Car?t細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CAR?T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用，其中，所述CAR?T細(xì)胞的CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為CD28?X?ITAM，其中，所述X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。本發(fā)明CAR?T細(xì)胞的chA21scFv能夠表達(dá)抗HER2單克隆抗體，且以HER2蛋白為靶向直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的HER2蛋白，從而活化T細(xì)胞而分泌殺傷表達(dá)HER2蛋白的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子。
【專利說明】
CAR-T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及T淋己細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種CAR-T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] CAR-T細(xì)胞(Qiimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受體T細(xì)胞）即是表達(dá) 嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞，而CAR-T細(xì)胞的嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor， CAR)包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、較鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)S部分構(gòu)成。其中，胞膜外抗原結(jié)合 區(qū)是一段單鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(single chain Fv domain，scFv)，具有特異性識(shí)別并結(jié)合TAA (Uimor-associated antigen，腫瘤相關(guān)性抗原）的功能。scFv的構(gòu)成是將單克隆抗體的重 鏈可變區(qū)（the variable region of heavy chain, VH)和輕鏈可變區(qū)（the variable region of li曲t chain,化）用一可彎曲的多膚接頭化inker)將VH和化連接起來，構(gòu)成￥護(hù) Linker-VU^VkLinker-VH。較鏈區(qū)通常是由免疫球蛋白超家族組成，比如CD8、CD28和IgG。 胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包括共刺激分子kostimulatory molecule,CM)和免疫受體酪氨酸活化基 序（immunorec邱tor tyrosine-based activation motifs, ITAM)，其中，CM通常為CD28， ITAM通常為CD3C或化eRI 丫。表達(dá)CAR的T細(xì)胞可通過scFv直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的 TAA，CA時(shí)尋信號(hào)傳入T細(xì)胞內(nèi)，激活T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子包括穿孔素、顆粒酶、INF- 丫、TNF-a 等，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用。因此，CAR-T細(xì)胞是MHC非限制性的。CAR-T細(xì)胞將抗體-抗 原特異性結(jié)合能力W及T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷功能結(jié)合于一體，是免疫抗腫瘤治療的重要方法。 嵌合性抗原受體方法應(yīng)用的關(guān)鍵是確定一種腫瘤相關(guān)性抗原，在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而 在正常組織中無表達(dá)或者低表達(dá)。
[0003] 原癌基因人上皮生長因子受體2化uman邱idermal growth factor receptor 2， 化r-2/neu)又稱肥R2或c-erbB-2基因，在多種腫瘤的發(fā)病及臨床進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，體 外與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)己明確顯示化r-2/neu基因擴(kuò)增、蛋白過度表達(dá)在致瘤轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展中起 著關(guān)鍵作用。研究證實(shí)：30% W上的人類腫瘤組織中，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、輸卵 管癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、頭頸部鱗癌、非小細(xì)胞性肺癌等，均伴有 Her-2/neu基因的擴(kuò)增及pl85蛋白的過度表達(dá)，而正常組織中pl85蛋白為陰性或微量表達(dá)。 而在乳腺癌中，大約有1/3的病人過表達(dá)肥R2蛋白。過表達(dá)皿R2蛋白使腫瘤的侵襲性更強(qiáng)， 是乳腺癌病人預(yù)后不良的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。盡管抗肥R2單克隆抗體(如曲妥株單抗)在臨床 的應(yīng)用使部分病人獲益，但是其價(jià)格昂貴，很大程度上限制了其大規(guī)模臨床應(yīng)用。皿R2蛋白 位于細(xì)胞表面，容易被抗體識(shí)別，因此，皿R2蛋白可作為CAR-T細(xì)胞抗腫瘤治療的一個(gè)理想 祀點(diǎn)。
[0004] 然而，現(xiàn)有技術(shù)中并未提供表達(dá)抗皿R2單克隆抗體的CAR-T細(xì)胞，即現(xiàn)有的CAR-T 細(xì)胞并不能W皿R2蛋白為祀向而直接識(shí)別并結(jié)合肥R2蛋白，導(dǎo)致CAR無法將信號(hào)傳入T細(xì)胞 內(nèi)，而無法分泌殺傷高表達(dá)肥R2蛋白的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種CAR-T細(xì)胞，旨在表達(dá)抗皿R2單克隆抗體，而W HER2蛋白為祀向直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的HER2蛋白。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種CAR-T細(xì)胞，所述CAR-T細(xì)胞的CAR包括胞膜外抗 原結(jié)合區(qū)、較鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的 cM21scFv;所述胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM，其中，所述X為10)5、〔0137、〔0134、〔080或 者CD86共刺激分子。
[0007] 優(yōu)選地，所述X為IC0S共刺激分子。
[000引本發(fā)明還提供一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，包括步驟如下：
[0009] 構(gòu)建CAR表達(dá)載體，其中，所述CAR表達(dá)載體的CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、較鏈區(qū) 和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21scFv，所述胞內(nèi)信 號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM，所述X為10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子；
[0010] 包裝所述CAR表達(dá)載體，而制得感染混合物；
[0011] 將所述感染混合物感染T細(xì)胞，而制得CAR-T細(xì)胞。
[0012] 優(yōu)選地，所述構(gòu)建CAR表達(dá)載體的過程中，包括步驟如下：
[0013] 獲取所述chA21scFv的基因片段、所述較鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、 所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段；
[0014] 提供引導(dǎo)鏈，基因融合所述引導(dǎo)鏈與所述chA21scFv的基因片段，而形成引導(dǎo)鏈- chA21scFv；
[0015] 基因融合所述較鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述 ITAM的基因片段，而形成較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM;
[0016] 基因融合所述引導(dǎo)鏈-chA21scFv和所述較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導(dǎo)鏈- cM21S cFv-較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM;
[0017] 將所述引導(dǎo)鏈-cM21scFv-較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達(dá)載體。
[0018] 優(yōu)選地，所述獲取所述chA21scFv的基因片段、所述較鏈區(qū)的基因片段、所述CD28 的基因片段、所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段的過程中，包括步驟如下：
[0019] 獲取并激活PMBCs;
[0020] 提取所述PMBCs的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0021] 分別提供所述較鏈區(qū)的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物， 且均W所述PMBCs的cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得所述較鏈區(qū)的基因片段、所述 CD28的基因片段、所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段；
[0022] 提供所述chA21scFv的模板DNA和所述chA21scFv的引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得 所述cM21scFv的基因片段。
[0023] 優(yōu)選地，所述CAR表達(dá)載體為CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒。
[0024] 優(yōu)選地，所述包裝所述CAR表達(dá)載體的過程中，包括步驟如下：
[0025] 將12~20yg的包裝質(zhì)粒與12~20yg的所述CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒通過培養(yǎng)基共混，而 獲得質(zhì)粒混合物；
[0026] 將所述質(zhì)粒混合物與35~45iU的脂質(zhì)體通過培養(yǎng)基共混，而獲得混合液；
[0027] 將所述混合液轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，而獲得所述真核細(xì)胞的上清液；
[00%]濃縮所述上清液，而制得感染混合物。
[0029] 優(yōu)選地，所述將所述感染混合物感染T細(xì)胞的過程中，包括步驟如下：
[0030] 將0.8~2ml的感染混合物加入(6~10) X105個(gè)T細(xì)胞中而進(jìn)行感染；
[0031 ]將凝聚胺加入所述T細(xì)胞中，使所述凝聚胺的終濃度為10~20μg/ml;
[0032] 培養(yǎng)擴(kuò)增感染后的T細(xì)胞，而獲得CAR-T細(xì)胞。
[0033] 優(yōu)選地，所述X為IC0S共刺激分子。
[0034] 本發(fā)明還提供一種如上所述的CAR-T細(xì)胞在治療乳腺癌的藥物上的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明技術(shù)方案，通過表達(dá)chA21scFv而識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的皿R2 蛋白，并通過胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子， 該細(xì)胞因子進(jìn)而可W殺傷高表達(dá)皿R2蛋白的腫瘤細(xì)胞。而且，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)整合了CD28 共刺激分子W及X共刺激分子，可使T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，細(xì)胞因子持續(xù)分泌，增強(qiáng)殺傷腫瘤 細(xì)胞作用。
【附圖說明】
[0036] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W 根據(jù)運(yùn)些附圖示出的內(nèi)容獲得其他的附圖。
[0037] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR表達(dá)載體的基因結(jié)構(gòu)圖；
[003引圖2為化ISA法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞及現(xiàn)有的NT-T細(xì)胞分別與 肥R2+/-腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)后的IFN- 丫分泌量的柱狀圖；
[0039] 圖3為化ISA法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞及現(xiàn)有的NT-T細(xì)胞分別與 肥R2+/-腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)后的IL-2分泌量的柱狀圖；
[0040] 圖4為ELISA法檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞的肥R2特異性的統(tǒng)計(jì)圖；
[0041] 圖5為siCr釋放試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的特異性 殺傷作用的統(tǒng)計(jì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基 于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其 他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[00創(chuàng)本發(fā)明提供一種CAR-T細(xì)胞，其中，該CAR-T細(xì)胞的CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、較 鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21scFv;胞內(nèi)信號(hào)傳 導(dǎo)區(qū)為 CD28-X-ITAM，其中，X為 10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子。
[0044] 本發(fā)明CAR-T細(xì)胞通過表達(dá)chA21scFv而識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的皿R2 蛋白，并通過胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子， 該細(xì)胞因子進(jìn)而可W殺傷高表達(dá)皿R2蛋白的腫瘤細(xì)胞。而且，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)整合了CD28 共刺激分子W及X共刺激分子，可使T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，細(xì)胞因子持續(xù)分泌，增強(qiáng)殺傷腫瘤 細(xì)胞作用。
[0045] 需要說明的是，在該CAR的結(jié)構(gòu)中，chA21為采用表面包埋法（surface epitope masking method，SEM)生產(chǎn)的人源化單克隆抗體A21，是一種抗化bB2抗體，其具有很強(qiáng)的結(jié) 合特異性和抑瘤活性，chA21可特異性識(shí)別肥R2胞外區(qū)C-端的第I結(jié)構(gòu)域，遠(yuǎn)離皿R2受體二 聚化功能位，因此，本發(fā)明W抗肥R2的chA21為基礎(chǔ)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞;chA21S cFv由cM21單克 隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過多膚接頭連接形成，由于不少供應(yīng)商或科 研機(jī)構(gòu)已經(jīng)成功合成chA21scFv，且合成方法也為現(xiàn)有技術(shù)，故該chA21scFv可W直接由供 應(yīng)商或科研機(jī)構(gòu)提供。較鏈區(qū)可W是CD3、CD4、CD8、或者CD28，具體視實(shí)際情況而定。胞內(nèi)信 號(hào)傳導(dǎo)區(qū)的共刺激分子X可為10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子，均可起到傳導(dǎo) 信號(hào)的作用，實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，細(xì)胞因子持續(xù)分泌，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的目的;胞內(nèi) 信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)的ITAM通常為CD3C或者化eRI 丫。
[0046] 本發(fā)明還提供一種CAR-T細(xì)胞的制備方法，包括步驟如下：
[0047] S1、構(gòu)建CAR表達(dá)載體，其中，CAR表達(dá)載體的CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、較鏈區(qū)和 胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合皿R2蛋白的chA21scFv，胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為 CD28-X-口AM，X為 IC0S、CD137、CD134、CD80 或者 CD86 共刺激分子；
[004引 S2、包裝CAR表達(dá)載體，而制得感染混合物；
[0049 ] S3、將感染混合物感染T細(xì)胞，而制得CAR-T細(xì)胞。
[0050]本發(fā)明CAR-T細(xì)胞的制備方法通過構(gòu)建CAR表達(dá)載體，并通過包裝、轉(zhuǎn)染的方式將 CAR表達(dá)載體接入T細(xì)胞中，由于該CAR表達(dá)載體表達(dá)抗皿R2單克隆chA21，從而可W識(shí)別和 結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的肥R2蛋白，并通過胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，從而T細(xì) 胞激活，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子進(jìn)而可W殺傷高表達(dá)皿R2蛋白的腫瘤細(xì)胞。 該制備方法高效、簡單、成本低。
[0051 ] 進(jìn)一步地，在步驟S1中，構(gòu)建CAR表達(dá)載體的過程中，具體包括步驟如下：
[0052] S10、獲取chA21scFv的基因片段、較鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片 段W及ITAM的基因片段；
[0053] S11、提供引導(dǎo)鏈，基因融合引導(dǎo)鏈與chA21scFv的基因片段，而形成引導(dǎo)鏈- chA21scFv；
[0054] S12、基因融合較鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段和ITAM的基因片 段，而形成較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM;
[005引 S13、基因融合引導(dǎo)鏈-chA21scFv和較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導(dǎo)鏈- cM21S cFv-較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM;
[0056 ] S14、將引導(dǎo)鏈-cM21S cF V-較鏈區(qū)-CD28-X-1TAM接入載體，而獲得CAR表達(dá)載體。
[0057] 通過PCR擴(kuò)增技術(shù)和重疊 PCR技術(shù)，將chA21scFv的基因片段、較鏈區(qū)的基因片段、 CD28的基因片段、X的基因片段W及ITAM的基因片段進(jìn)行基因融合，而構(gòu)建CAR表達(dá)載體，其 構(gòu)建方式高效、簡單。需要說明的是，該引導(dǎo)鏈優(yōu)選為人CD8a引導(dǎo)鏈，人CD8a引導(dǎo)鏈可W從 人CD8a細(xì)胞中提取，也可W從相應(yīng)的供應(yīng)商中獲取，而人CD8a引導(dǎo)鏈的引物可由相應(yīng)的供 應(yīng)商提供。
[005引進(jìn)一步地，步驟S10具體包括步驟如下：
[0059] S100、獲取并激活PMBCs(pe;ripheral blood mononuclear cells,外周血單核細(xì) 胞)；
[0060] SlOl、提取 PMBCs 的 mRNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA;
[00川 S10 2、分別提供較鏈區(qū)的引物、CD28的引物、X的引物和I TAM的引物，且均w PMBCs 的cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得較鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片 段W及ITAM的基因片段；
[0062] S103、提供chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得 cM21scFv的基因片段。
[0063] 通過PMBCs獲得T細(xì)胞的mRNA,然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，從而為不同種類的T細(xì)胞 的基因片段的擴(kuò)增提供了模板，同時(shí)通過現(xiàn)有的chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物 對(duì)cM21scFv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯然，上述PCR擴(kuò)增高效、簡便，有利于提供CAR表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0064] 進(jìn)一步地，CAR表達(dá)載體為CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒，換而言之，步驟S14中，將引導(dǎo)鏈- chA21scFv-較鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入了病毒載體，而形成了CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒，其中，該病 毒載體可W是逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒，并通過質(zhì)粒的形式存在。
[0065] 進(jìn)一步地，在步驟S2中，包裝CAR表達(dá)載體的過程中，具體包括步驟如下：
[0066] S20、將12~20yg的包裝質(zhì)粒與12~20yg的CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒通過培養(yǎng)基共混，而 獲得質(zhì)?；旌衔?；
[0067] S21、將質(zhì)?；旌衔锱c35~45iil的脂質(zhì)體通過培養(yǎng)基共混，而獲得混合液；
[0068] S22、將混合液轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，而獲得真核細(xì)胞的上清液；
[0069] S23、濃縮上清液，而制得感染混合物。
[0070] 通過對(duì)CAR表達(dá)載體的包裝，可W提高為CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒的感染效率，從而提高 CAR-T細(xì)胞的制備效率。
[0071 ] 進(jìn)一步地，步驟S3中，將感染混合物感染T細(xì)胞的過程中，包括步驟如下：
[0072] S30、將0.8~2ml的感染混合物加入(6~10)X105個(gè)T細(xì)胞中而進(jìn)行感染；
[0073] S31、將凝聚胺加入T細(xì)胞中，使凝聚胺的終濃度為10~20iig/ml;
[0074] S32、培養(yǎng)擴(kuò)增感染后的T細(xì)胞，而獲得CAR-T細(xì)胞。
[0075] 該凝聚胺轉(zhuǎn)染劑可W提高T細(xì)胞的感染效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞的修飾。
[0076] 本發(fā)明還提供一種如上所述的CAR-T細(xì)胞在治療乳腺癌的藥物上的應(yīng)用。
[0077] 由于CAR-T細(xì)胞通過表達(dá)chA21scFv而識(shí)別和結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的皿R2蛋 白，并通過胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)將信號(hào)傳入T細(xì)胞，從而活化T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，該 細(xì)胞因子進(jìn)而可W殺傷高表達(dá)皿R2蛋白的腫瘤細(xì)胞，因此，該CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于治療乳腺癌 時(shí)，由于乳腺癌細(xì)胞的表面高度表達(dá)肥R2蛋白，可W高效殺傷乳腺癌細(xì)胞。
[0078] 現(xiàn)通過實(shí)施例1對(duì)本發(fā)明CAR-T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用做進(jìn)一步解釋和說明，在 該CAR-T細(xì)胞中，CAR的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)的X共刺激分子優(yōu)選為IC0S共刺激分子，CAR-T細(xì)胞 具體構(gòu)建方式參見如下詳述的內(nèi)容。同理，根據(jù)下述的構(gòu)建方式，可W構(gòu)建X共刺激分子為 其他共刺激分子時(shí)的CAR-T細(xì)胞，至于X共刺激分子的引物序列可W從NCBI的GenBank中查 找獲得，X共刺激分子的引物可W相應(yīng)的商家中購買獲得，也可W自行設(shè)計(jì)。
[0079] 實(shí)施例1
[0080] -、本發(fā)明實(shí)施例所用到的材料及試劑
[0081] 1、人外周血單核細(xì)胞
[0082] =位健康志愿者的外周血單核細(xì)胞來源于北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤介入科。
[0083] 2、細(xì)胞系
[0084] 人乳腺癌細(xì)胞株5邸1?3^470，]\?^-7，]\?^-]\?-231和卵巢癌細(xì)胞株51(0￥3,0￥〔4尺3， A1847和A2780, W及肥R2陰性的腫瘤細(xì)胞株MDA-MB-468(購買于ATCCKTC-1是HPV-16轉(zhuǎn)染 的小鼠肺癌細(xì)胞，用來作為人肥R2陰性表達(dá)的對(duì)照，也購買于ATCCd293T細(xì)胞購買于ATCC。
[0085] 3、試劑
[0086] (1 )RPMI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen 公司）
[0087] (2)滅活胎牛血清（Invitrogen公司）
[0088] (3)青一鏈霉素 lOOOOU/ml lOOOOIU/mKlnvitrogen公司）
[0089] (4)抗CD3/抗CD28磁珠 （Inv i trogen公司）
[0090] (5)重組人白介素-2(比-2)(Peprol'ech公司）
[0091 ] (6)DMS0(二甲基亞諷）（Invitrogen 公司）
[0092] (7)0.25% 膜酶（Invitrogen 公司）
[0093] (8化TS1077淋己細(xì)胞分層液(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）
[0094] (9 )mRNA 提取試劑盒（Invi trogen公司）
[00M] (10)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）
[0096] (11 )PCR 試劑盒（Invitrogen 公司）
[0097] (12)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen公司）
[009引 （13)含有人源化抗肥R2的cM21 scFv的質(zhì)粒陽E14-CM21 (中國科技大學(xué)提供）
[0099] (14)人CD8a 引導(dǎo)鏈（CDSaleader鏈）（hkara公司）
[0100] (15)人CD8a引導(dǎo)鏈的正向引物AF (Takara公司）
[0101] (16) CD8a較鏈區(qū)（CDSahinge)的正向引物CF和反向引物CR( Takara公司）
[0102] (17) CD28的正向引物DF和反向引物DR (Takara公司）
[0103] (18) I COS的正向引物GF和反向引物GR (Takara公司）
[0104] (19)CD3C的正向引物EF和反向引物邸(Takara公司）
[0105] (20)cM21scFv的正向引物BF和反向引物BR^akara公司）
[0106] (21)口10.6質(zhì)粒、口101^邑/口質(zhì)粒、1?6￥表達(dá)質(zhì)粒(〇1曰邑6]1公司）
[0107] (22)F]；TC標(biāo)記的山羊抗鼠 F(ab'）2抗體(Jackson ImmunoResearch公司）
[0108] (23)APC CY7標(biāo)記的抗人-CD3,陽標(biāo)記的抗人-CD45，F(xiàn)ITC抗人-CD4,陽抗人-CD4， APC抗人-CD8，陽抗人CD45R0，APC抗人CD6化抗體(B i 01 egend公司）
[0109] (24) IFN- 丫化ISA試劑盒(Biolegend公司）
[0110] (25)比-沈 LISA 試劑盒(Biolegend 公司）
[0111] (26)肥R2-FC嵌合蛋白（R&D Systems公司）
[0112] (27)CD19-FC嵌合蛋白（S陽邸BioSystems公司）
[0113] (28)銘酸鋼(Na25iCr〇4)(D證ont 肥N公司）
[0114] (29)FITC 兔抗人肥 R2 抗體(Clone24D2，Biolegend 公司）
[0115] (30)脂質(zhì)體2000( Invi trogen公司）
[0116] (31)凝聚胺(Sigma 公司）
[0117] 4、引物序列表
[011引 表一
[0119]
[0120] 二、本實(shí)施例的技術(shù)方案
[0121] ( -）、外周血單核細(xì)胞的分離與激活
[0122] 1、人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分離
[0123] (1)抗凝血管抽取健康志愿者的外周血15ml;
[0124] (2)向該抗凝血管中加入等體積的PBS，輕輕吹打成細(xì)胞懸液30ml;
[01巧](3)另取兩支50ml離屯、管，向一離屯、管加入15ml的LTS1077淋己細(xì)胞分層液;然后， 用吸管吸取15ml的細(xì)胞懸液，在距離LTS1077淋己細(xì)胞分層液上方1cm處將細(xì)胞懸液小屯、而 緩慢的加入，使細(xì)胞懸液重疊于LTS1077淋己細(xì)胞分層液上，200化pm離屯、20min;
[0126] (4)取出離屯、后的離屯、管，移液管吸去最上層的血漿，移液槍吸取血漿層下的單個(gè) 核細(xì)胞置入另一離屯、管中；然后，加入15ml的PBS洗涂，輕輕吹打均勻后再次離屯、，150化pm， lOmin，去掉上清;共洗涂3次；
[0127] (5)向去掉上清后的離屯、管內(nèi)加入含10%滅活胎牛血清、lOOU/ml青一鏈霉素、 lOOU/ml IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基，放置于37°C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，而分離獲得 PBMC細(xì)胞制劑。
[0128] 2、人外周血單核細(xì)胞的激活
[0129] (1)取步驟1獲得的PBMC細(xì)胞制劑，于24孔板中種植IxlO6個(gè)PBMC細(xì)胞（1 X lOVml);
[0130] (2)按照免疫磁珠分選試劑盒的說明書的方法，用PBS將包被抗CD3/CD28的磁珠洗 3遍；
[0131] (3)將磁珠按3:1 (磁珠:細(xì)胞)比例加入PBMC細(xì)胞中，放置37°C、5 %C化培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)過夜；
[0132] (4)細(xì)胞激活12~24小時(shí)后，離屯、，收取被激活的人外周血單核細(xì)胞，用作提mRNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0133] (二）、提取激活的外周血單核細(xì)胞的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA
[0134] 1、外周血單核細(xì)胞的mRNA的提取
[013引（1)取出被激活后的人外周血單核細(xì)胞1.5 X106個(gè)，用PBS沖洗2遍；
[0136] (2)去掉上清后，向細(xì)胞沉淀中加入1.5ml的化izol，吹打成均勻細(xì)胞懸浮液；
[0137] (3)采用1ml注射器來回抽吸細(xì)胞懸浮液，W剪切基因組DNA，然后用注射器直接將 樣品轉(zhuǎn)移到一新的1.5ml的EP管中；
[0138] (4)向EP管中加入25化1的氯仿，劇烈震蕩30sec，12000巧m離屯、5min;
[0139] (5)將離屯、后產(chǎn)生的上清移至另一新的1.5ml的Ep管中，并加入等體積的異丙醇， 室溫放置5min;
[0140] (6) 12000巧m離屯、5min，吸走上清液；
[0141] (7)向吸走上清液后的Ep管中加入70 %的乙醇750iil，不需吹打，12000巧m離屯、 2min;
[0142] (8)盡可能徹底吸走離屯、后產(chǎn)生的上清，室溫干燥使乙醇揮發(fā)，而形成沉淀；
[0143] (9)向該沉淀加入60]il的DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙醋）水，而溶 解該沉淀，即溶解外周血單核細(xì)胞的mRNA;
[0144] (10)取溶解的mRNA化1，加至1ml的DEPC水中，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260nm和 280nm 的吸光度值:00260/280 = 1.9~2.0;按10D = 40yg的 mRNA 計(jì)算 mRNA 的產(chǎn)率，0D260/280 在1.9~2.0視為提取的mRNA純度很高；
[0145] (11)用提取的RNA產(chǎn)物來進(jìn)行下一步的RT反應(yīng)。
[0146] 2、RT(Reverse Transcription,反轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)
[0147] (1)將步驟1提取的mRNA與其他試劑構(gòu)成如下的反應(yīng)體系：
[0149」 （2)RT反應(yīng)余件：室溫，lOmin ; 42"C，Ih ; 99"C，5min火巧AMV Reverse Transcriptase;進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄獲得PMBCs的cDNA;
[0150] (3)將反轉(zhuǎn)錄得到的PMBCs的cDNA置于-80°C冰箱保存，備用。
[0151] (;)、祀向肥R2的嵌合性抗原受體(CAR)載體的構(gòu)建
[0152] 1、PCR 擴(kuò)增。114213。尸￥、〔08地111邑6、〔028、10)5和〔03(
[0153] 1.UPCR 擴(kuò)增 cM21scFv
[0154] a、提供cM21scFv的DM模板及cM21scFv的引物：
[0155] cM21scFv的DNA模板由中國科技大學(xué)提供的質(zhì)粒陽E14-CM21獲得；chA21scFv的 正向引物BF和反向引物BR由化kara公司提供，其引物系列具體見上表一）；
[0156] b、按照如下的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件獲得PCR產(chǎn)物；
[0157] PCR反應(yīng)體系： 「015只 1
[0161] C、電泳
[0162] 配制瓊脂糖凝膠(20g/L):稱取0.6g的瓊脂糖凝膠粉，加入30ml的TAE電泳緩沖液， 混勻后放入微波爐中加熱45s，加入lul的邸液，混勻后灌注，室溫冷卻；向電泳槽中加入適 量TAE電泳緩沖液，用化2000作為DNA Marker，向樣本孔中加入加1的上述PCR產(chǎn)物，調(diào)節(jié)電 泳儀電壓為90mV，電泳半小時(shí)；
[0163] d、結(jié)果觀察
[0164] 利用數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析可知：上述PCR產(chǎn)物為chA21scFv 基因片段；
[01化]e、PCR產(chǎn)物回收
[0166] (1)將電泳后余下的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至2ml的EP管中，加入300ul的PB緩沖液，充分混 勻；
[0167] (2)吸附：QIAquick柱子鏈接2ml的EP管，將含PCR產(chǎn)物的PB緩沖液緩慢加入 QIAquick柱子，13000轉(zhuǎn)/分離屯、30秒；
[016引（3)洗涂:棄去EP管中的液體，向QIAquick柱子中加入800ul的陽緩沖液，13000轉(zhuǎn)/ 分離屯、30秒；
[0169] (4)棄去EP管中的液體，13000轉(zhuǎn)/分離屯、1分鐘；
[0170] (5)洗脫:將QIAquick柱子置于新的1.5ml的EP管中，向柱子中加入60ul的邸緩沖 液，13000轉(zhuǎn)/分離屯、1分鐘，棄去EP管中的液體而回收PCR產(chǎn)物；
[0171] (6)將回收后的PCR產(chǎn)物置于-20°C冰箱保存。
[0172] 1.2、PCR 擴(kuò)增 CDSahinge、CD28 和 CD3C
[0173] a、提供引物W及步驟(二)制得的PBMCs的cDNA:
[0174] CDSahinge的正向引物CF和反向引物CR由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[0175] CD28的正向引物DF和反向引物DR由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[0176] IC0S的正向引物DF和反向引物DR由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[0177] CD3C的正向引物EF和反向引物邸由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[017引b、按照如下的PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件獲得PCR產(chǎn)物；
[0179] PCR反應(yīng)體系： QAl
[i
0182 0183 0184 0185 0186 0187 123456 PCR反應(yīng)條件:與PCR擴(kuò)增cM21scFv的PCR反應(yīng)條件相同； 2 c、PCR產(chǎn)物回收(與PCR擴(kuò)增chA21scFv的PCR產(chǎn)物回收的步驟相同），進(jìn)而獲得CD8a hinge/CD28/lC0S/CD3C 的 PCR 產(chǎn)物。 3 2、重疊 PCR而進(jìn)行基因融合 4 2.1、提供 CDSaleader 鏈（CD8a 引導(dǎo)鏈），將 CDSaleader 鏈與 PCR 擴(kuò)增后的 cM21scFv 進(jìn)行基因融合，而形成CD8aleade;r-cM21scFv: 5 a、第一步PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間如下； 6 第一步PCR反應(yīng)體系：
[018 引

[0191] b、第二步PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間如下；
[0192] 第二步PCR反應(yīng)體系：向第一步PCR反應(yīng)完成后的體系中加入CDSaleader鏈的正向 引物AF (其引物系列如表一所示）W及cM21S cFv的反向引物BR (其引物序列如表一所示)各 2ul；
[0193] 第二步PCR反應(yīng)條件：
[0194]
[01M] e、將第二步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描 分析，而證明第二步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物為CD8aleader-cM21scFv;
[0196] f、第二步PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物回收(與PCR擴(kuò)增chA21scFv的PCR產(chǎn)物回收的步驟相 同），而獲得CD8aleade;r-cM21scFv;
[0197] 2.2、將擴(kuò)增后的〔08地1雌6與擴(kuò)增后的〔028進(jìn)行基因融合，獲得〔08地1雌6-〔028;
[0198] 將 CD8ahinge-CD28 與擴(kuò)增后的 IC0S 進(jìn)行基因融合，獲得 CD8ahinge-CD28-IC0S;
[0199] 將 CD8ahinge-CD28-IC0S 與擴(kuò)增后的 CD3C 進(jìn)行基因融合，獲得 CD8ahinge-CD28- IC0S-CD3C;
[0200] 將 CD8aleader-cM21scFv 與 CDS 址 inge-CD28-IC0S-CD3C 進(jìn)行基因融合，獲得 CD8a leader-cM21scFv-CD8ahinge-CD28-IC0S-CD3C，其基因結(jié)構(gòu)如圖 1 所示；
[0201] 具體方法同上，其中，CDSahinge與CD28融合過程中所添加的引物為CF，DR;CD8a hinge-CD28與IC0S融合過程中所添加的引物為CF，GR;CD8址inge-CD28-IC0S與CD3C融合過 程中所添加的引物為〔。，63;〔08日16日(16'-證4213。。￥與〔08地1叫6-〔028-10)5-〔03(融合過 程中所添加的引物為AF，ER(引物序列如表一所示）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，數(shù)碼凝膠圖像采 集與分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，最終回收PCR產(chǎn)物CD8aleader-chA21scFv-CD8ahinge-CD28- IC0S-CD3C。
[0202] 3、將 CD8aleader-cM21scFv-CD8ahinge-CD28-IC0S-CD3C 交由美國劍橋加基因公 司(Addgene，Camb;ridge，MA，USA)接入 pSin(慢病毒)骨架形成 pSin-chA21-28C 質(zhì)粒，即 CAR 表達(dá)載體。
[0203] (四）包裝CAR表達(dá)載體(包裝pSin-cM21-28。區(qū)病毒質(zhì)粒），而制得感染混合物
[0204] U293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)及準(zhǔn)備 [02化]a、293T細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)
[0206] (1)細(xì)胞培養(yǎng)基:配置含10%滅活胎牛血清、lOOU/ml青一鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng) 基；
[0207] (2)從液氮罐取出凍存的293T細(xì)胞，迅速放入37°C水浴鍋，凍存的293T細(xì)胞融化 后，在超凈臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞懸液移入離屯、管中，加入4ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入離屯、機(jī)中， 1000轉(zhuǎn)/分離屯、3~4分鐘；
[020引（3)棄去上清液，加入1ml配制的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹打成細(xì)胞懸液，移入 75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基至10ml，放入37°C，5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24小時(shí)后給予換液；
[0209] b、293T細(xì)胞傳代
[0210] 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞布滿約80~90%時(shí)進(jìn)行傳代。將舊的培養(yǎng)基吸走，向培養(yǎng)皿中加 入2~3ml的PBS沖洗1遍，吸走PBS，向培養(yǎng)皿中加入0.25 %的膜蛋白酶2ml，消化3~5min，注 意在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，當(dāng)見到細(xì)胞回縮，形態(tài)變圓，細(xì)胞間連接間隙增大 時(shí)，向培養(yǎng)皿中加5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞脫落，制成細(xì)胞懸 液后，按大約1:化k例傳代培養(yǎng)；
[0211] c、293T細(xì)胞凍存
[0212] (1)生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，布滿培養(yǎng)瓶約80~90%時(shí)可W凍存。細(xì)胞消化后吹打成 細(xì)胞懸液，移入15ml離屯、管中，放入離屯、機(jī)中，1000轉(zhuǎn)/分離屯、3~4分鐘；
[0213] (2)棄去上清液，加入含10%二甲基亞諷的滅活胎牛血清1ml，輕輕吹打成細(xì)胞懸 液，移入細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記，置入冰上，并迅速投入液氮罐中保存。
[0214] 2、慢病毒質(zhì)粒的包裝
[0215] (1)取出凍存的293T細(xì)胞，并置于75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng);選取融合度60~70% 的293T細(xì)胞，換液后S小時(shí)后備用；
[0216] (2)將巧巾包裝質(zhì)粒9]\?).6、9]\?)1^9、1?6￥及95111-證421-2化質(zhì)粒按下表比例于11111 無血清無雙抗的37 °C預(yù)熱的RPMI-1640中混合均勻，室溫解育5分鐘，而獲得質(zhì)?；旌衔?； rn9i7i
[0218] (3)將26iig的上述質(zhì)?；旌衔锱c3化1脂質(zhì)體2000(質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000的比率為化 g: 1.扣1)逐滴加入1ml無血清無抗生素的RPMI-1640中輕輕混合均勻，室溫解育5分鐘，而獲 得混合液；
[0219] (4)將最終的脂質(zhì)體2000及質(zhì)粒共混物的混合液逐滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕 輕混合均勻，37 °C、5 % C0播養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0220] (5川欠集轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)的293T細(xì)胞上清液；
[0221] (6)取收集的293T細(xì)胞上清液約35ml，收集于50ml離屯、管中，2000轉(zhuǎn)，10分鐘，去除 293T細(xì)胞碎片，而獲得去碎片后的上清液；
[0222] (7)將步驟(6)獲得的上清液置于冰上，用60ml注射器連接0.45皿針頭濾器將離屯、 后的上清液過濾于35ml超速離屯、管中，25000轉(zhuǎn)，3小時(shí)；
[0223] (8)將離屯、管輕輕取出，置于冰上；
[0224] (9)在病毒專用超凈臺(tái)中，打開金屬離屯、管，吸去部分離屯、后的病毒上清，用綴子 取出超速離屯、管，吸去大部分上清，剩余約4ml;
[0225] (10)用5ml移液管反復(fù)吹打剩余的4ml病毒上清約10次，0.75ml/管進(jìn)行分裝，放 入-80°C冰箱中保存?zhèn)溆?，而獲得慢病毒顆粒，即感染混合物。
[0226] (五）、轉(zhuǎn)染外周血單核細(xì)胞
[0227] 1、人外周血單核細(xì)胞的分離與激活 [022引與步驟(一)相同。
[0229] 2、人外周血單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
[0230] (1)人外周血單核細(xì)胞在24孔板中激活12~24小時(shí)后，離屯、24孔板，吸走80化1上 清培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)目約0.5 X 10^20化1;
[0231] (2)從人外周血單核細(xì)胞分選出T細(xì)胞并激活，?。?~9) X105激活的T細(xì)胞，用 CD45R0，CD6化抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前激活的人外周血單核細(xì)胞的分型（方法同 上)；
[0232] (3)在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將1ml的慢病毒顆粒加入T細(xì)胞 中，向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整至終濃度為12μg/ml，將24孔板放入離 屯、機(jī)離屯、，25(K)r/min，離屯、1.5小時(shí);離屯、后將24孔板放于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；
[0233] (4)離屯、過夜培養(yǎng)的24孔板，去掉大部分含慢病毒顆粒的上清培養(yǎng)液，加入新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)液，擴(kuò)增T細(xì)胞；
[0234] (5)每2天計(jì)數(shù)T細(xì)胞，向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入化-250IU/ml，維持T細(xì)胞密度為 (0.5~l)Xl〇6/ml;
[0235] (6) 2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45R0，CD6化抗體W及FITC標(biāo)記的羊抗 鼠 F(ab'）2抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(方法同上）；
[0236] (7)轉(zhuǎn)染成功的 cM21-28-IC0SCCAR-T 細(xì)胞備用。
[0237] (六）、表達(dá)抗肥R2的CAR-T細(xì)胞體外功能的檢測(cè)
[0238] 在檢測(cè)前，先將實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)肥R2的腫瘤細(xì)胞株(實(shí)施例1所設(shè) 及的材料中的細(xì)胞系)按如下步驟進(jìn)行共培養(yǎng)，而獲得共培養(yǎng)液：
[0239] (1)用0.25%膜酶消化腫瘤細(xì)胞后，加入RPMI1640培養(yǎng)基中和膜酶，離屯、后調(diào)整細(xì) 胞密度為IxloVml，取10化1 (IxlO5)腫瘤細(xì)胞接種于U型96孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；
[0240] (2)表達(dá)抗皿R2的chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增14天后，離屯、去掉抗 CD3/CD28磁珠，在無 IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，使T淋己細(xì)胞靜息；
[0241] (3)收取靜息的T淋己細(xì)胞，離屯、去掉上清，將細(xì)胞重懸于RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì) 數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為IxloVml，取1(K)山（IxlO5)T細(xì)胞接種于U型96孔板中已經(jīng)接種腫瘤細(xì)胞 的相應(yīng)的孔中，將96孔板放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。只有T細(xì)胞的孔作為陰性 對(duì)照孔。
[0242] 1、ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)液中IFN- 丫的含量
[0243] (1)包被:按說明書指導(dǎo)，將化Pture抗體稀釋于IX包被緩沖液中，向試劑盒提供的 微孔板中的各反應(yīng)孔中各加0.1ml，塑料貼紙覆蓋微孔板，放置4°C過夜；
[0244] (2)封閉：將過夜后的微孔板用自動(dòng)化ISA洗板機(jī)洗漆4次后，拋干，用IX分析緩沖 液10化1封閉1小時(shí)；
[0245] (3)加樣:將微孔板再次洗漆4次后，拋干，向各反應(yīng)孔加入待檢測(cè)的T細(xì)胞與腫瘤 細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液10化1，相應(yīng)稀釋倍數(shù)的上清液及IFN- 丫標(biāo)準(zhǔn)品（100化g/ml，倍比稀釋 至15.6pg/ml)，室溫解育2小時(shí)；
[0246] (4)加檢測(cè)抗體:微孔板洗涂4次后，拋干，按說明書指定將Detection抗體用IX分 析緩沖液稀釋，取10化1加入各反應(yīng)孔中，室溫解育1小時(shí)；
[0247] (5)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗:微孔板洗漆4次后，拋干，將HRP標(biāo)記的抗體用 IX分析緩沖液稀釋，向各反應(yīng)孔中各加10化1，室溫解育0.5小時(shí)；
[0248] (6)微孔板洗漆4次后，拋干，向各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液10化1，避 光解育15分鐘；
[0249] (7)向各反應(yīng)孔中加入1M硫酸10化1終止反應(yīng)；
[0250] (8)結(jié)果判定：在化ISA檢測(cè)儀上，W空白對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)各孔450nm吸光值(0D 值），計(jì)算IFN-丫濃度值。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。
[0251] 根據(jù)圖2可知，chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞可W特異性的識(shí)別所有皿R化的腫瘤細(xì) 胞并大量分泌IFN-丫，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞（S邸R3)分泌的IFN-丫高達(dá)190(K)pg/mlW上，但將 chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞與皿R2陰性的MDA-MB-468和TC-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上 清中只能檢測(cè)到非常低劑量的IFN-丫。而NT-T細(xì)胞與皿R2陽性的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞 培養(yǎng)液上清中檢測(cè)不到IFN-丫。因此，結(jié)果表明：肥R2-特異性的T細(xì)胞可W特異性的識(shí)別并 殺傷肥R2陽性的腫瘤細(xì)胞。
[0252] 2、ELI SA法檢測(cè)共培養(yǎng)液中比-2的含量
[0253] 檢測(cè)步驟與IFN- 丫的步驟相同，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。
[0254] 根據(jù)圖3可知，chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞可W特異性的識(shí)別所有皿R化的腫瘤細(xì) 胞并大量分泌化-2，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞（SKBR3)分泌的化-2高達(dá)2800pg/ml W上。但將chA21- 28-ICOSCCAR-T細(xì)胞與皿R2陰性的MDA-MB-468和TC-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中只 能檢測(cè)到非常低劑量的IL-2。而NT-T細(xì)胞與皿R2陽性的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上 清中檢測(cè)不到IL-2。因此，結(jié)果表明：肥R2-特異性的T細(xì)胞可W特異性的識(shí)別并殺傷肥R2陽 性的腫瘤細(xì)胞。
[0255] 3、CAR-T細(xì)胞的抗原特異性評(píng)價(jià)試驗(yàn)
[0256] (1)包被：用20化1化g/ml皿R2-FC嵌合蛋白或者CD19-FC嵌合蛋白的包被96孔 板，用塑料貼紙覆蓋96孔板，4°C過夜；
[0257] (2)加入活化的T細(xì)胞：次日，PBS洗涂3次后，拋干，向96孔板中加入IX 105個(gè) cM21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞或N1T細(xì)胞，37°C培養(yǎng)過夜；
[0258] (3)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IFN-丫的分泌，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。
[0259] 根據(jù)圖4可知，NT-T細(xì)胞對(duì)皿R2-FC嵌合蛋白和CD19-FC嵌合蛋白均無特殊反應(yīng)， chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞對(duì)CD19-FC嵌合蛋白也無特殊反應(yīng)，但是在皿R2-FC嵌合蛋白封 閉的96孔板中，CM21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞釋放了大量的INF-丫，且高達(dá)19000pg/mlW上。
[0260] 4、si化釋放試驗(yàn)檢測(cè)CM21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞殺傷乳腺癌細(xì)胞能力
[0%1] (1)收獲處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞(S邸R3)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X106/ml;
[0%2] (2)取lX106細(xì)胞(0.5ml)，加 Na25lCr04100 uCi，37度解育2~3h，每15min輕輕振搖 一次；
[0263] (3)用 10%FCS RPMI 1640洗涂3次，每次800巧m、5min。
[0264] (4)重懸細(xì)胞濃度lXl〇5/ml;
[0265] (5)96孔U型培養(yǎng)板中，每孔加 lOOiiKlxlO4細(xì)胞），設(shè)3個(gè)復(fù)孔；
[0%6] (6)按照效應(yīng)T細(xì)胞與祀細(xì)胞為1:1，3:1和10:1的比例，每孔加入10化1不同細(xì)胞濃 度的實(shí)施例1制備的CAR-T細(xì)胞;設(shè)置最大釋放組，向乳腺癌細(xì)胞加 lOOiil l%Triton X- 100;設(shè)置自然釋放組，向乳腺癌細(xì)胞中加10化1 RPMI1640培養(yǎng)基；
[0%7] (7) 200g離屯、Imin，放入37 °C、5 % C〇2解箱培養(yǎng)地。
[0268] (8) 200g 離屯、Imin，每孔取出 10化上清，用 Wi zard2gamma 計(jì)數(shù)(Perki 址 Imer)檢測(cè)；
[0269] (9)計(jì)算:特異性殺傷率（％) = (實(shí)驗(yàn)組cpm-自然釋放cpm)/(最大釋放組-自然釋 放cpm)，計(jì)算結(jié)果圖5所示。
[0270] 根據(jù)圖5可知，chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞特異性的裂解肥R2-陽性的SKBR3腫瘤細(xì) 胞，而NTT細(xì)胞對(duì)于肥R2陽性或者陰性的S邸R3腫瘤細(xì)胞均未有裂解作用。同時(shí)，將NT-T細(xì)胞 和chA21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞分別與表達(dá)肥R2的SK0V3細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，可W看到NT-T 細(xì)胞對(duì)SK0V3細(xì)胞的生長沒有影響，而加入CM21-28-IC0SCCAR-T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中可W看到 T細(xì)胞集落的形成，且S邸R3腫瘤細(xì)胞明顯減少。
[0271] 5、統(tǒng)計(jì)分析
[0272] 所有數(shù)據(jù)均為遂表示。利用Gra地Pad P;rism5.0(Gra地Pad Software，Inc.，San Diego，California USA)軟件，T檢驗(yàn)法分析細(xì)胞因子分泌的差異及特異性細(xì)胞裂解的差 異。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0273] 綜上所示，本發(fā)明CAR-T細(xì)胞對(duì)表達(dá)皿R2的腫瘤細(xì)胞具有良好的殺傷效果，且CAR- T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞（SKBR3)共培養(yǎng)時(shí)分泌的INF-丫高達(dá)19000pg/mlW上，IL-2高達(dá) 2800pg/ml W上，遠(yuǎn)高于其他第S代CAR-T細(xì)胞分泌的INF- 丫和比-2。
[0274] W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本 發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效變換，或直接/間接運(yùn)用在其 他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CAR-T細(xì)胞，所述CAR-T細(xì)胞的CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳 導(dǎo)區(qū)，其特征在于， 所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21 scFv; 所述胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM，其中，所述X為10)5、00137、00134、0)80或者0)86 共刺激分子。2. 如權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其特征在于，所述X為ICOS共刺激分子。3. -種CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括步驟如下： 構(gòu)建CAR表達(dá)載體，其中，所述CAR表達(dá)載體的CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞 內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21 scFv，所述胞內(nèi)信號(hào) 傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM，所述X為10)5、0)137、0)134、0)80或者0)86共刺激分子 ； 包裝所述CAR表達(dá)載體，而制得感染混合物； 將所述感染混合物感染T細(xì)胞，而制得CAR-T細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求3所述的CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建CAR表達(dá)載體的過 程中，包括步驟如下： 獲取所述chA21 scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述 X的基因片段以及所述ITAM的基因片段； 提供引導(dǎo)鏈，基因融合所述引導(dǎo)鏈與所述chA21 scFv的基因片段，而形成引導(dǎo)鏈-chA21 scFv； 基因融合所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM 的基因片段，而形成鉸鏈區(qū)-⑶28-X-ITAM; 基因融合所述引導(dǎo)鏈-chA21 scFv和所述鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導(dǎo)鏈-chA21 scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM; 將所述引導(dǎo)鏈_chA21 scFv-鉸鏈區(qū)-⑶28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達(dá)載體。5. 如權(quán)利要求4所述的CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，獲取所述chA21 scFv的基 因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的 基因片段的過程中，包括步驟如下： 獲取并激活PMBCs; 提取所述PMBCs的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA; 分別提供所述鉸鏈區(qū)的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物，且均 以所述PMBCs的cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的 基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段； 提供所述chA21 scFv的模板DNA和所述chA21 scFv的引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得所 述chA21 scFv的基因片段。6. 如權(quán)利要求3所述的CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述CAR表達(dá)載體為CAR表 達(dá)病毒質(zhì)粒。7. 如權(quán)利要求6所述的CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述包裝所述CAR表達(dá)載體 的過程中，包括步驟如下： 將12~20yg的包裝質(zhì)粒與12~20yg的所述CAR表達(dá)病毒質(zhì)粒通過培養(yǎng)基共混，而獲得 質(zhì)?；旌衔?； 將所述質(zhì)?；旌衔锱c35~45μ1的脂質(zhì)體通過培養(yǎng)基共混，而獲得混合液； 將所述混合液轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，而獲得所述真核細(xì)胞的上清液； 濃縮所述上清液，而制得感染混合物。8. 如權(quán)利要求3所述的CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述將所述感染混合物感 染Τ細(xì)胞的過程中，包括步驟如下： 將0.8~2ml的感染混合物加入(6~10) Χ105個(gè)Τ細(xì)胞中而進(jìn)行感染； 將凝聚胺加入所述T細(xì)胞中，使所述凝聚胺的終濃度為10~20μg/ml; 培養(yǎng)擴(kuò)增感染后的T細(xì)胞，而獲得CAR-T細(xì)胞。9. 如權(quán)利要求3至8任意一項(xiàng)所述的CAR-Τ細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述X為ICOS 共刺激分子。10. -種如權(quán)利要求1或2所述的CAR-τ細(xì)胞在治療乳腺癌的藥物上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK106047817SQ201610602458
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月28日 公開號(hào)201610602458.3, CN 106047817 A, CN 106047817A, CN 201610602458, CN-A-106047817, CN106047817 A, CN106047817A, CN201610602458, CN201610602458.3
【發(fā)明人】曾憲卓, 張翼
【申請(qǐng)人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司