一種辣根過氧化物酶與抗體片段的融合蛋白及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白由抗溶菌酶抗體或其可變區(qū)片段與辣根過氧化物酶報(bào)告基因蛋白串聯(lián)而成，本發(fā)明還提供了所述融合蛋白的制備方法和應(yīng)用。該融合蛋白用于以免疫標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫檢測，保持了良好的酶和抗體的生物學(xué)活性，具有較高的檢測效率。
【專利說明】
一種辣根過氧化物酶與抗體片段的融合蛋白及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明公開了一種融合蛋白及其免疫學(xué)應(yīng)用，屬于基因工程和免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體(Antibody，Ab)是指一類在抗原物質(zhì)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)后形成的、具有與相 應(yīng)抗原物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白?？贵w是免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物，主要存在于 血液、組織液和外分泌液中，因此將抗體介導(dǎo)的免疫稱為體液免疫?？贵w分子由B淋巴細(xì)胞 產(chǎn)生，它由兩條完全相同的重鏈以及兩條完全相同且在哺乳動(dòng)物中高度保守的的輕鏈組 成。IgG的分子重量大約是160kDa，其是一個(gè)復(fù)雜的分子，Η鏈和L鏈展開分別形成4個(gè)和2個(gè) 結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白的兩條輕鏈與兩條重鏈由二硫鍵連接形成一個(gè)四肽鏈分子，構(gòu)成免疫 球蛋白分子的單體。免疫球蛋白單體中四條肽鏈兩端游離的氨基或羧基的方向是一致的， 分別稱為氨基端(Ν端)和羧基端(C端）。在Ig單體分子的Ν端，輕鏈的1/2與重鏈的1/4氨基酸 排列順序隨抗體特異性不同而變化，故稱這個(gè)區(qū)域?yàn)榭勺儏^(qū)（Variable region，V區(qū)）。此V 區(qū)賦予抗體以結(jié)合抗原的特異性。在Ig多肽鏈的C端，輕鏈的其余1/2和重鏈的3/4部分，氨 基酸數(shù)量、種類、排列順序及含糖量都比較穩(wěn)定，故稱為恒定區(qū)（Constant Region，C區(qū)）。恒 定區(qū)不僅可作為Ig的骨架，還具有許多其他重要的生物學(xué)活性。在V區(qū)某些特定位置上，其 氨基酸殘基的組成和排列順序比可變區(qū)內(nèi)其他位置上的氨基酸殘基更易變化，故稱這些部 位為超變區(qū)（Hypervariable Region，HV區(qū)），如輕鏈的第26~32、48~55、90~95三個(gè)部位， 重鏈的第31~37,51~68,84~91，101~110四個(gè)部位的氨基酸殘基變化特別劇烈。輕鏈、重 鏈上的超變區(qū)位置大致相當(dāng)。可變區(qū)中其他變化較少的部分稱為骨架氨基酸殘基 (Framework Residues，F(xiàn)R區(qū)）。Ig與特異抗原決定簇結(jié)合的位置就在超變區(qū)，所以現(xiàn)在又稱 超變區(qū)為互補(bǔ)決定簇區(qū)（Complementary Reterminant Region，CDR)。抗體的高變區(qū)、抗體 的抗原結(jié)合部位和抗體的獨(dú)特型決定簇存在于相同的Ig結(jié)構(gòu)上，即抗體分子可變區(qū)球形頂 端凹陷的立體結(jié)構(gòu)。
[0003] 多克隆抗體(Polyclonal Antibody，PcAb)是由多克隆B細(xì)胞群產(chǎn)生的、針對多種 抗原決定簇的混合抗體。因?yàn)樘烊豢乖怯啥喾N抗原分子組成的，每種抗原分子又含有許 多抗原決定簇，每一種抗原決定簇可激活相應(yīng)的B細(xì)胞克隆，進(jìn)而分化、成熟并合成相應(yīng)的 抗體。單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)是指由一個(gè)B細(xì)胞活化、增殖、分化產(chǎn)生的 子代細(xì)胞克隆分泌的、針對一個(gè)抗原決定簇的抗體，即由單一B細(xì)胞克隆合成的均一抗體。 一種單克隆抗體的Ig氨基酸排列順序完全相同，其抗原特異性、和相應(yīng)抗原結(jié)合的親和性 也完全相同。
[0004] 1975年Koehler和Milstein采用細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠免疫脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì) 胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞。這種雜交瘤細(xì)胞既保存了骨髓瘤細(xì)胞無限繁殖的特性，又具有免 疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。然后運(yùn)用有限稀釋法等技術(shù)可從雜交瘤細(xì)胞中挑 選出能穩(wěn)定分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)其增殖成為一個(gè)細(xì)胞克隆，分泌出均一 1性的 單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)的建立使人們生產(chǎn)大量均一單克隆抗體的愿望成為了現(xiàn)實(shí)。由于 單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、可以大量生產(chǎn)等許多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用作診斷 檢測試劑，提高了常規(guī)免疫學(xué)檢測技術(shù)在疾病診斷和分析研究中的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性 和檢測速度。免疫學(xué)檢測方法就是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測定抗原、抗體、免疫細(xì)胞 及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法。隨著學(xué)科間的相互滲透，免疫學(xué)涉及的范圍不斷擴(kuò)大，新 的免疫學(xué)檢測方法層出不窮。免疫學(xué)方法的應(yīng)用范圍亦在日益擴(kuò)大，不僅成為多種臨床疾 病診斷的重要方法，也為眾多學(xué)科的研究提供了方便。為提高抗原和抗體檢測的敏感性，將 已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)，從而間接 測出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、熒光素、放射性同位素、膠體金及電子致密物 質(zhì)等，這種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進(jìn)行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù) (Immunolabelling Technique)。免疫標(biāo)記不僅大大提高了試驗(yàn)敏感性，若與光鏡或電鏡技 術(shù)相結(jié)合，能對組織或細(xì)胞內(nèi)的待測物質(zhì)作精確定位，從而為基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究及診斷 提供方便。免疫標(biāo)記技術(shù)大致分為兩大類:一類屬于免疫組織化學(xué)技術(shù)，用于組織切片或其 他標(biāo)本中抗原的定位。另一類稱為免疫測定(Immunoassay )，用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的 測定，例如免疫酶技術(shù)(Immunoenzymatic Technique)。最早應(yīng)用的免疫酶技術(shù)是免疫酶組 織化學(xué)染色，即用標(biāo)記的抗體與標(biāo)本中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)加入酶的底物時(shí)，在酶的 作用下經(jīng)一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，借助光鏡作出定位判斷。目前，應(yīng)用最廣泛的是酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。該法特異性強(qiáng)，敏感性 高，既可檢測抗體，又能測定可溶性抗原。ELISA常采用的酶為辣根過氧化物酶(Hosradish Peroxidase，HRP)或者堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)，其底物分別是二氨基苯胺 (DAB)和對硝基苯磷酸二鈉鹽(PNPP)，底物被分解則顯色，可目測或借助酶標(biāo)儀比色。
[0005] 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，是將辣根過氧化物酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而 成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于酶的純度、活性及抗體的親和力，其次要有良好的制備方 法。目前，高質(zhì)量的辣根過氧化物酶，國內(nèi)已有商品供應(yīng)，是從植物辣根中分離純化的酶分 子。辣根過氧化物酶與抗體交聯(lián)的采用的是過碘酸鈉法。過碘酸法是先利用NaI0 4把酶分子 表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率可達(dá)70%， 99%的抗體與酶結(jié)合，是目前最常用的方法。在標(biāo)記過程中需要使用化學(xué)試劑，會影響酶和 抗體的生物學(xué)活性，標(biāo)記效率不能達(dá)到100%，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，最后還需要對酶標(biāo)抗體進(jìn)行 純化以去除多余的化學(xué)試劑和未標(biāo)記的抗體和酶分子，從一次標(biāo)記反應(yīng)到拿到純化的酶標(biāo) 抗體需要至少1周的時(shí)間。
[0006] 由于常規(guī)的抗體分子量大，達(dá)到160kD，而且由2條重鏈和2條輕鏈構(gòu)成，融合標(biāo)記 酶后，分子量要達(dá)到200kD以上，對抗體的表達(dá)會產(chǎn)生不利的影響，穩(wěn)定性也會變差。單鏈抗 體是基因工程抗體的一種，是將抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過柔性多肽串聯(lián)起來的一種具 有抗原結(jié)合活性的抗體片段。由單一肽鏈構(gòu)成，分子量小，只有30kD左右，可以用于融和標(biāo) 記辣根過氧化物酶。由于獲得的ScFv片段和完整抗體具有相同的抗原結(jié)合特性，因此，可以 利用此方法標(biāo)記ScFv，通過競爭性酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人血清中治療性抗 體的濃度變化，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。另外，在單峰駱駝的血清中除傳統(tǒng)的H 2L2型IgG外，還 存在一種缺失輕鏈的天然抗體。這種H2型同型二聚體抗體稱為只有重鏈的抗體(HCAbs)。 HCAbs的重鏈可以形成三個(gè)結(jié)構(gòu)域:N-末端域一序列可變區(qū)(VHH)，鉸鏈域和兩個(gè)恒定區(qū)。H2 型抗體的重鏈中與傳統(tǒng)抗體重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)（VH1)等價(jià)的部分已經(jīng)缺失，稱為單域抗 體。去除恒定區(qū)后的可變區(qū)序列，分子量只有15kD，大約10納米的直徑，被稱為納米抗體 (Nbs)。相似的缺乏輕鏈的功能性抗體同樣以混合物的狀態(tài)存在于非哺乳動(dòng)物例如鯊魚和 鼠鯊。與傳統(tǒng)抗體片段，如Fab，ScFv等相比，Nbs因其相對分子質(zhì)量小，而具有一些獨(dú)特的性 質(zhì)，例如免疫原性低、可溶性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、穿透性強(qiáng)、易表達(dá)等特性。
[0007] 基于現(xiàn)有技術(shù)在標(biāo)記技術(shù)存在著標(biāo)記效率低，酶和抗體的生物學(xué)活性因化學(xué)試劑 標(biāo)的影響而有所下降的技術(shù)問題，因此，發(fā)明一種能夠保持酶和抗體的生物學(xué)活性的免疫 標(biāo)記技術(shù)已成為本技術(shù)領(lǐng)域之現(xiàn)實(shí)需求，以實(shí)現(xiàn)高效快速的免疫檢測。
[0008] 本發(fā)明的目的就是提供一種酶和抗體的生物學(xué)活性不受化學(xué)標(biāo)記的影響，又能實(shí) 現(xiàn)高效的免疫標(biāo)記和檢測功能的融合蛋白和應(yīng)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 基于上述發(fā)明目的，發(fā)明人意欲采用基因重組表達(dá)的方式，表達(dá)抗體和標(biāo)記酶的 重組融合蛋白，從工程細(xì)胞的培養(yǎng)基上清或者破碎的工程細(xì)胞質(zhì)中直接純化抗體和標(biāo)記酶 的融合蛋白，獲得酶標(biāo)抗體，用于相關(guān)的免疫學(xué)檢測，具體而言，就是利用抗雞卵清溶菌酶 的納米抗體，制備檢測雞卵清溶菌酶濃度的納米抗體標(biāo)記酶融合蛋白，并將其應(yīng)用于實(shí)際 的免疫檢測中。
[0010] 因此，本發(fā)明首先提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白由抗溶菌酶抗體或其可變 區(qū)片段與辣根過氧化物酶串聯(lián)而成。本發(fā)明所述的融合蛋白是在DNA水平上將編碼抗體或 者抗體可變區(qū)片段的基因和編碼辣根過氧化物酶的報(bào)告基因融合后，通過重組表達(dá)的方 法，在如大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的重組融合蛋白。
[0011]抗體或抗體片段和報(bào)告基因蛋白的融合方式，可以是在抗體片段的氨基端或者羧 基端融合一個(gè)或幾個(gè)報(bào)告基因蛋白，也可以在抗體片段的氨基端或者羧基端分別融合一個(gè) 或幾個(gè)報(bào)告基因蛋白，或者是在報(bào)告基因蛋白的氨基端或者羧基端分別融合一個(gè)或者幾個(gè) 抗體片段的基因。在兩端分別融合報(bào)告基因蛋白或者抗體片段的融合蛋白中，所述融合蛋 白中的報(bào)告基因蛋白和抗體片段可以是不同的報(bào)告基因蛋白或不同的抗體片段，分別針對 同一抗原的不同抗原決定簇或不同的抗原分子。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米抗體可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0013] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述辣根過氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:3 所示。
[0014] 在抗體片段和辣根過氧化物酶間可以添加間隔序列以使抗體片段和報(bào)告基因能 夠各自表達(dá)和形成自身的空間構(gòu)型，不造成抗體片段和報(bào)告基因蛋白的空間位阻，都具有 相應(yīng)的生物學(xué)活性，間隔序列可以是(GGGGS) n柔性多肽或者其它的間隔序列。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述納米抗體的可變區(qū)與報(bào)告基因蛋白由連接肽 (GGGGS) n連接，其中η位1 -6中的任一整數(shù)
[0016] 優(yōu)選地，所述納米抗體的可變區(qū)可以位于融合蛋白的氨基端，所述報(bào)告基因蛋白 位于融合蛋白的羧基端，η = 3。
[0017] 優(yōu)選地，所述納米抗體的可變區(qū)也可以位于融合蛋白的羧基端，所述報(bào)告基因蛋 白位于融合蛋白的氨基端，η = 3。
[0018] 本發(fā)明優(yōu)選的序列是(GGGGSM乍為抗體片段和報(bào)告基因蛋白的間隔序列。為了便 于純化融合蛋白，在融合蛋白的任意位置可以增加多聚組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)后的重組融合蛋 白可以采用鎳柱金屬螯合層析的方法進(jìn)行純化。
[0019] 第二，本發(fā)明還提供了一種編碼上述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID N0:5或6所示。
[0020] 第三，本發(fā)明提供了一種含有上述核苷酸序列的載體，所述載體為p⑶NA3.1。
[0021]第四，本發(fā)明還提供了一種含有上述載體的細(xì)胞，所述細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0022]第五，本發(fā)明提供了一種制備上述融合蛋白的方法，所述方法包括：
[0023] (1)使用p⑶NA3.1構(gòu)建表達(dá)抗溶菌酶的納米抗體的可變區(qū)和辣根過氧化物酶的融 合表達(dá)載體，其中所述抗溶菌酶的納米抗體可變區(qū)的核苷酸編碼序列為SEQ ID N0:2,所述 辣根過氧化物酶的核苷酸編碼序列為SEQ ID N0:4;
[0024] (2)將步驟(1)獲得的載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞293T;
[0025] (3)收獲所述融合蛋白。
[0026] 最后，本發(fā)明提供了上述融合蛋白在抗體片段所針對的溶菌酶抗原的體外檢測中 的應(yīng)用，如酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(EIA)、酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法(ELISA)、免疫組化和免疫熒光 實(shí)驗(yàn)或者Western檢測，以及抗體藥物體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)的檢測實(shí)驗(yàn)。
[0027] 在傳統(tǒng)的免疫標(biāo)記技術(shù)中，辣根過氧化物酶標(biāo)記在蛋白的賴氨酸殘基位置。在納 米抗體的抗原結(jié)合區(qū)，賴氨酸一般出現(xiàn)在CDR區(qū)，是抗原的結(jié)合區(qū)域，因此標(biāo)記辣根過氧化 物酶后，可能阻斷了納米抗體與抗原的結(jié)合，導(dǎo)致不能顯色，因此傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)難以應(yīng)用 到納米抗體這一新型抗體上。而本發(fā)明提供的融合蛋白克服了這一技術(shù)缺陷，特定的序列 組合保證了融合蛋白中納米抗體和辣根過氧化物酶各自形成了空間構(gòu)型，使其各自具有相 應(yīng)的生物學(xué)活性。本發(fā)明的融合蛋白具有溶菌酶納米抗體識別和結(jié)合抗原的能力，而融合 的辣根過氧化物酶可以作用于其底物DAB顯色，因此獲得的溶菌酶納米抗體辣根過氧化物 酶融合蛋白可以作為針對溶菌酶的酶標(biāo)抗體，用于溶菌酶濃度的免疫檢測；也可以作為溶 菌酶納米抗體的競爭性抗體，用于體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明將溶菌酶納米抗體HRP融合 蛋白用于納米抗體體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究，在建立的納米抗體血清濃度檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線中 顯示，在0. l-10ug/ml的濃度范圍內(nèi)，吸光度和納米抗體的濃度呈良好的相關(guān)性。同時(shí)，競爭 性酶聯(lián)免疫吸附方法檢測顯示，在注射溶菌酶納米抗體后，大鼠血清中溶菌酶納米抗體的 濃度30分鐘后血清中的濃度快速下降，3小時(shí)后基本完全代謝掉。顯示出由于納米抗體的分 子量較低，具有較短的血清半衰期較短，這一結(jié)果符合納米抗體的技術(shù)效果預(yù)期，也充分證 明了本發(fā)明融合蛋白在實(shí)際應(yīng)用中的前景。
【附圖說明】
[0028] 圖1.本發(fā)明融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029] 圖2 · pCDNA-NHPl 和 pCDNA-NHP2 的酶切鑒定圖譜；
[0030] 圖3 · NHP-1和NHP-2融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜；
[0031 ]圖4.溶菌酶納米抗體辣根過氧化物酶融合蛋白酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果圖；
[0032]圖5.大鼠血清溶菌酶納米抗體濃度檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0033]圖6.大鼠血清中溶菌酶納米抗體的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。
[0035] 實(shí)施例1:制備實(shí)施例
[0036] 1.根據(jù)SEQ ID N0:1的溶菌酶納米抗體的氨基酸序列和SEQ ID N0:3辣根過氧化 物酶的氨基酸序列，優(yōu)化獲得在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的溶菌酶和辣根過氧化物酶cDNA序列 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4。
[0037] 2.在溶菌酶納米抗體和辣根過氧化物酶序列中添加柔性連接肽(GGGGS)3，分別獲 得表達(dá)NHP-1和NHP-2的DNA序列SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6。人工合成二種DNA序列。圖1顯 示了所述融合蛋白的三種連接方式，在所述融合蛋白的氨基酸還可以有信號肽，以利于融 合蛋白的分泌表達(dá)。
[0038] 3.分別將NHP-1和NHP-2基因克隆到真核表達(dá)載體pCDNA3.1的EcoRI和Hindlll酶 切位點(diǎn)中，獲得表達(dá)載體P⑶NA-NHP1和p⑶NA-NHP2(圖2)。圖2中，1.未酶切的p⑶NA-NHP1; 2·Aflll/Avrll雙酶切后的pCDNA-NHPl;3·未酶切的pCDNA-NHP2;4·Af lll/Avrll雙酶切后 的PCDNA-NHP2。
[0039] 4.293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：已培養(yǎng)48小時(shí)的293T細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的 PBS溶液洗滌兩次。
[0040] 5.用Tip頭加入lml Trypsin液，消化1分鐘（37°C，5%C02)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀 察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。加入lml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。用Tip頭多次吹吸， 使細(xì)胞完全分散開。
[0041 ] 6.將培養(yǎng)液裝入離心管中，lOOOrpm離心5min。用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選 擇0.8 X 106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞 后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。
[0042] 7.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備:將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。震蕩 后將試劑放在一 20°C保存，使用前還需震蕩。選擇合適的混合比例（1:1一1:2/脂質(zhì)體體積： DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的 DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。將混合液在室溫放置10-15分鐘。 [0043] 8.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。加入混合液，將細(xì) 胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。到時(shí)后，移除混合液，之后加入完全無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 - 72小時(shí)。
[0044] 9.納米抗體辣根過氧化物酶融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測：取10微升培養(yǎng)3天后 轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞培養(yǎng)基上清，分別加10微升還原（含beta巰基乙醇）和非還原電泳（不含 beta巰基乙醇）的上樣緩沖液，煮沸5分鐘，冰浴冷卻后，上15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠， 120V電泳30-40分鐘至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底部，取下凝膠，在考馬斯亮藍(lán)溶液中染色過夜，脫 色后觀察重組蛋白的表達(dá)情況。（參見圖3)。
[0045]納米抗體辣根過氧化物酶融合蛋白的SDS-PAGE電泳檢測：取10微升培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn) 染的293T細(xì)胞培養(yǎng)基上清，分別加10微升還原(含beta疏基乙醇）和非還原電泳（不含beta 巰基乙醇）的上樣緩沖液，煮沸5分鐘，冰浴冷卻后，上15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，120V電 泳30-40分鐘至溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底部，取下凝膠，在考馬斯亮藍(lán)溶液中染色過夜，脫色后觀 察重組蛋白的表達(dá)情況(參見圖3)。圖3中，1.293T細(xì)胞上清(還原）；2.293T細(xì)胞上清(非還 原）；3. ΝΗΡ-1轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞上清(還原）；4. ΝΗΡ-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清(非還原）；5. ΝΗΡ-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞 上清(還原）；6.ΝΗΡ-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清(非還原）。從圖3的SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出，ΝΗΡ-1 和ΝΗΡ-2融合蛋白在293Τ細(xì)胞的培養(yǎng)基上清中有顯著的分泌表達(dá)，純度也較高，其中非還原 的蛋白迀移率較還原蛋白的迀移率偏高，說明融合蛋白中納米抗體和辣根過氧化物酶各自 形成了空間構(gòu)型，應(yīng)該具有相應(yīng)的生物學(xué)活性。
[0046]實(shí)施例2.融合蛋白免疫活性的檢測
[0047] 取雞卵清溶菌酶，用roS配制成10ug/ml的溶液，取96孔酶標(biāo)板，每孔100微升包被 過夜。第二天用PBST沖洗各孔，用0.5%的BSA溶液封閉1小時(shí)，取100微升轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞 培養(yǎng)基上清，加入孔中，室溫避光放置1小時(shí)，PBST沖洗3次，加100微升DAB顯色底物，室溫避 光反應(yīng)15分鐘，目測觀察顯色情況(參見圖4)。圖4中，1.空白對照NHP-1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清； 2.溶菌酶包被4 X稀釋NHP-1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清；3.溶菌酶包被10 X稀釋NHP-1轉(zhuǎn)染293T細(xì) 胞上清;4.溶菌酶包被4 X稀釋NHP-2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清;5.溶菌酶包被10 X稀釋NHP-2轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞上清;6.空白對照NHP-2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞上清。
[0048]從圖4中可以看出，在包被了溶菌酶的孔中，有辣根過氧化物酶的特異顯色，而在 對照孔中，沒有顯色，證明融合蛋白具有溶菌酶納米抗體識別和結(jié)合抗原的能力，而融合的 辣根過氧化物酶可以作用于其底物DAB顯色，因此獲得的溶菌酶納米抗體辣根過氧化物酶 融合蛋白可以作為針對溶菌酶的酶標(biāo)抗體，用于溶菌酶濃度的免疫檢測。也可以作為溶菌 酶納米抗體的競爭性抗體，用于體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0049] 實(shí)施例3.納米抗體的辣根過氧化物酶化學(xué)標(biāo)記
[0050] 將5mg辣根過氧化物酶溶于0.5ml 0 . lmol/L NaHC〇3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaI〇4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。加0.75ml 0. lmol/L Na2C03混勻，然后加 入0.75ml純化的抗溶菌酶納米抗體（15mg/ml)，混勾。稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一 支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套;蓋緊，室溫作用 (避光)3小時(shí)或4°C過夜。用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20體積新鮮配制 的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí) (或4°C過夜）。將交聯(lián)物轉(zhuǎn)入30kD分子量截留的超濾管中，4°C3000轉(zhuǎn)離心30分鐘，加等體積 PBS，繼續(xù)離心3次，去除標(biāo)記試劑和未標(biāo)記的納米抗體，獲得辣根過氧化物酶標(biāo)記的溶菌酶 納米抗體。
[0051 ]辣根過氧化物酶化學(xué)標(biāo)記的溶菌酶納米抗體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn):如步驟10所述 的方法，用PBS配制雞卵清溶菌酶成10ug/ml的溶液，每孔100微升包被取96孔酶標(biāo)板過夜。 洗滌封閉后，各孔分別加1:10，1:100和1:1000稀釋的純化后的HRP標(biāo)記納米抗體100微升， 室溫避光放置1小時(shí)，PBST沖洗3次，加100微升DAB顯色底物，室溫避光反應(yīng)15分鐘，目測觀 察顯色情況。
[0052]各孔中均未見明顯的顯色。由于HRP是標(biāo)記在蛋白的賴氨酸殘基位置，在納米抗體 的抗原結(jié)合區(qū)，賴氨酸一般出現(xiàn)在CDR區(qū)，是抗原的結(jié)合區(qū)域，因此標(biāo)記HRP后，可能阻斷了 納米抗體與抗原的結(jié)合，因此不能顯色。
[0053]實(shí)施例4.溶菌酶納米抗體HRP融合蛋白用于納米抗體體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究
[0054] 取大鼠血清，分別加入0.1，0.5，2，10，50和200ug/ml濃度的溶菌酶納米抗體。取雞 卵清溶菌酶，用PBS配制成10ug/ml的溶液，取96孔酶標(biāo)板，每孔100微升包被過夜。第二天用 PBST沖洗各孔，用0.5 %的BSA溶液封閉1小時(shí)，將混合有溶菌酶納米抗體的大鼠血清稀釋50 倍后，分別取50微升加入到96孔板中，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)孔，在每個(gè)孔中，再加入50微升含有 10ug/ml溶菌酶納米抗體辣根過氧化物酶融合蛋白的PBS緩沖液，室溫孵育2小時(shí)。PBST洗滌 96孔板3次后，加入DAB顯色，0.2M硫酸終止反應(yīng)后，在450nm波長條件下讀取吸光度值，建立 納米抗體血清濃度檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖5)，從圖5中可以看出，在0. l-10ug/ml的濃度范 圍內(nèi)，吸光度和納米抗體的濃度呈良好的相關(guān)性。
[0055] 取體重200克左右的Wistar大鼠，按照10mg/kg體重的劑量，通過尾靜脈注射的方 法，給大鼠注射溶菌酶納米抗體。每隔30分鐘取血一次，共取8次。按照前述的競爭性酶聯(lián)免 疫吸附方法檢測大鼠血清中溶菌酶納米抗體的濃度。由于納米抗體的分子量較低，可以通 過腎臟排泄掉，因此其血清半衰期較短，30分鐘后血清中的濃度快速下降，3小時(shí)后基本完 全代謝掉(參見圖6)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由抗溶菌酶抗體或其可變區(qū)片段與辣根 過氧化物酶報(bào)告基因蛋白串聯(lián)而成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述抗體為納米抗體，其可變區(qū)片段的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所不。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述辣根過氧化物酶報(bào)告基因蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO:3所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述納米抗體的可變區(qū)與報(bào)告基因蛋白由 連接肽(GGGGS) n連接，其中η為1 -6中的任一整數(shù)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白，其特征在于，所述納米抗體的可變區(qū)位于融合蛋白的氨 基端，所述報(bào)告基因蛋白位于融合蛋白的羧基端，η = 3。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白，其特征在于，所述納米抗體的可變區(qū)位于融合蛋白的羧 基端，所述報(bào)告基因蛋白位于融合蛋白的氨基端，η = 3。7. -種編碼權(quán)利要求5或6所述蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:5或6所示。8. -種含有權(quán)利要求7所述核苷酸序列的載體，其特征在于，所述載體為pCDNA3.1。9. 一種含有權(quán)利要求8所述載體的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為293T細(xì)胞。10. -種制備權(quán)利要求1-5任一所述融合蛋白的方法，所述方法包括： (1) 使用PCDNA3.1構(gòu)建表達(dá)抗溶菌酶的納米抗體的可變區(qū)和辣根過氧化物酶的融合表 達(dá)載體，其中所述抗溶菌酶的納米抗體的可變區(qū)的核苷酸編碼序列為SEQ ID N0:2,所述辣 根過氧化物酶的核苷酸編碼序列為SEQ ID N0:4; (2) 將步驟（1)獲得的載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞293T; (3) 收獲所述融合蛋白。11. 權(quán)利要求1-6任一所述融合蛋白在針對溶菌酶的免疫檢測方法中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/10GK106008720SQ201610356626
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】宋海鵬, 李敏, 王慶東
【申請人】深圳市國創(chuàng)納米抗體技術(shù)有限公司