吡嗪類化合物及其在醫(yī)藥上的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一類熒光標記β?淀粉樣斑塊和神經纖維纏結的吡嗪類化合物，所述化合物的結構通式如式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示：其中，n為1、2或3。本發(fā)明還提供所述化合物的制備方法及應用。該類化合物可直接做為檢測或顯像動物或人體組織內β-淀粉樣斑塊或神經纖維纏結的顯像劑。該類化合物特別適合于制備直接檢測并診斷包括阿爾茨海默病在內的β-淀粉樣蛋白沉積疾病或神經纖維纏結疾病的顯像劑或診斷藥物。
【專利說明】
[0001] 吡嗪類化合物及其在醫(yī)藥上的用途
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及特異性分子識別診斷試劑領域，更具體地說，涉及一類與β-淀粉樣斑 塊和神經纖維纏結具有高親和力的新型小分子熒光化合物，以及該類化合物在制備用于檢 測或顯像淀粉樣蛋白沉積疾病或神經纖維纏結疾病的顯像劑中的應用。
[0003]
【背景技術】
[0004] 阿爾茨海默病(Alzheimer ' s Disease，AD)是一種進行性發(fā)展的致死性神經退行 性疾病。目前我國已提前進入老齡化社會，大約有600萬人患AD，數量居世界各國之首，且患 病人數以每年30萬以上的速度遞增。我國65歲以上人群患病率達7.2%，且AD患者正在向年 輕化趨勢發(fā)展。AD已成為僅次于心臟病、癌癥、中風的導致老人死亡的第四大殺手。AD不但 嚴重影響中老年人的生活質量，而且給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。由于AD病因 復雜，確切的發(fā)病機理目前仍不清楚，臨床上主要通過評價患者的認知功能損傷來診斷，確 診患者多已進入病程的中晚期而延誤治療。缺乏有效的檢測手段，已成為AD早期診斷與治 療的重大障礙。
[0005] 在AD患者腦內，以β-淀粉樣蛋白（Αβ)為主要成分的β-淀粉樣斑塊(Αβ斑塊)和以過 度磷酸化Tau蛋白為主要成分的神經纖維纏結是AD最為顯著的兩大神經病理學特征。研究 表明，腦內Αβ斑塊或神經纖維纏結的沉積均不同程度地早于AD的臨床發(fā)病期，故開發(fā)以Αβ 斑塊或神經纖維纏結為靶標的檢測試劑，將對AD的早期診斷、病程監(jiān)測以及治療藥物的研 究等提供重要的分析手段。
[0006] 過去數年間，多個用于正電子發(fā)射斷層掃描成像技術(PET)的Αβ斑塊示蹤劑進入 臨床試驗階段，其中C-11 標記的[nC]PIB(KlunkWE,et al. Ann. Neurol. 2004，55(3)， 306-319)是目前全球應用最為廣泛的Αβ斑塊PET顯像劑；[1乍從￥-45(10即0?，6七&1· J. Nucl. Med.2010, 51(6), 913-920)^ [18F]GE-〇67(Koole M, et al. J. Nucl. Med. 2009,50 (5), 818-822)以及[18F]BAY-94-9172(Rowe CC, et al .Lancet. Neurol. 2008， 7 (2)，129-135 )等三個F-l 8標記的Αβ顯像劑已被美國FDA和歐洲EMA批準用于人體腦內Αβ 斑塊的PET顯像（Villemagne VL. Ageing. Res. Rev. 2016，pii: S1568-1637(16) 30005-8)。用于腦內神經纖維纏結PET顯像的小分子探針也有數個進入人體臨床試驗，具體 包括：[ 18卩從￥-1451、[1乍]1'服-5117、[1乍]1'冊-5351、[ 11(：]?883以及[1乍]1?06958948等 (Okamura N, et al. Ageing. Res. Rev. 2016，pii: S1568-1637(15)30045-3)。但是放 射性顯像劑的應用也受一些因素限制，比如放射性顯像劑所發(fā)出的射線對人體具有一定的 輻射損傷、需要醫(yī)療機構配套有生產放射性核素的回旋加速器、放射性顯像劑須專業(yè)技術 人員標記配制、顯像時間長且圖像處理費時等。
[0007] 相較之下，光學成像具有安全無放射性、數據采集時間短以及成本低廉等諸多優(yōu) 勢，近年在醫(yī)學診斷等中的應用受到廣泛重視;尤其是新興的近紅外熒光成像技術，在其光 譜范圍內，生物組織的自發(fā)熒光干擾較小，組織背景熒光信號很低，且穿透組織距離可高達 數厘米。此外，光聲成像技術(photoacoustic imaging，PAI)通過光聲信號的轉換，可實現 三維掃描成像。因此，研發(fā)與Αβ斑塊和神經纖維纏結具有高親和力的靶向光學探針，并直接 應用于制備檢測或顯像β-淀粉樣蛋白沉積疾病或神經纖維纏結疾病的顯像劑，將具有非常 重要的科學意義和實際價值。然而，目前國內外有關靶向Αβ斑塊或神經纖維纏結的熒光化 合物的研究報道較少，還處于起步階段?；谏鲜黾夹g背景，研發(fā)性能優(yōu)異的新型小分子熒 光化合物，符合我國社會民生的迫切需求和老齡化社會國情，具有重大的應用前景和科學 意義。
[0008]

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術問題在于，現有顯像探針常需外接熒光團，且熒光團具有較 大的分子結構并帶有電荷，因而不適合應用于制備須通過血腦屏障的腦內Αβ斑塊或神經纖 維纏結的顯像劑，且非特異結合的熒光團發(fā)光對成像易產生干擾信號。本發(fā)明提供一類不 帶電荷的小分子熒光化合物，其結構中的推電子基團和拉電子基團，形成推-拉電子作用的 共輒結構，并通過碳碳雙鍵增加躍迀的共輒體系，使化合物分子產生的熒光向長波方 向移動(減少生物自發(fā)熒光干擾），同時其結構整體又滿足了與Αβ斑塊或神經纖維纏結的親 和力?；衔锱cΑβ斑塊或神經纖維纏結結合后發(fā)射波長藍移或紅移，且熒光強度顯著提高， 從而有效排除非特異結合的化合物發(fā)光對成像可能產生的干擾，因此該類化合物可直接做 為檢測或顯像淀粉樣蛋白沉積疾病或神經纖維纏結疾病的藥物或藥物有效成分。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供與Αβ斑塊和神經纖維纏結具有高親和力的小分子熒光化 合物。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供所述化合物的制備方法及應用。
[0012] 為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明的一類與Αβ斑塊和神經纖維纏結具有高親和力的化 合物，其特征在于，所述化合物結構如式(I)或式（Π )所示：
其中，η為1、2或3。 1 本發(fā)明還提供前述式（I)所示化合物的制備方法。具體如下：通過Knoevenagel縮 合反應合成目標化合物:取2-甲基P比嗪3 mmol及對應醛1 mmol溶于20-40 mL干燥四氫咲喃 后，加入叔丁醇鉀4 mmol，80°C加熱回流2小時，旋蒸除去溶劑;加入20 mL水析出固體，抽 濾后將所得固體進行柱層析分離得到如式(I)所示的化合物。
[0014]本發(fā)明也提供前述式（Π )所示化合物的制備方法。具體如下:通過Knoevenagel縮 合反應合成目標化合物:取2-甲基喹喔啉2 mmol及對應醛1 mmol溶于10-30 mL氫氧化鈉 溶液(5mol/L)，加入Aliquat 336(0.1 mmol)，100°C加熱回流8-15小時，冷卻，過濾，將所得 固體進行柱層析分離得到如式（Π )所示的化合物。
[0015] 本發(fā)明進一步提供一種藥物組合物，所述組合物包括式（I)或式（Π )所示的化合 物與藥學上可接受的鹽、前藥或載體組成的制劑。"藥學上可接受的載體"包括各種賦形劑 和稀釋劑。本發(fā)明所述的在組合物中藥學上可接受的載體可包括液體，如水、生理鹽水、甘 油和乙醇等。
[0016] 本發(fā)明式（I)或式（Π )所示的化合物可有效熒光標記轉基因小鼠和人腦中的Αβ斑 塊和神經纖維纏結，且該類化合物與Αβ斑塊結合后發(fā)射波長藍移、與神經纖維纏結結合后 發(fā)射波長紅移，因此通過單個化合物的多光譜成像即可實現β-淀粉樣斑塊和神經纖維纏結 的同步實時檢測。
[0017] 本發(fā)明進一步提供式（I)或式（Π )所示的化合物在制備檢測或顯像動物或人體組 織內的淀粉樣斑塊或神經纖維纏結的藥物或其藥物有效成分中的應用。在應用過程中， 將可檢測量的式（I)或式（Π )所示的化合物通過本領域技術人員公知的方法給藥至動物或 人體組織內。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，以可檢測量的式（I)或式（Π )所示的化合物引入 動物或人體內并且在足以使化合物與淀粉樣斑塊或神經纖維纏結結合的時間之后，非創(chuàng) 傷性地檢測化合物。在本發(fā)明的另一實施方案中，將式(I)或式（Π )所示的化合物引入動物 或人體內，經足量的時間以使化合物與淀粉樣斑塊或神經纖維纏結結合，取組織樣品，并 脫離動物或人體檢測組織中的化合物。在本發(fā)明的第三個實施方案中，自動物或人體取組 織樣品并且將式（I)或式（Π )所示的化合物引入該組織樣品。在足以使該化合物結合至β-淀粉樣斑塊或神經纖維纏結的時間之后，檢測化合物。
[0018] 本發(fā)明所述的顯像手段為光學顯像或光聲顯像，包括但不限于熒光顯微技術、激 光共聚焦顯微技術、多光子顯微技術、光學投影斷層掃描技術(OPT)、光片照明顯微技術 (SPIM)、熒光成像系統(tǒng)、介觀熒光斷層掃描技術、熒光分子斷層掃描成像技術(FMT)、多模態(tài) 成像系統(tǒng)(熒光成像結合X射線/CT/MRI)、光聲成像系統(tǒng)、多光譜光聲斷層成像(MS0T)等。
[0019] 本發(fā)明所述淀粉樣蛋白沉積疾病或神經纖維纏結疾病包括但不限于阿爾茨海默 病、淀粉樣腦血管病、淀粉樣蛋白多發(fā)性神經病、全身性老年淀粉樣蛋白病、淀粉樣蛋白心 肌病、具有淀粉樣變的遺傳性腦出血、克雅氏病、Π 型糖尿病胰島瘤、額顳葉癡呆、匹克氏 病、纏結為主型癡呆、進行性核上麻痹(PSP)、皮質綜合征(CBS)、慢性創(chuàng)傷性腦病變(CTE)、 神經節(jié)神經膠質瘤等。
[0020] 本發(fā)明提供了一類基于推拉電子結構的與Αβ斑塊和神經纖維纏結具有高親和力 的熒光化合物。體外熒光染色實驗表明，該類化合物能夠清楚地與轉基因小鼠腦切片和患 病人腦組織切片的Αβ斑塊和神經纖維纏結結合，發(fā)射波長移動且熒光強度顯著增強；正常 小鼠體內分布實驗結果顯示該類化合物具有良好的入腦能力并能從腦內快速清除。因此， 該類化合物具有成為阿爾茨海默病等淀粉樣蛋白沉積疾病或神經纖維纏結疾病的新型 顯像劑和診斷藥物的巨大潛力。
[0021]
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明式(I)及式（Π )化合物合成過程示意圖 圖2為PB-1和QB-1分別對APP/PS1轉基因小鼠腦切片熒光染色標記結果。其中右圖為硫 磺素 S(ThS)對相鄰鼠腦切片的染色結果。
[0023]圖3為PB-1對AD患者腦切片熒光染色標記結果。其中圖A、B、C分別為PB-1染色后同 一位置在紫光、綠光、紅光波段下的染色結果:Arrow head所指處為PB-1熒光標記的神經纖 維纏結，arrow所指處為PB-1熒光標記的Αβ斑塊;圖D為同一位置的免疫染色結果。
[0024]圖4為ΡΒ-1與她-42聚集體混合前后的熒光發(fā)射光譜。
[0025]
【具體實施方式】
[0026] 以下通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于所述實施例。常見的且對 本領域技術人員而言顯而易見的各種條件和參數的其他適當的修飾和改變處于本發(fā)明的 精神和范圍之內。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟識的常 規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0027] 實施例一:式(I)所示的化合物的合成 本發(fā)明式(I)所示的化合物的合成路徑如圖1所示。
[0028] 合成 ΡΒ-1
將2-甲基吡嗪（282.3 mg，3 mmol)與4-Ν，Ν二甲氨基肉桂醛（175.4 mg，l mmol)溶于 20 mL干燥四氫呋喃，加入叔丁醇鉀（448.8 mg，4 mmol)，80°C加熱回流2小時，旋蒸除去溶 劑;加入20 mL水析出固體，抽濾后將所得固體進行柱層析分離，得到105.8 mg PB-1，產率 42.1%。結構如下：h-NMR (400 MHz, CDCl3)j 8.50 (s，1H), 8.47 (s，1H)，8.30 (s， 1Η), 7.51 (dt, J = 36.4, 18.2 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 7.0 Hz, 1H),6.81 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.61 (s, 1H), 6.58 (s, 1H), 3.00 (s, 6H)〇
[0029] 實施例二:式（Π )所示的化合物的合成 本發(fā)明式（Π )所示的化合物的合成路徑如圖1所示。
[0030] 合成 QB-1
取2-甲基喹喔啉（288 mg，2 mmol)及4_N，N二甲氨基肉桂醛（175.4 mg，l mmol)溶于 15 mL 氫氧化鈉溶液(5mol/L)，加入Aliquat 336(43 mg，0.1 mmol)，100°C加熱回流 10小 時，冷卻，過濾，將所得固體進行柱層析分離得到91.0 mg QB-1，產率30.2%。結構如下：咕-匪R (400 MHz, CDC13):S 8.90 (s， 1H)， 8.03-7.99 (m， 1H)， 7.73-7.63 (m， 4H)， 7.40 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.89 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 15.6 Hz), 6.70 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 3.02 (s, 6H)。
[0031] 實施例三:光學參數的測定 1.最大吸收波長與摩爾吸收系數的測定 以二氯甲烷為溶劑，分別配制一定濃度梯度的化合物，如1、5、10、20、25 μΜ的溶液，用 紫外-可見分光光度計掃描紫外吸收光譜，記錄最大吸收波長(Aabs)和吸光度，并計算摩爾 吸收系數ε(Μ< cnf1)。本發(fā)明實施例中的部分化合物的最大吸收波長與摩爾吸收系數見表 1〇
[0032] 2.熒光激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長的測定 本發(fā)明中的化合物具有良好的熒光性質。為了考察本發(fā)明中的化合物的熒光性質，具 體實施步驟為:精密稱取本發(fā)明中的化合物適量，溶于二氯甲烷，并用二氯甲烷稀釋至1 μ mol ?I/1。應用熒光分光光度計進行熒光檢測。固定激發(fā)/發(fā)射波長并400-750 nm連續(xù)掃描 發(fā)射/激發(fā)波長，繪制波行圖像。本發(fā)明實施例中的部分化合物的最大激發(fā)波長(λΜ)與最大 發(fā)射波長(U見表1。
[0033] 表1實施例中的部分化合物的光學性質
實施例四：體外熒光染色實驗 1.小鼠腦切片的熒光染色 本發(fā)明中的化合物能夠清晰染色轉基因小鼠腦切片上的Αβ斑塊，并有效地熒光標記Αβ 斑塊。為了考察對Αβ斑塊的標記能力，具體實施步驟為:配制濃度為Ιμπιο? · Γ1的本發(fā)明中 的化合物，分別滴加覆蓋APP/PS1轉基因小鼠（26月齡)腦切片（1 Ομπι)，室溫培育10分鐘；切 片按40 %乙醇(2分鐘）、40 %乙醇(2分鐘）、純水(30秒）的順序進行漂洗，風干后應用熒光顯 微鏡觀察。鄰接切片用硫磺素染色以確認Αβ斑塊位置。本發(fā)明中的化合物染色熒光斑點與 鄰接切片的熒光斑點位置一致，能夠選擇性結合Αβ斑塊，并有效地熒光標記Αβ斑塊。其中， 本發(fā)明實施例中的部分化合物的染色結果如圖2。
[0034] 2. AD患者腦切片的熒光染色 本發(fā)明中的化合物能夠清晰有效地熒光標記AD患者腦切片上的神經纖維纏結。具體實 施步驟為:配制濃度為1 μπιο? ?I/1的本發(fā)明中的化合物，分別滴加覆蓋AD患者腦切片(5 μ m)，室溫培育15分鐘；切片按40%乙醇（1分鐘）、40%乙醇（1分鐘）、純水(30秒)的順序進行漂 洗，風干后應用熒光顯微鏡觀察。同一切片用磷酸化Tau蛋白特異抗體(AT-8)和DAB染色劑 通過免疫染色確認神經纖維纏結。本發(fā)明實施例中的部分化合物的染色結果如圖3。本發(fā)明 中的化合物PB-1在紅光波段能夠清晰有效地熒光標記神經纖維纏結(arrow head)而不顯 示Αβ斑塊熒光，在紫光波段能夠清晰有效地熒光標記Αβ斑塊(arrow)而不顯示神經纖維纏 結熒光；因此通過PB-1在不同波段的多光譜顯像，可實現同時特異性區(qū)分檢測神經纖維纏 結和Αβ斑塊。
[0035]實施例五:Α&-42聚集體混合后的化合物熒光光譜 本發(fā)明中的化合物與Αβ聚集體結合后具有熒光增強的性質。為了考察本發(fā)明中的化合 物與Αβ混合后的熒光光譜行為的變化，具體實施步驟為:精密稱取本發(fā)明中的化合物適量， 溶于乙醇，并用PBS稀釋至1 μπιο? ?I/1。應用熒光分光光度計進行熒光檢測。固定激發(fā)/發(fā)射 波長并400-750 nm連續(xù)掃描發(fā)射/激發(fā)波長，繪制波行圖像。選用ΑβΗ〗蛋白在37°C水浴中 培育如聚集體，用于模擬人腦內的如聚集體。將化合物（1以111 〇1*1/1)與仙1-42聚集體(2.75 μπιο? ·Ι^)混合，應用熒光分光光度計進行熒光檢測。固定激發(fā)/發(fā)射波長并400-750 nm連 續(xù)掃描發(fā)射/激發(fā)波長，繪制波行圖像。本發(fā)明中的化合物與Αβ聚集體結合后具有熒光增強 的性質。其中，本發(fā)明實施例中的化合物與Afo- 42聚集體混合前后的熒光光譜行為見圖4?；?合物PB-1與Afo-42聚集體混合后的熒光強度顯著增強，為化合物自身熒光強度的76倍。
[0036]實施例六:正常小鼠腦內攝取與清除實驗 本發(fā)明中的化合物能夠快速有效地穿過血腦屏障入腦，并具有良好的初始攝取量和清 除速率。具體實施步驟為:取本發(fā)明中的化合物(2.0 mg/kg，含20%二甲亞砜和80%丙二醇）， 經尾靜脈注射入正常小鼠 （η = 5)體內，分別于注射后2、10、30以及60 min時斷頭取腦。腦 組織稱重、勻漿，并用乙腈1 mLX3次提取，低溫高速離心（10000 r，4°C)5 min，取上層清 液，經0.22 μπι微孔濾膜過濾，注入HPLC儀分析并計算％ injected dose per gram (%ID/ g)。本發(fā)明實施例中的部分化合物的HPLC分析條件見表2。本發(fā)明實施例中的部分化合物的 分析結果見表3。本發(fā)明中的化合物能夠快速穿過血腦屏障進入腦內（注射后2 min即已入 腦），且具有良好的腦初始攝取量和清除速率。
[0037] 表2 HPLC分析條件
表3 HPLC分析結果
【主權項】
1. 一種熒光標記β-淀粉樣斑塊和神經纖維纏結的化合物，其特征在于，所述化合物結 構如式(I)所示：其中，η為1、2或3。2. 權利要求1所述的化合物的制備方法，其特征在于，通過Knoevenagel縮合反應合成 目標化合物:取2-甲基吡嗪3 mmol及對應醛I mmol溶于20-40 mL干燥四氫呋喃后，加入叔 丁醇鉀4 mm〇l，80°C加熱回流2小時，旋蒸除去溶劑;加入20 mL水析出固體，抽濾后將所得 固體進行柱層析分離得到如式(I)所示的化合物。3. -種藥物組合物，其特征在于由權利要求1中所述的化合物與藥學上可接受的鹽、前 藥或載體組成的制劑。4. 根據權利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物在制備檢測或顯像動物或 人體組織內的β-淀粉樣斑塊或神經纖維纏結的藥物或其藥物有效成分中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述的藥物為光學顯像技術或光聲顯像技 術藥物。6. -種熒光標記β_淀粉樣斑塊和神經纖維纏結的化合物，其結構如式（Π )所示：其中，η為1、2或3。7. 權利要求6所述化合物的制備方法，其特征在于，通過Knoevenagel縮合反應合成目 標化合物:取2-甲基喹喔啉2 mmol及對應醛I mmol溶于10-30 mL氫氧化鈉溶液(5mol/L)， 加入AI i qua t 3 3 6 (0 · I mmo 1 )，10 0 °C加熱回流8 -15小時，冷卻，過濾，將所得固體進行柱層 析分離得到如式（Π )所示的化合物。8. -種藥物組合物，其特征在于由權利要求6中所述的化合物與藥學上可接受的鹽、前 藥或載體組成的制劑。9. 根據權利要求6所述的化合物，其特征在于所述的化合物在制備檢測或顯像動物或 人體組織內的β-淀粉樣斑塊或神經纖維纏結的藥物或其藥物有效成分中的應用。10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述的藥物為光學顯像技術或光聲顯像技 術藥物。
【文檔編號】A61K49/22GK106008374SQ201610396936
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】程妍
【申請人】四川大學