豬流行性腹瀉病毒地方變異株及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供一種豬流行性腹瀉病毒地方變異株及其應(yīng)用。該豬流行性腹瀉病毒地方變異株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏名稱為豬流行性腹瀉病毒ZJ15XS0101株，保藏號(hào)為CCTCC NO：V201624。該毒株可應(yīng)用于豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗、弱毒疫苗，亞單位疫苗、或多品種菌和/或毒的聯(lián)合疫苗開發(fā)及在檢測(cè)診斷中的應(yīng)用。CCTCC NO：V20162420160520
【專利說明】
豬流行性腹瀉病毒地方變異株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及豬流行性腹瀉病毒地方變異株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,P抓V)是引起豬流行性 腹瀉(Porcine邱idemic diarrhea,陽D)的主要病原，該病是一種高度接觸性腸道傳染病， 臨床特征主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水，不同生長階段的豬均易感，尤其對(duì)哺乳仔豬影 響較大、致死率最高可達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉于1971年 在英國的架子豬和育肥豬中首次流行，1978年，P抓的病原在英國和比利時(shí)首次得到鑒定。 此后，除美洲外，歐洲多個(gè)國家和地區(qū)均有P抓的報(bào)道。20世紀(jì)80年代和90年代，P抓在歐洲 的流行逐漸減少，相反，在亞洲呈爆發(fā)流行，包括中國、日本、韓國、泰國等國均爆發(fā)過此病。 我國自1995年開始使用二聯(lián)滅活苗或弱毒苗進(jìn)行P抓的預(yù)防，但是從2006年開始免疫過的 豬場(chǎng)依舊爆發(fā)PED，尤其從2010年起，我國多個(gè)省份報(bào)道了P邸的流行和爆發(fā)，并引起仔豬大 量死亡。2013年，美國也報(bào)道P抓流行和爆發(fā)。目前，P抓已然成為規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)腹瀉病的主 要疫病之一，開展PEDV的研究刻不容緩。
[0003] PEDV基因組是具有浸染性的的單股正鏈RNA病毒，全長約28化，與其他冠狀病毒相 似，其基因組在胞漿中復(fù)制，病毒粒子也在胞漿中成熟。P抓V mRNA 5'端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu) (cap), 3'端有一個(gè)化ly(A)尾。陽DV至少含有7個(gè)開放閱讀框，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白W及3種非 結(jié)構(gòu)蛋白，從5'端至3'端依次為5'-r巧licase-(laAb)-S-0RF3-E-M-N-3'。研究表明，豬流 行性腹瀉病毒的纖突蛋白（Spike,S蛋白）由S基因編碼，屬于I型跨膜糖蛋白，是位于病毒粒 子表面的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約由1383個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)分子量為180kD-220kDnS蛋白從N端 至化端有Ξ個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是大的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、小的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其中胞外結(jié)構(gòu) 域可介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體、同時(shí)作為受體結(jié)合域與宿主細(xì)胞表面大分子結(jié)合;胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 域主要負(fù)責(zé)對(duì)整個(gè)S蛋白的固定。S蛋白不僅具有良好的免疫原性，而且在感染宿主體內(nèi)介 導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程起著重要作用。因此，P抓V S基因也常用作其的遺傳演化分析的祀 基因。
[0004] 目前，豬流行性腹瀉病的防控常采用返飼、自己苗或含CV777毒株的商品化疫苗等 措施，但效果不一。因此，開發(fā)含有流行株豬流行性腹瀉病毒抗原、且免疫效果好的疫苗成 為當(dāng)前該病防控的首要任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高滴度的地方豬 流行性腹瀉病毒變異株及其應(yīng)用。
[0006] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
[0007] 提供一種豬流行性腹瀉病毒地方變異株，該腹瀉病毒變異株保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中屯、，保藏名稱為豬流行性腹瀉病毒ZJ 15XS0101株（porcine Epidemic Diarrhea Virus strain ZJ 15XS0101，W下簡(jiǎn)稱陽DV)，保藏號(hào)為CCTCC N0:V201624。
[0008] 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒地方變異株，其特征在于，該病毒基因組 長為2806化t，從5'端到3'端依次為 5'-1711?、01^^1曰13、5、01?。3、6、]\1、閑^3'-17^，其中，01?。1曰13、 S、0RF3、E、M和N基因分別編碼6795、1386、224、76、226和441個(gè)氨基酸。
[0009] 豬流行性腹瀉病毒ZJ 15XS0101株的全基因組序列如SEQ ID N0:1所示;其5'-UTR 核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示，0RF lab基因氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，S基因氨基 酸序列如SEQ ID N0:4所示，0RF 3基因氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示，E基因氨基酸序列 如SEQ ID N0:6所示，Μ基因氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，N基因氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，3'-UTR核巧酸序列如沈Q ID N0:9所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述豬流行性腹瀉病毒地方變異株在制備豬流行性腹瀉病毒滅 活疫苗、弱毒疫苗，亞單位疫苗中的應(yīng)用，或者是在多品種菌和/或毒的聯(lián)合疫苗的開發(fā)中 的應(yīng)用；W及所述疫苗在檢測(cè)診斷中的應(yīng)用。
[0011] 上述腹瀉病毒變異株P(guān)EDV ZJ15XS0101分離自浙江蕭山某一發(fā)病豬場(chǎng)1日齡仔豬 的小腸組織。與現(xiàn)有疫苗毒株CV777相比，在S基因上存在著氨基酸的插入和突變，遺傳進(jìn)化 分析顯示兩者位于不同的基因群。陽DV ZJ15XS0101感染Vero細(xì)胞后9小時(shí)，即可產(chǎn)生細(xì)胞 病變，12-16小時(shí)可見細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、脫落和核胞體等病變。該病毒可在Vero細(xì)胞中穩(wěn)定地 連續(xù)傳代、高效增殖，第16代的病毒滴度可達(dá)107'啤數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCIDso)。在Vero 細(xì)胞上連續(xù)傳35代其S基因亦穩(wěn)定。該毒株對(duì)3日齡仔豬具有較強(qiáng)的致病性，仔豬給予 1000TCI化0后，48小時(shí)內(nèi)引起仔豬100%腹瀉，W及在96小時(shí)內(nèi)可致試驗(yàn)豬80% W上的死亡。 W此毒株為抗原制備的滅活疫苗免疫母豬，誘導(dǎo)母豬產(chǎn)生高效價(jià)抗體滴度、且維持時(shí)間 長，誘導(dǎo)的抗體可提供免疫母豬所產(chǎn)仔豬的被動(dòng)免疫保護(hù)。
[0012] 具體的處理步驟包括：
[001引（1)陽DV臨床陽性樣本采集及其全基因測(cè)序和分析；
[0014] (2)利用步驟（1)采集的陽性樣本，組織勻漿后加入膜酶過濾，收獲的濾液感染 Vero細(xì)胞(第一次感染細(xì)胞后收獲的病毒液標(biāo)記為PEDV ZJ15XS0101-P1代，W此類推為 陽DV ZJ15XS0101-P2……陽DV ZJ15XS0101_Pn);
[0015] (3)利用步驟(2)收獲的P1代次的病毒液進(jìn)行連續(xù)2次挑斑純化，經(jīng)過2次純化后的 病毒進(jìn)行鑒定；
[0016] (4)對(duì)步驟(3)鑒定正確的病毒繼續(xù)在Vero E6細(xì)胞上進(jìn)行傳代，并對(duì)不同代次的 ZJ15XS0101進(jìn)行細(xì)胞病變觀察、病毒滴度測(cè)定、外源微生物檢測(cè)W及S基因克隆分析；
[0017] (5)利用步驟(4)獲得的P16代次病毒，取1000TCID50進(jìn)行3日齡檢測(cè)合格的仔豬攻 毒，W觀察其致病性；
[0018] (6)利用步驟(4)獲得病毒液，用滅活劑滅活后進(jìn)行母豬產(chǎn)前免疫，免疫后用化ISA 檢測(cè)母豬中的抗體水平，同時(shí)對(duì)其所產(chǎn)仔豬利用步驟(5)建立的方法進(jìn)行攻毒，W觀察該毒 株誘導(dǎo)抗體能力及被動(dòng)免疫保護(hù)效果。
[0019] 本發(fā)明中，在步驟（1)和(4)中PEDV ZJ15XS0101株病毒基因片段擴(kuò)增時(shí)，利用RT- PCR方法和下述特異性引物：
[0020]
[0021]
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0023] 該毒株可應(yīng)用于豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗、弱毒疫苗，亞單位疫苗、或多品種菌 和/或毒的聯(lián)合疫苗開發(fā)及在檢測(cè)診斷中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0024] 圖 1 陽DV-ZJ15XS0101-P 巧 PP10 感染 Vero 細(xì)胞病變。
[0025] 圖2病毒空斑試驗(yàn)。
[00%] 圖3陽DV ZJ15XS0101分離株病毒液的Western Blot分析。
[0027] 圖4陽DV ZJ15XS0101分離株的IFA檢測(cè)。
[0028] 圖5陽DV ZJ1放S0101P10透射電鏡觀察。
[00巧]圖6陽DV ZJ15XS0101感染vero細(xì)胞后不同時(shí)間細(xì)胞病變。
[0030]圖7不同感染川欠獲)時(shí)間對(duì)病毒TCIDso (A)和RNA拷貝數(shù)化)的影響。
[0031 ]圖8凍融次數(shù)對(duì)病毒TCIDsoU)和RNA拷貝數(shù)化)的影響。
[0032] 圖9陽DV ZJ15XS0101不同代次、不同接種比、不同吸附時(shí)間對(duì)病毒TCIDso和RNA拷 貝數(shù)的影響.A、C和B、D分別為P15和P25代次病毒；1:25和1:50分別為20化L和1(Κ)化的病毒 液接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶后加入終體積為5mL培養(yǎng)液。
[0033] 圖10攻毒組仔豬和空白對(duì)照組仔豬組織病理學(xué)觀察和免疫組化分析。
[0034] 圖11糞樣和/或嘔吐物病毒分離結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 毒株說明：
[0036] 本發(fā)明通過分離鑒定獲得了豬流行性腹瀉病毒地方變異株，該病毒變異株保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，該中屯、的地址為中國武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)。 提供保藏的生物材料(株)為豬流行性腹瀉病毒ZJ15XS0101株，保藏名稱為豬流行性腹瀉病 毒ZJ15XS0101 株（Porcine Epidemic Diarrhea Virus S化ain ZJ 15XS0101)，保藏號(hào)為 CCTCC備:￥201624，保藏日期為2016年5月20日。
[0037] 實(shí)施例1:豬流行性腹瀉病毒臨床株(P邸V ZJ15XS0101)分離純化鑒定
[003引 1.1病料來源
[0039] 病料來源于2015年1月浙江省蕭山某一發(fā)病豬場(chǎng)，母豬規(guī)模1300頭，1日齡發(fā)病哺 乳仔豬表現(xiàn)為嘔吐，而后出現(xiàn)腹瀉、脫水和死亡等臨床癥狀，小于7日齡仔豬的平均發(fā)病率 為48%，平均死亡率為60%。剖檢可見小腸、腸系膜和腸系膜淋己結(jié)出血，腸管氣脹、變薄等 病變。研究采集1日齡發(fā)病哺乳仔豬小腸組織用于病毒分離。
[0040] 1.2病毒分離
[0041] 過濾的組織懸液感染Vero細(xì)胞后，第一代病毒于2加左右出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、脫落及合 胞體（圖1)。隨著病毒傳代次數(shù)的增加，第10代病毒液感染細(xì)胞，于Uh出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn) 為細(xì)胞圓縮、脫落及合胞體(圖1)。
[0042] 1.3陽DV流行株挑斑純化
[0043] 圖2為空斑的觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，ZJ15XS0101-P2代在培養(yǎng)30h后出現(xiàn)的空斑。重 復(fù)2次挑斑純化，獲得ZJ15XS0101-P5代次病毒l(K)yL，將獲得的病毒液轉(zhuǎn)接于12-well板逐 步進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0044] 1.4PEDV臨床分離株不同代次病毒拷貝數(shù)檢測(cè)
[0045] 陽DV ZJ15XS0101分離株P(guān)1、？10、？12、？14和？16代次9?〇?檢測(cè)結(jié)果見表1。結(jié)果顯 示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為103.5 %，斜率為3.324，R2 = 0.976。不同代次PEDV平均RNA拷貝 數(shù)維持在較高水平(〉7.98Logi〇AiL)，且相對(duì)穩(wěn)定。
[0046] 表1不同代次陽DV ZJ15XS0101分離株RNA拷貝數(shù)、病毒滴度和外源微生物檢測(cè)
[0047]
[004引 1.5陽DV臨床分離株WB分析
[0049] PEDV ZJ15XS010P1和P10代次病毒液的WB分析結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，PEDV ZJ15XS010P巧日P10代次病毒液在預(yù)測(cè)的55-70kDa處可見與抗陽DV N單抗(mAb-N)反應(yīng)的特 異性條帶，而陰性(Neg-Ab)單抗則無條帶。
[00加]1.6陽DV臨床分離株IFA分析
[0化1] 陽DV ZJ15XS010P10代病毒液感染Vero細(xì)胞1地后IFA檢測(cè)結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示， 經(jīng)DAPI染色后可見明顯的合胞體，而且在胞漿中有特異的紅色巧光。
[0化2] 1.7P邸V ZJ15XS010P10電鏡觀察
[0化3] 收獲陽DV ZJ15XS010P10感染化的Vero細(xì)胞后，透射電鏡觀察結(jié)果見圖5。結(jié)果顯 示，視野中存在與冠狀病毒相似的病毒粒子，病毒呈球形或多形性，大小為80-120nm，包含 囊膜、病毒表面為20nm球棒狀的"刺突"蛋白。
[0化4 ] 1.8陽DV-Z J1放SO 101S基因序列分析
[0化5] PEDV-ZJ15XS0101S基因均為4161bp，編碼1387個(gè)氨基酸，其全基因組序列如SEQ ID NO: 1所示。與GenBank中參考毒株氨基酸核巧酸和氨基酸的相似性分別為93.8%- 99.8%和92.1 %-99.9%。運(yùn)些毒株的S基因與參考毒株相比，除了存在點(diǎn)突變，還存在插 入、缺失和重組現(xiàn)象，選取其中變異性較大的S1序列與經(jīng)典毒株CV777、SM98、attDR13、 virDR13進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)W下堿基變化，在第58位至61位插入NQGV、在136位插入N、在225位 堿基由E突變?yōu)镼等。
[0化6] 1.9P邸V S基因的遺傳進(jìn)化分析
[0化7] 基于陽DV S基因的陽DV ZJ15XS0101分離株及參考株遺傳進(jìn)化分析顯示，P抓V可 分為2群(Group巧日Group II)，兩個(gè)群分別又可W分為Group I a和Group I bW及Group II a和Group II b兩個(gè)亞群。其中Group I a亞群包含了CV777、SM98和DR13等疫苗株，在 Group I b亞群中除了KNU 1406(2014South Korea)、15V010-B化-2015(2015Belguim)和 CH-STC-12(2014CMna)外，其余均為2011年W前獲得的PEDV毒株;在Group II a亞群中包 含了3個(gè)韓國的毒株和1個(gè)中國的分離株，絕大部2010年W后的PEDV ZJ15XS0101分離株均 位于Group II b亞群，也包括了2013年W后分離的10個(gè)浙江及1株上海分離株。
[0化引實(shí)施例2:陽DV ZJ15XS0101生長特性研究
[0059] 2.1不同收獲時(shí)間對(duì)PEDV滴度和RNA拷貝數(shù)的影響
[0060] 陽DV ZJ15XS0101P16感染vero細(xì)胞后，不同感染時(shí)間細(xì)胞病變（圖6)W及收獲時(shí) 間的病毒滴度和RNA拷貝數(shù)（圖7)。結(jié)果顯示，P抓V ZJ15XS0101P16感染后10.5h，Vero細(xì)胞 即出現(xiàn)大面積的膜融合現(xiàn)象，14.化時(shí)，細(xì)胞空泡化明顯，19.化細(xì)胞基本全部脫落。經(jīng)檢測(cè)， 感染后14.化收獲的病毒液具有較高的病毒滴度;與10.5h、19.化和23.化收獲病毒液的病 毒滴度相比，14.化收獲病毒液的平均IgioTCI化ο分別高出ο. 33、0.32和ο. 49，但差異不顯著 。〉0.05)(圖7,4);口?。?酷拷貝數(shù)也是14.5}1時(shí)高，與23.5村目比，差異極顯著。<0.01)，但 與10.化和19.化之間差異不顯著(P〉0.05)(圖7，B)。
[0061 ] 2.2凍融對(duì)陽DV滴度和RNA拷貝數(shù)的影響
[0062] 反復(fù)凍融對(duì)PEDV滴度和RNA拷貝數(shù)的影響見圖8。結(jié)果顯示，1次凍融收獲后的病毒 液IgioTCIDso與2次、3次和次反復(fù)凍融相比，分別高0.55、0.33和0.44，但差異不顯著（P〉 0.05)(圖8，A);然而，RNA拷貝數(shù)W2次凍融后的最高，但與其他組的值差異不顯著(P〉0.05) (圖8，B)。
[0063] 2.3P邸V ZJ15XS0101不同代次、吸附時(shí)間和接種比例的吸附效率
[0064] P抓V ZJ15XS0101不同代次、吸附時(shí)間和接種比例的吸附效率見圖9 (接種前的病 毒核酸拷貝數(shù)設(shè)為1)。結(jié)果顯示，不同代次PEDV ZJ15XS0101株均可吸附于vero細(xì)胞，在1: 25接種比例條件下，P15代次病毒吸附效率高于P25代次，但差異不顯著，相反，在1:50接種 比例下，P25代次要高于P15代次，為疫苗毒株在規(guī)?；a(chǎn)提供了方便。不同吸附時(shí)間對(duì)病 毒的吸附效率具有一定的影響，在1:50接種條件下，高代次(P25)4小時(shí)吸附與1小時(shí)吸附差 異顯著(P〈〇. 05)。
[0(?日]實(shí)施例3:陽DV ZJ15XS0101不同代次遺傳穩(wěn)定性研究
[0066] 3.1不同代次陽DV ZJ15XS0101全序列分析
[0067] 陽DV ZJ15XS0101經(jīng)vero細(xì)胞連續(xù)傳代，第16代次和第32代次病毒進(jìn)行基因組全 序列與第1代次比較結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，3個(gè)代次病毒全基因組的核巧酸和氨基酸序列的 相似性達(dá)到99.99 %。
[006引表2不同代次ZJ15XS0101核巧酸和氨基酸差異 [0069]
[0070]
[0071] 實(shí)施例4:陽DV ZJ15XS0101株致病性及其最小攻毒劑量研究
[0072] 4.1P邸V ZJ1放S0101F16代次不同劑量攻毒后仔豬臨床表現(xiàn)
[0073] 表3為試驗(yàn)各組仔豬臨床癥狀及其統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果顯示，高劑量組仔豬在攻毒后 20h 80% (4/5)表現(xiàn)為腹瀉，其中1頭（2#仔豬)伴隨嘔吐癥狀(在其后的觀察中，僅在第84h 時(shí)有1頭仔豬表現(xiàn)為嘔吐外，其余均無嘔吐現(xiàn)象）；24h時(shí)腹瀉率達(dá)到100%，并W水樣腹瀉為 主(4/5); 36h時(shí)全部仔豬呈現(xiàn)水樣腹瀉;在攻毒后7加時(shí)，1頭死亡，9化時(shí)仔豬死亡率100 %， 并集中在89-9化之間死亡(4/5)。
[0074] 中劑量組仔豬在攻毒后，24h時(shí)，有3頭仔豬食欲下降、2頭停食，無嘔吐現(xiàn)象，4頭表 現(xiàn)為腹瀉，其中的2頭為水樣腹瀉;3化時(shí)，100 %試驗(yàn)仔豬表現(xiàn)為腹瀉，無嘔吐現(xiàn)象;64h時(shí)，1 頭仔豬表現(xiàn)嘔吐;在攻毒后7化時(shí)，1頭死亡，92-144h之間死亡4頭(4/5)。
[0075] 低劑量組仔豬在攻毒后2地時(shí)，全部仔豬食欲下降，1頭仔豬表現(xiàn)為腹瀉;3化時(shí)，有 2頭表現(xiàn)為水樣腹瀉;4化時(shí)，全部仔豬呈現(xiàn)水樣腹瀉癥狀，其間1頭（11#)伴有嘔吐；攻毒后 第13化和144h分別死亡1頭，160h和164h分別死亡1頭，但至試驗(yàn)結(jié)束(第7d)仍有1頭仔豬存 活。
[0076] 空白對(duì)照組于均正常。
[0077] 表3陽DV ZJ15XS0101-P16代攻毒后仔豬臨床癥狀統(tǒng)計(jì)a [007引
[0079]
[0080] a,統(tǒng)計(jì)結(jié)果W天(24h)為單元，每天觀察6次，每個(gè)統(tǒng)計(jì)單位中任何次觀察結(jié)果表 現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀即為該次統(tǒng)計(jì)單元的臨床癥狀;b，死亡率統(tǒng)計(jì)采用累加;C，其中1頭死 亡;d，9化，仔豬全部死亡；e，7化，1頭仔豬死亡;f，9化死亡2頭;g，136h和14地分別死亡1頭； h，13化和14地分別死亡1頭；i，160h和16地分別死亡1頭。
[0081 ] 4.2仔豬組織病理學(xué)觀察
[0082] 攻毒組死亡仔豬和空白對(duì)照組仔豬組織病理學(xué)觀察和免疫組化分析見圖10("^" 表示免疫組化陽性）。結(jié)果顯示，攻毒組仔回腸腸壁變薄，小腸絨毛稀疏，較短，粘膜層變薄， 隱窩較淺，局部可見小腸上皮細(xì)胞脫落壞死;空腸腸壁變薄，小腸絨毛稀疏，較短，粘膜層變 薄，隱窩較淺，局部可見小腸上皮細(xì)胞脫落壞死;十二指腸粘膜結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞界限不清 晰，小腸絨毛較純，隱窩較淺;腸系膜淋己結(jié)有淋己細(xì)胞脫落壞死、淋己細(xì)胞密度稍有減少； 空白對(duì)照組觀察各組織未見異常。
[0083] 免疫組化分析顯示，空白對(duì)照組均為陰性。然而，攻毒組仔豬攻毒組回腸免疫陽性 反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量較多，Ξ五成群或散在分布于粘膜上皮和固有層中，著色較深，免疫反應(yīng)產(chǎn)物 也見彌散分布于小皮細(xì)胞表面和細(xì)胞間隙結(jié)締組織中；空腸腸壁偏薄，絨毛純而短，隱窩 淺，小腸絨毛固有層粘膜上皮可見Ξ五成群的陽性細(xì)胞分布，陽性細(xì)胞在小腸絨毛頂部分 布較多。十二指腸小腸絨毛固有層可見較多的棟黃色陽性細(xì)胞和粘膜上皮中散在分布或Ξ 五成群的陽性小腸上皮細(xì)胞，陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棟黃色，主要位于陽性細(xì)胞的胞質(zhì)中，胞核著 色較淺;腸系膜淋己結(jié)有少量淋己細(xì)胞脫落壞死，有少量淋己細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色陽性。
[0084] 4.3試驗(yàn)仔豬肛式子中病毒含量檢測(cè)
[0085] PEDV攻毒后仔豬肛式子中PEDV RNA拷貝數(shù)見表4。結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)仔豬在第0 天時(shí)均為陰性。不同劑量攻毒組攻毒后第1天即可檢測(cè)到病毒，直至試驗(yàn)結(jié)束。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分 析，僅在第1天時(shí)，高劑量攻毒組仔豬肛拭子中PEDV RNA拷貝數(shù)（1 glOcopies/化）（8.61 ± 0.029)與中劑量(7.66±0.428)、低劑量組(5.60±3.441)之間的差異極顯著。<0.01)，中 劑量與低劑量組之間的差異顯著(P<〇. 05)。
[0086] 表4陽DV攻毒后仔豬肛拭子中陽DV RNA拷貝數(shù)（IglOcopies/yL)
[0087]
[0088] *,ND means no detected.&，ΝΑ means no assay.
[0089] 4.4高劑量攻毒組仔豬組織臟器中病毒含量檢測(cè)
[0090] 高劑量攻毒組仔豬組織中陽DV RNA拷貝數(shù)見表5。結(jié)果顯示，P抓V在不同臟器中分 布存在一定的差異，RNA拷貝數(shù)的幾何均數(shù)依次為空腸〉十二指腸〉回腸〉腸系膜淋己結(jié)〉腎 臟〉胃〉肺口淋己結(jié)。
[0091] 表5中劑量試驗(yàn)組仔組織中陽DV RNA拷貝數(shù)（IglOcopiesAiL)
[0092]
[0093] 4.5病毒分離和檢測(cè)
[0094] 采集的糞樣進(jìn)行病毒分離第一次盲傳后，于30h左右可見細(xì)胞圓縮，形成合胞體， 細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落等(圖11)，盲傳的病毒液化q-man檢測(cè)均為陽性。
[00M] 實(shí)施例5:基于陽DV ZJ15XS0101毒株的滅活疫苗免疫效果觀察
[0096] 5.1抗原制備
[0097] 將ZJ15XS0101-P29代病毒液混合，測(cè)定TCIDsq和外源微生物檢測(cè)。檢測(cè)合格后加入 0.4 %甲醒(v/v 37 % )，37 °C滅活2地，滅活后進(jìn)行滅活檢驗(yàn):取滅活的病毒液0.5ml，接種于 25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶Vero細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 °C吸附比，補(bǔ)液至10血。放置5 %C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小 時(shí)，收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，凍融3次，作為盲傳的接種物。盲傳2代，不應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變。
[0098] 5.2ZJ15XS0101 滅活疫苗制備
[0099] 將滅活檢驗(yàn)合格的病毒液與等量的含量為20 %的滅菌氨氧化侶膠鹽水稀釋液均 勻混合，在室溫下沉淀24h，吸出2Λ上清液，即按全量濃縮至3/5，加入終含量為1/1.5萬-1/ 3萬硫柳隸溶液，充分混合，即為制成陽DV ZJ15XS0101毒株的滅活疫苗。
[0100] 5.3P邸V ZJ15XS0101氨氧化侶膠滅活疫苗免疫后母豬血清抗體的轉(zhuǎn)化
[0101] 母豬于產(chǎn)前28天和14天經(jīng)PEDV ZJ15XS0101氨氧化侶膠滅活疫苗兩次免疫后，血 清中抗PEDV-IgG抗體化ISA檢測(cè)結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，母豬在免疫后第0天、28天和56天時(shí)， 血清中抗陽DV-IgG抗體的S/P值分別為1.33±0.273、5.58±0.17和5.00±0.68，免疫第28 天后抗體滴度的離散度為7.48%。說明？60￥2扣5乂50101氨氧化侶膠滅活疫苗可^誘導(dǎo)特 異性的抗體產(chǎn)生，不僅效價(jià)高、而且產(chǎn)生抗體的滴度較為一致。
[0102] 表6免疫后母豬血清中抗PEDV-IgG抗體的變化(S/P)
[0103]
[0104] 5.4仔豬血清抗體檢測(cè)
[01化]P抓V ZJ15XS0101氨氧化侶膠滅活疫苗免疫母豬后，其所產(chǎn)仔豬血清中抗PEDV- IgG抗體化ISA檢測(cè)結(jié)果顯示，5頭3日齡仔豬血清中抗PEDV-IgG抗體的S/P值分別為6.44、 6.30、6.22、6.46和5.95。結(jié)果說明，母源抗體可W通過初乳提供仔豬的保護(hù)。
[0106] 5.5血清和初乳體外中和效果
[0107] 采用固定病毒-稀釋血清體外中和試驗(yàn)，對(duì)收集陽DV ZJ15XS0101氨氧化侶膠滅活 疫苗免疫母豬后第28天的血清和初乳分別中和價(jià)測(cè)定，經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，滅活疫苗可 誘導(dǎo)血清和初乳的中和抗體產(chǎn)生，且中和價(jià)較高(表7)。
[0108] 表7母豬免疫后28天血清和初乳體外中和價(jià)
[0109]
[0110] 5.6仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)
[0111] 選取上述1頭經(jīng)PEDV ZJ15XS0101氨氧化侶膠滅活疫苗免疫的母豬，對(duì)其所產(chǎn)仔豬 4化進(jìn)行ImL(含103TCI化〇)PEDV 15ZJXS0101P16口服攻毒。在攻毒前、后仔豬采用自由晚吸 母乳。經(jīng)7天觀察，5頭仔豬無腹瀉、嘔吐和死亡，全部存活。攻毒后2天的仔豬肛拭子經(jīng)巧光 定量PCR檢測(cè)，P邸V 15Z JXS0101檢測(cè)為陰性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒地方變異株，其特征在于，該豬流行性腹瀉病毒地方變異株 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏名稱為豬流行性腹瀉病毒ZJ15XS0101株，保藏號(hào)為 CCTCC N0:V201624。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒地方變異株，其特征在于，該病毒基因組長 為28067nt，從5'端到3'端依次為5'-17^、01^1313、5、01^3』、]\^和3'-17^，其中，01^1313、5、 0RF3、E、M和N基因分別編碼6795、1386、224、76、226和441個(gè)氨基酸，其全基因組序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 權(quán)利要求1所述豬流行性腹瀉病毒地方變異株在制備豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗、 弱毒疫苗，亞單位疫苗中的應(yīng)用，或者是在多品種菌和/或毒的聯(lián)合疫苗的開發(fā)中的應(yīng)用； 以及所述疫苗在檢測(cè)診斷中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/215GK106011084SQ201610547327
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】李肖梁, 方維煥, 單穎
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)