46BrN40nP 940. 21, found 941.7756。
[0173] (4)將中間產(chǎn)物V溶解在THF，在-40~0°C下將LiAlH^g慢加入到反應(yīng)液中，中間 產(chǎn)物V與LiAlH 4&投料摩爾比為1 :2,在-20°C攪拌反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到10~20°C， 蒸干反應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物VI。
[0174] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：? NMR(300MHz, DMS0, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 51 (m, J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98(d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J =7. 5Hz, 1H), 5. 28 (s, 2H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H) , 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 30-3. 28 (s, 9H)，2. 62-2. 51 (t, J = 7. 0Hz, 1H)，0· 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ;13C NMR(300MHz, DMS0, TMS ):δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 1 29. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 54. 1, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/z (HRMS) :Calcd. M, for C46H48BrN409P 910. 23, found 911. 7936。
[0175] (5)將中間產(chǎn)物VI溶解在THF中，在10~40°C下將三苯基磷丁羧酸慢慢加入到反 應(yīng)液中，中間產(chǎn)物VI與三苯基磷丁羧酸的投料摩爾比為1 :1. 5,加入DCC縮合劑，中間產(chǎn)物 VI與縮合劑投料摩爾比為1 :1. 5,在10~50°C攪拌反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到25°C，蒸干反 應(yīng)溶劑，經(jīng)柱層析和重結(jié)晶分離純化得目標(biāo)探針Mito-Superoxide-tracker 2。
[0176] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：? NMR(300MHz, DMSO, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 51 (m, J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 36-7. 29 (d, J = 7. 5Hz, 3H), 7. 30-7. 24 (d, J = 7. 5Hz, 6H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 12-7. 03 (d, J = 7. 5Hz, 6H), 7. 03-6. 98(d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J =7. 5Hz, 1H), 5. 28 (s, 2H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H) , 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 30-3. 28 (s ,9H), 2. 62-2. 51 (t, J = 7. 0Hz, 1H), 2. 46-2. 38 (t, J = 7. 0Hz, 2H), 2. 39-2. 30 (t, J = 7. 0Hz, 2H), 1. 70-1. 59 (m, J = 7. 0Hz, 2H), 0. 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ；13C NMR(300MHz,D MS0, TMS) : δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107 .7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 54. 1, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/z (HRMS) :Calcd. M, for C68H68Br2N40 10P21320. 36, found 1321. 6839〇
[0177] 由上述譜圖數(shù)據(jù)，可確認(rèn)本實(shí)施例制備得到的化合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0178]
[0179] (二）應(yīng)用
[0180] (1)線粒體靶向超氧自由基探針與超氧化鉀的檢測試驗(yàn)
[0181] 與實(shí)施例1中測定方法相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，由圖11可知，線粒體靶向超 氧自由基探針Mito-Superoxide-Tracker 2的突光強(qiáng)度隨超氧化鉀濃度的增加而增強(qiáng)， 突光強(qiáng)度增強(qiáng)說明Mito-Superoxide-Tracker 2的量減少與超氧的加入量成正比，證明 Mito-Superoxide-Tracker 2能與超氧化鉀反應(yīng)，與超氧化鉀的量減少成正比。
[0182] (2)細(xì)胞毒性測試
[0183] 與實(shí)施例1中測定方法相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，5000nM時(shí) Mito-Superoxide-Tracker 2的細(xì)胞毒性很小，適合生物學(xué)應(yīng)用。
[0184] (3)細(xì)胞超氧檢測共聚焦成像
[0185] 與實(shí)施例1中測定方法相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示，Mito-Superoxide-Tracker 2 能高度選擇性地聚集在細(xì)胞線粒體中，并對不同刺激條件下產(chǎn)生的超氧具有靈敏地響應(yīng)。
[0186] (4)線蟲成像測試
[0187] 與實(shí)施例1中測定方法相同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示，Mito-Superoxide-Tracker 2 也能監(jiān)測到線蟲細(xì)胞受刺激產(chǎn)生的超氧陰離子。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，其結(jié)構(gòu)式為式I或式I'，式I和式I '中；X M+-L-D和X M+均為線粒體祀向分子基團(tuán)； M+為R RsN+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基； X為Cl、化或I ; L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈， 其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合； D為-CONH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意 一種；-CONH-、-邸2-畑-和-CO-O-。2. 權(quán)利要求1所述化合物式I或式I '的制備方法，式I的制備方法包括如下步驟： (1)在有機(jī)溶劑I中，英光素與二苯基次磯醜氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn)物I ;所述有機(jī)溶劑I為DMS0、DMF、THF、甲醇、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； 似在有機(jī)溶劑II中，所述中間產(chǎn)物I與XA-D-Y進(jìn)行反應(yīng)II，得到中間產(chǎn)物II ;XA-D-Y和中間產(chǎn)物II中，X為-C1、-Br或-I ;L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀焼 基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸 基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D為-C0NH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基 團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一種；-C0NH-、-CH2-NH-和-CO-O- ;Y為-〇H、-Cl、-Br或-I ; 所述有機(jī)溶劑II為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (3)在有機(jī)溶劑III中，所述中間產(chǎn)物II與M進(jìn)行反應(yīng)III，得到式I所示化合物； 所述M中，M為RsP、RsN, R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基； 所述有機(jī)溶劑111為0150、01尸、1'邸、甲醇、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； 式I '的制備方法包括如下步驟： (1) 在有機(jī)溶劑I中，英光素與二苯基次磯醜氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn)物I ;所述有機(jī)溶劑I為DMSO、DMF、THF、甲醇、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (2) 在有機(jī)溶劑III中，所述中間產(chǎn)物I與MX進(jìn)行反應(yīng)Iir，得到式I '所示化合物； 所述MX中，M為RsP、RsN, R為碳原子數(shù)2~6的鏈狀烷基或苯基；X為-Cl、-Br或-I ; 所述有機(jī)溶劑111為0150、01尸、1'邸、甲醇、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：式I的制備方法步驟（1)中，所述英 光素與所述二苯基次磯醜氯的摩爾比為5~1 ;1 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~12(TC，時(shí)間為 8 ~40h ; 步驟似中，所述中間產(chǎn)物I與所述XA-D-Y的摩爾比為1 ; 1~5 ;所述反應(yīng)II的溫度 為0~50°C，時(shí)間為8~20h ; 步驟（3)中，所述中間產(chǎn)物II與所述M的摩爾比為1 ;1~5 ;所述反應(yīng)III的溫度均為 30~120°C，時(shí)間均為10~40h ; 式I '的制備方法步驟（1)中，所述英光素與所述二苯基次磯醜氯的摩爾比為5~1 ; 1 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~120。時(shí)間為8~40h ; 步驟似中，所述中間產(chǎn)物I與MX的摩爾比為1 ; 1~5 ;所述反應(yīng)Iir的溫度為30~ 120°C，時(shí)間均為10~40h。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于：所述反應(yīng)I、所述反應(yīng)II、所述 反應(yīng)m和所述反應(yīng)Iir結(jié)束后均包括冷卻至0~2(TC的步驟。5. -種化合物，其結(jié)構(gòu)式為式II或式11'，式II和式11'中，XM+-L-D、XM\XM' +-L' -D'和XM' +均為線粒體祀向分子基團(tuán)； M+和M' +均為R 3P+、R3N+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基； X為Cl、化或I ; L和L'均為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組 成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合； D和D'均為-CONH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán) 中的任意一種；-C0NH-、-CHz-NH-和-C0-0-，或D'與L'中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán) 中的任意一種；-C0NH-、-邸2-畑-和-C0-0-。6.權(quán)利要求5所述化合物式II或式II '的制備方法，式II的制備方法包括如下步驟： (1) 在有機(jī)溶劑IV中，在縮合劑的作用下4-硝基英光素與XA-D-Y進(jìn)行反應(yīng)IV，得到中 間產(chǎn)物III，XA-D-Y和中間產(chǎn)物III中，X為-C1、-Br或-I ;L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀焼 基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸 基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D為-C0NH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基 團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一種；-C0NH-、-CH2-NH-和-CO-O- ;Y為-〇H、-Cl、-Br或-I ; 所述有機(jī)溶劑IV為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； 所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、可溶于水的碳二亞胺、4-二甲氨基化巧或0-苯并H 氮哇-N，N，N'，N' -四甲基脈四氣測酸； (2) 在有機(jī)溶劑V中，所述中間產(chǎn)物III與二苯基次磯醜氯進(jìn)行反應(yīng)V，得到中間產(chǎn)物 IV，中間產(chǎn)物IV中，X為-CL-Br或-I ;L為碳原子數(shù)2~10的鏈狀烷基、-(OCH2CH2)。-或 2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨 基酸脫水縮合；D為-C0NH-、-CH2-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán) 中的任意一種；-C0NH-、-邸2-畑-和-CO-O-; 所述有機(jī)溶劑V為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (3) 在有機(jī)溶劑VI中，所述中間產(chǎn)物IV與R-X'進(jìn)行反應(yīng)VI，得到中間產(chǎn)物V，R-X'和中間產(chǎn)物V中，M+為R 3P\ RsN+, R為碳原子數(shù)2~6的鏈狀烷基或苯基；X為 CK化或I ;X'為-CL-Br或-I ;L為碳原子數(shù)2~10的鏈狀烷基、-(OCH 2邸2)。-或2~ 10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸 脫水縮合；D為-C0NH-、-CH2-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的 任意一種；-C0NH-、-邸2-畑-和-CO-O-; 所述有機(jī)溶劑VI為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (4) 在有機(jī)溶劑W中，所述中間產(chǎn)物V進(jìn)行反應(yīng)VL還原劑將硝基還原為氨基，得到中 間產(chǎn)物VI，中間產(chǎn)物VI中，M+為RsP^RsN+, R為碳原子數(shù)2~6的鏈狀烷基或苯基；X為Cl、 化或I ;L為碳原子數(shù)2~10的鏈狀烷基、-(OCH 2邸2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組 成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D 為-C0NH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一 種；-CONH-、-邸2-畑-和-CO-O-; 所述有機(jī)溶劑W為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； 所述還原劑為LiAlH4; (5) 在有機(jī)溶劑W中，所述中間產(chǎn)物VI與M' -L' -D' -Y進(jìn)行反應(yīng)WL得到式II， M' -L' -D' -Y中，M'為-PR3、-NR3，R為碳原子數(shù)2~6的鏈狀烷基或苯基；L'為碳 原子數(shù)2~10的鏈狀烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈，其中n為2~ 5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；D'為-C0NH-、-CH2-NH-或-CO-O-; 或D'與L'中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一種；-C0NH-、-CHz-NH-和-CO-O-; Y 為-〇H、-Cl、-Br 或-I ; 所述有機(jī)溶劑W為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種。 式11'的制備方法包括如下步驟： (1)在有機(jī)溶劑V中，所述4-硝基英光素與二苯基次磯醜氯進(jìn)行反應(yīng)V'，得到中間 產(chǎn)物IV'，所述有機(jī)溶劑V '為DMSO、DMF、THF、乙臘、內(nèi)咖、二氯申婉和氯仿中至少I種； (2) 在有機(jī)溶劑VI中，所述中間產(chǎn)物IV與M-X'進(jìn)行反應(yīng)VT，得到中間產(chǎn)物V'，M-X'和中間產(chǎn)物V '中，M+為R3P、RsN+, R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基3 ;M 為R3P、R3N+，R為碳原子數(shù)為2-6的鏈狀烷基或苯基3 ;X為Cl、化或I ;X'為-Cl、-Br 或-I ; 所述有機(jī)溶劑VI為DMSO、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (3) 在有機(jī)溶劑W中，所述中間產(chǎn)物V進(jìn)行反應(yīng)VT，還原劑將硝基還原為氨基，得到 中間產(chǎn)物VT，中間產(chǎn)物VT中，M為RsP、RsN, R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基；X為Cl、 化或I ; 所述有機(jī)溶劑W為DMSO、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； 所述還原劑為LiAlH4; (4) 在有機(jī)溶劑W中，所述中間產(chǎn)物VT與M' X'進(jìn)行反應(yīng)WT，得到式Ir， M' X'中，M'為R3P、R3N，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基，X'為-C1、-Br 或-I ;X為Cl、化或I ; 所述有機(jī)溶劑W為DMSO、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：式II的制備方法步驟（1)中，所述 4-硝基英光素、所述XA-D-Y與所述縮合劑的摩爾比為1~3 ;1 ;1~6 ;所述反應(yīng)IV的溫 度為O~40°C，時(shí)間為5~40h ; 步驟（2)中，所述中間產(chǎn)物III與所述二苯基次磯醜氯的摩爾比為1~3 ;1 ;所述反應(yīng)V 的溫度為40~120。時(shí)間為8~40h ; 步驟（3)中，所述中間產(chǎn)物IV與所述R-X'的摩爾比為1 ;3~10 ;所述反應(yīng)VI的溫度為 80~120°C，時(shí)間為20~40h ; 步驟（4)中，所述中間產(chǎn)物V與所述還原劑的摩爾比為1 ;1~3 ;所述反應(yīng)W的溫度 為-40~(TC，時(shí)間為8~40h ; 步驟（5)中，所述中間產(chǎn)物VI與所述M' -L' -D' -Y的摩爾比為1 ;1~5 ;所述反應(yīng) W的溫度為10~50°C，時(shí)間為15~40h ; 式Ir的制備方法步驟（1)中，所述4-硝基英光素與所述二苯基次磯醜氯的摩爾比為 1~3 ;1 ;所述反應(yīng)V '的溫度為40~120。時(shí)間為8~40h ; 步驟（2)中，所述中間產(chǎn)物IV'與所述M-X'的摩爾比為1:3~10;所述反應(yīng)VT的溫 度為80~120°C，時(shí)間為20~40h ; 步驟（3)中，所述中間產(chǎn)物V'與所述還原劑的摩爾比為1:1~3;所述反應(yīng)VT的溫 度為-40~(TC，時(shí)間為8~40h ; 步驟（4)中，所述中間產(chǎn)物VT與所述M' X'的摩爾比為1:1~5;所述反應(yīng)VT的 溫度為10~40°C，時(shí)間為15~40h。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于：所述反應(yīng)IV結(jié)束后還包括冷卻 至0~1(TC的步驟； 所述反應(yīng)VI、所述反應(yīng)VT、所述反應(yīng)W和所述反應(yīng)VT結(jié)束后均包括冷卻至0~ 20°C的步驟； 所述反應(yīng)V、所述反應(yīng)V'、所述反應(yīng)W和所述反應(yīng)VT結(jié)束后均包括冷卻至0~ 30°C的步驟。9. 權(quán)利要求1所述化合物或權(quán)利要求5所述化合物在制備線粒體祀向超氧自由基探針 中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1所述化合物或權(quán)利要求5所述化合物在線粒體祀向超氧自由基檢測和 線粒體祀向成像中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07F9/6561GK105985379SQ201510071288
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發(fā)明人】黃賽朋, 杜立波, 劉揚(yáng)
【申請人】中國科學(xué)院化學(xué)研究所