一種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基，添加組分及其濃度如下：牛血清，160?220ml/L；PHA?植物血球凝集素，16?30g/L；L?谷氨酰胺，8?12g/L；谷胱甘肽，8?14g/L；亞油酸，0.1?0.3g/L；硫辛酸，0.1?0.3g/L；各添加組分的濃度以外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基能夠使得外周血細(xì)胞快速、大量的增殖，增殖效果好，培養(yǎng)時間短，特別適合外周血細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系。
【專利說明】
-種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、新藥研發(fā)等各個領(lǐng)域，成為最重要的基礎(chǔ) 科學(xué)之一。
[0003] 關(guān)于體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，現(xiàn)有技術(shù)中除了常規(guī)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等二維的 細(xì)胞培養(yǎng)體系，現(xiàn)在已研發(fā)出=維培養(yǎng)體系，例如目前市售的高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶，是一種既 可W適用于貼壁細(xì)胞，又可W適用于懸浮細(xì)胞的=維培養(yǎng)體系，可W快速地培養(yǎng)大量細(xì)胞， 且可W進(jìn)行為期半年W上的長期細(xì)胞培養(yǎng)，不需要經(jīng)常更換耗材，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿 和培養(yǎng)瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本領(lǐng)域研發(fā)人員的廣泛關(guān)注。
[0004] 然而，現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基大多適用于中等規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)體 系，一般來說無法適用于大規(guī)模的、高密度的細(xì)胞培養(yǎng);另一方面，現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)基僅 適用于培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等二維的細(xì)胞培養(yǎng)體系，無法適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶運樣 的=維培養(yǎng)體系。
[0005] 現(xiàn)在亟待開發(fā)專用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種適用于高密 度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng) 基為RMPI 1640培養(yǎng)基;所述添加組分及其濃度如下：牛血清，160-220ml/L; PHA-植物血球 凝集素，16-30g/l; k谷氨酷胺，8-12g/l;谷脫甘膚，8-14g/l;亞油酸，0.1-0.3g/l;硫辛酸， 0.1-0.3g/l;各添加組分的濃度W所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)。
[0007] 優(yōu)選的，W所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉 量為10-15g/L。更優(yōu)選的，W所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述RMPI 1640培養(yǎng) 基的干粉量為13.6g/L。
[000引優(yōu)選的，所述添加組分中，所述牛血清的濃度為200ml/L，所述PHA-植物血球凝集 素的濃度為24g/L，所述k谷氨酷胺的濃度為llg/L，且所述谷脫甘膚的濃度為12g/L。
[0009] 優(yōu)選的，所述添加組分中，所述亞油酸的濃度為0.2g/L，所述硫辛酸的濃度為 0.2g/L〇
[0010] 優(yōu)選的，所述添加組分還包括青霉素和鏈霉素，所述青霉素的濃度為IX 105-4X i〇5iu/l，所述鏈霉素的濃度為1X i〇5-4x i〇5iu/l。
[0011] 優(yōu)選的，所述添加組分還包括酪紅鋼，所述酪紅鋼的濃度為5-7mg/L。
[001 ^ 優(yōu)選的，所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的抑值為7.3~7.5。
[0013]本發(fā)明另一方面提供了上述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基在高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系中的應(yīng) 用。
[0014] 優(yōu)選的，所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系為高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶。
[0015] 本發(fā)明的適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，采用RMPI1640培養(yǎng)基 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基W及特定的添加組分的組合，尤其是牛血清、PHA-植物血球凝集素、k谷氨 酷胺和谷脫甘膚，四者同時滿足上述的濃度范圍時，能夠使得外周血細(xì)胞快速、大量的增 殖，特別適合外周血細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系。
【具體實施方式】
[0016] W下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于運些具體實施方 式。
[0017] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞 培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基;所述添 加組分及其濃度如下：牛血清，160-220ml/L; PHA-植物血球凝集素，16-30g/l; k谷氨酷胺， 8-12g/l;谷脫甘膚，8-14g/l;亞油酸，0.1-0.3g/l;硫辛酸，0.1-0.3g/l;各添加組分的濃度 W所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)。
[0018] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的研究試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外周血細(xì)胞培養(yǎng)基采用RMPI 1640 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基W及上述特定的添加組分的組合，尤其是牛血清、PHA-植物血球凝 集素 a-谷氨酷胺和谷脫甘膚，四者同時滿足上述的濃度范圍時，能夠使得外周血細(xì)胞快 速、大量的增殖，特別適合外周血細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系。
[0019] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，W所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所 述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為10-15g/L。
[0020] 在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為13.6g/ L。
[0021] 在本發(fā)明的另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述添加組分中，所述牛血清的濃度為 200ml/L，所述PHA-植物血球凝集素的濃度為24g/L，所述k谷氨酷胺的濃度為llg/L，且所 述谷脫甘膚的濃度為12g/L。當(dāng)本發(fā)明的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基中，RMPI 1640培養(yǎng)基的濃度，W 及牛血清、PHA-植物血球凝集素、k谷氨酷胺和谷脫甘膚同時采用上述特定的濃度時，符合 外周血細(xì)胞的高密度培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，特別適合外周血細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系，尤其 是諸如高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶之類的=維培養(yǎng)體系，具有較好的增殖效果。
[0022] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述添加組分中，所述亞油酸的濃度為0.2g/ L，所述硫辛酸的濃度為0.2g/L。運兩種物質(zhì)W及特定濃度的組合對于外周血細(xì)胞的生長起 到保護(hù)作用，尤其對于外周血細(xì)胞的高密度培養(yǎng)體系，能夠增加外周血細(xì)胞的存活率。
[0023] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述添加組分還可W抗生素，例如包括青霉素 和鏈霉素；所述青霉素的濃度為1 X 105-4 X 105IU/L，所述的鏈霉素濃度為1 X 105-4X 1〇5iU/L。更優(yōu)選的，青霉素的濃度為2X105IU/L，鏈霉素濃度為2X105IU/L。運兩種抗生素 組合及其特定的濃度，特別適合外周血細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系，抗菌效果優(yōu)異，細(xì)胞存 活率高。
[0024] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述添加組分還包括酪紅鋼，所述酪紅鋼的 濃度為5-7mg/L。
[0025] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將該無血清培養(yǎng)基的pH值控制在7.3~7.5。
[0026] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的外周細(xì)胞培養(yǎng)基是專用于高密度細(xì)胞 培養(yǎng)桶的外周細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0027] 實施例1
[0028] 實施例1的適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的配制過程如下：
[0029] 步驟1):在無菌條件下將合成的RPMI1640干粉在電子天平上稱取136g后置于消毒 容器內(nèi)，加7.化重蒸水稀釋后攬拌均勻獲得基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0030] 步驟2):將添加組分：化牛血清、240g PHA-植物血球凝集素、llOgレ谷氨酷胺、 120g谷脫甘膚、1.?青霉素(相當(dāng)于2X106IU)、2g鏈霉素(相當(dāng)于2X106IU)、2g亞油酸、2g硫 辛酸和60mg酪紅鋼依次加入步驟1)獲得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混勻；
[0031] 步驟3):過濾滅菌，再調(diào)節(jié)抑值至7.4±0.1，最后加入重蒸水將體積調(diào)節(jié)至lOL
[0032] 步驟4):培養(yǎng)基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環(huán)境)備用。 [。。扣]實施例2
[0034] 實施例2的適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的配制過程如下：
[0035] 步驟1):在無菌條件下將合成的RPMI1640干粉在電子天平上稱取140g后置于消毒 容器內(nèi)，加7.化重蒸水稀釋后攬拌均勻獲得基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0036] 步驟2):將添加組分：1.化牛血清、260g PHA-植物血球凝集素 、lOOg k谷氨酷胺、 nOg谷脫甘膚、2g青霉素（相當(dāng)于3.3X106IU)、3g鏈霉素（相當(dāng)于3X106IU)、1.8g亞油酸、 1.8g硫辛酸和66mg酪紅鋼依次加入步驟1)獲得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混勻；
[0037] 步驟3):過濾滅菌，再調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1，最后加入重蒸水將體積調(diào)節(jié)至lOL
[0038] 步驟4):培養(yǎng)基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環(huán)境)備用。
[0039] 應(yīng)用例1
[0040] 用酒精消毒手指皮膚，用采血針刺破皮膚，用含肝素鋼的中空采血管采集外周血， 輕輕搖晃混勻，將5ml外周血加入至上述實施例1獲得的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將外周血 細(xì)胞濃度稀釋至1.2 X 106個/ml。
[0041 ]采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶（參見FiberCell細(xì)胞 培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)品銷售網(wǎng)頁），W及本發(fā)明實施例1獲得的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0042] 將5ml外周血細(xì)胞濃度為1.2 X106個/ml的培養(yǎng)基用注射器載入上述的高密度細(xì) 胞培養(yǎng)桶中，再將25ml外周血培養(yǎng)基加入到50ml高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶儲液瓶中（外周血細(xì)胞 的接種密度為2 X 105個/ml);具體地，儲液瓶中的培養(yǎng)基通過硅膠管與細(xì)胞培養(yǎng)桶連接，在 蠕動累的作用下，持續(xù)循環(huán)流動，培養(yǎng)基通過細(xì)胞培養(yǎng)桶的中空纖維進(jìn)行交換，給細(xì)胞培養(yǎng) 桶內(nèi)的細(xì)胞不斷的提供營養(yǎng)物質(zhì)；將整個高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶放入5%C02,37°C的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。
[0043] 應(yīng)用例2:具體過程與應(yīng)用例1相同，不同在于采用實施例2獲得的外周血細(xì)胞培養(yǎng) 基進(jìn)行外周血細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0044] 效果數(shù)據(jù)
[0045] 對比例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細(xì)胞培養(yǎng)桶W及市售的 青島萊佛品牌的RPMI 1640外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程與應(yīng)用例1相同，具體不再寶述。
[0046] 對比例A:采用市售的Corning品牌T25型號的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，W及市售的青島萊佛品 牌的RPMI 1640外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，將5ml萊佛品牌的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基用移液管轉(zhuǎn)移至 T25培養(yǎng)瓶中，再加入1ml外周血細(xì)胞濃度為1.2 X 106個/ml的培養(yǎng)基(外周血細(xì)胞的接種密 度為2 X 105個/ml)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶放入5 % C〇2，37 °C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。
[0047] 分別檢測應(yīng)用例1、應(yīng)用例2、對比例1和對比例A的細(xì)胞增殖速率W及細(xì)胞存活率。 [004引檢測細(xì)胞增殖速率
[0049] 應(yīng)用例1和應(yīng)用例2, W及對比例1和對比例A，均在培養(yǎng)1、3和6天后，分別取樣培養(yǎng) 液，進(jìn)行細(xì)胞濃度的檢測，檢測結(jié)果參見下表1。
[(K)加]表1 [0化1 ]
[0052] 檢測細(xì)胞存活率
[0053] 培養(yǎng)6天后，收集各組的培養(yǎng)液，進(jìn)行流式檢測。檢測結(jié)果如下：
[0054] 應(yīng)用例1的細(xì)胞存活率:98.4% ;應(yīng)用例2的細(xì)胞存活率:96.7% ;對比例1的細(xì)胞存 活率:84.2% ;對比例A的細(xì)胞存活率:88.6%。
[0055] 將表1中的結(jié)果進(jìn)行對比可W看出，一方面，對比例1的細(xì)胞增殖速率W及細(xì)胞存 活率(細(xì)胞培養(yǎng)效果）的結(jié)果稍劣于對比例A的結(jié)果，運說明：常規(guī)培養(yǎng)基更適合于諸如細(xì)胞 瓶之類的傳統(tǒng)小規(guī)模培養(yǎng)體系，不適合高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系；另一方面，本發(fā)明應(yīng)用例1的 細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞存活率遠(yuǎn)高于對比例1的，運說明：本發(fā)明實施例的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基 相比常規(guī)的RMPI外周血細(xì)胞培養(yǎng)基更適合于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系。
[0056] 應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加 W描述，但并非每個實施方式僅包含一 個獨立的技術(shù)方案，說明書的運種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說 明書作為一個整體，各實施方式中的技術(shù)方案也可W經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W理解的其他實施方式。
[0057] 上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說 明，它們并非用W限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式 或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種適用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組 分，其中， 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基； 所述添加組分及其濃度如下： 牛血清，160-220ml/L; PHA-植物血球凝集素，16-30g/L; L-谷氨酰胺，8_12g/L; 谷胱甘肽，8-14g/L; 亞油酸，〇· l-〇.3g/L; 硫辛酸，〇.l-〇.3g/L; 各添加組分的濃度以所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)。2. 如權(quán)利要求1所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 以所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為10-15g/ L〇3. 如權(quán)利要求2所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 以所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的總體積為基準(zhǔn)，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為13.6g/ L〇4. 如權(quán)利要求2所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 所述添加組分中，所述牛血清的濃度為200ml/L，所述PHA-植物血球凝集素的濃度為 24g/L，所述L-谷氨酰胺的濃度為llg/L，且所述谷胱甘肽的濃度為12g/L。5. 如權(quán)利要求2所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 所述添加組分中，所述亞油酸的濃度為〇.2g/L，所述硫辛酸的濃度為0.2g/L。6. 如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 所述添加組分還包括青霉素和鏈霉素，所述青霉素的濃度為1\1〇5-4乂1()511]/1，所述 鏈霉素的濃度為1 X 1〇5_4 X 105IU/L。7. 如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 所述添加組分還包括酚紅鈉，所述酚紅鈉的濃度為5_7mg/L。8. 如權(quán)利要求7所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于： 所述外周血細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值為7.3~7.5。9. 如權(quán)利要求1至8中任意一項所述的外周血細(xì)胞培養(yǎng)基在高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系中的 應(yīng)用。10. 如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于:所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)體系為高密度細(xì)胞培養(yǎng) 桶。
【文檔編號】C12N5/078GK106047806SQ201610693937
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發(fā)明人】顏學(xué)恒, 周艷
【申請人】上海逍鵬生物科技有限公司