一種引物組、dna體外擴(kuò)增方法、試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種引物組、DNA體外擴(kuò)增方法、試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明實(shí)施例提供了特定的引物組，其擴(kuò)增區(qū)域能夠基本覆蓋TYR基因的所有區(qū)域，使用該引物進(jìn)行擴(kuò)增能較為全面獲取的TYR基因的核苷酸序列情況，明確突變位點(diǎn)。另外，該引物組適用于長(zhǎng)片段擴(kuò)增，在本發(fā)明提供的PCR條件下擴(kuò)增出的條帶單一，無(wú)非特異性條帶。使用該引物組擴(kuò)增獲得的長(zhǎng)片段，與現(xiàn)有的短片段相比，測(cè)序結(jié)果更為均勻，數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單。
【專利說(shuō)明】
-種引物組、DNA體外擴(kuò)増方法、試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及一種引物組、DNA體外擴(kuò)增方法、試劑盒 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白化病(a化inism)是一類由黑色素的生物合成缺陷而引起的一種皮膚及附屬器 官黑色素缺乏的常染色體隱性遺傳病。白化病分為3型：眼皮膚白化病(皮膚和眼部都受累 及）、眼白化病(僅眼部受累及)和白化病相關(guān)綜合征(存在全身性白化病的表現(xiàn)W及其他系 統(tǒng)異常）。在各類白化病中，超過(guò)90%為眼皮膚白化病，眼皮膚白化病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病 率是1/20000,而中國(guó)人群的發(fā)病率略高，約為1/18000。
[0003] 根據(jù)設(shè)及基因的不同，眼皮膚白化?。╫culocutaneous a化inism,0CA)主要分為4 種亞型，其中一種亞型由酪氨酸酶基因（tyrosinase,TYR)突變引起，TYR基因編碼的酪氨酸 酶負(fù)責(zé)黑色素合成的前兩步限速步驟。由于眼皮膚白化病各型患者臨床表型往往重疊，僅 憑眼、皮膚和毛發(fā)的白化程度，很難準(zhǔn)確區(qū)分各型非綜合征眼皮膚白化病，因此，基因檢測(cè) 成為眼皮膚白化病分型的唯一可靠方法。
[0004] 近年來(lái)快速發(fā)展的高通量二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)是 在基于第一代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上被廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷與攜帶者篩查。二代測(cè)序由模 板制備和序列檢測(cè)過(guò)程W及數(shù)據(jù)分析過(guò)程兩部分組成。其中，在技術(shù)上W邊合成邊測(cè)序?yàn)?核屯、，通過(guò)大規(guī)模平行測(cè)序的手段，同時(shí)對(duì)數(shù)W百萬(wàn)計(jì)的短DNA片段測(cè)序，獲得海量的序列 信息，然后利用生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析。化化re Methods雜志在2014年點(diǎn)評(píng)了過(guò)去十年 對(duì)生物學(xué)研究影響最深的十大技術(shù)，二代測(cè)序居首位。二代測(cè)序的策略包括全基因組、外顯 子組、目標(biāo)區(qū)域、表達(dá)譜、甲基化、染色體免疫共沉淀測(cè)序等。其中，目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序是指針 對(duì)感興趣的目標(biāo)區(qū)域或基因，通過(guò)祀?yún)^(qū)域捕獲或擴(kuò)增的方法富集，然后進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。與 全基因組、全外顯子組測(cè)序方法相比，目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序能大規(guī)模、低成本篩查特定疾病的已 知致病位點(diǎn)，在臨床診斷方面有著巨大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本申請(qǐng)主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種引物組、DNA體外擴(kuò)增方法、試劑盒、及其 應(yīng)用，能夠準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)TYR基因突變。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的第一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種的引物 組，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該引物組包括用于在PCR中擴(kuò)增TYR基因多個(gè)長(zhǎng)片段 的檢測(cè)引物對(duì)，該引物組包括選自下列引物對(duì)中的至少1對(duì)：
[0007] 序列如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示的引物對(duì)；
[000引序列如沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4所示的引物對(duì)；
[0009] 序列如沈Q ID NO:5和沈Q ID NO:6所示的引物對(duì)；
[0010] 序列如沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8所示的引物對(duì)；
[0011] 序列如沈Q ID NO:9和沈Q ID NO:10所示的引物對(duì)；
[0012] 序列如沈Q ID NO:11和沈Q ID NO:12所示的引物對(duì)；
[0013] 序列如沈Q ID NO:13和沈Q ID NO:14所示的引物對(duì)；
[0014] 序列如沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16所示的引物對(duì)；
[001引序列如沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18所示的引物對(duì)；
[0016] 序列如沈Q ID NO:19和沈Q ID NO:20所示的引物對(duì)；
[0017] 序列如沈Q ID NO:21和沈Q ID NO:22所示的引物對(duì)；
[001引序列如沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:24所示的引物對(duì)；
[0019] 序列如沈Q ID N0:25和沈Q ID N0:26所示的引物對(duì)；
[0020] 序列如沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:28所示的引物對(duì)；
[0021] 序列如沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:30所示的引物對(duì)；
[0022] 序列如沈Q ID NO:31和沈Q ID NO:32所示的引物對(duì)。
[0023] 其中，引物組包括所述16對(duì)引物對(duì)。
[0024] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的第二個(gè)技術(shù)方案是:提供一種DNA體外 擴(kuò)增方法，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA片段，，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，使用上述的引物 組作為引物。
[00巧]其中，反應(yīng)體系為20iU，包括長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶0.抓;模板30ng;上游引物0.4iU ;下游 引物0.化1;
[00%] 所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括：
[0027] 擴(kuò)增階段:在94°C下預(yù)變性Imin; 98°C下變性10s;在65°C下退火30s，在68°C下延 伸lOmin;
[00%]對(duì)所述擴(kuò)增階段循環(huán)執(zhí)行30次；
[0029] 循環(huán)執(zhí)行30次后，在68°C下解育30min。
[0030] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的第=個(gè)技術(shù)方案是:提供一種試劑盒， 與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該試劑盒包括上述的引物組。
[0031 ]其中，該試劑盒還包括W下一種或多種試劑：
[0032] 用于從樣品提取基因組DNA的試劑；
[0033] 利用所述引物組中的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)的試劑；
[0034] 用于處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物W使擴(kuò)增產(chǎn)物能夠進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑；
[0035] W及
[0036] 用于對(duì)處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑。
[0037] 其中，所述高通量測(cè)序?yàn)镮on Torrent測(cè)序。
[0038] 其中，所述利用所述引物組中的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)的試劑采用上述的DNA體外擴(kuò) 增方法。
[0039] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的第四個(gè)技術(shù)方案是：提供一種利用上 述的任一種引物組，或上述的任一種DNA體外擴(kuò)增方法，或上述的任一種試劑盒在TYR基因 突變檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0040] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的第五個(gè)技術(shù)方案是：提供一種利用上 述的任一種引物組，或上述的任一種DNA體外擴(kuò)增方法，或上述的任一種試劑盒在黑色素合 成異常篩查中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的引物組設(shè)及到TYR基因的大部分區(qū)域，包括外顯 子和內(nèi)含子，能較為全面獲取患者的TYR基因的核巧酸序列情況，明確突變位點(diǎn)；且該引物 組針對(duì)長(zhǎng)片段擴(kuò)增，在合適條件下擴(kuò)增出的條帶單一，無(wú)非特異性條帶，且由于擴(kuò)增片段 長(zhǎng)，與短片段擴(kuò)增方法相比測(cè)序結(jié)果更為均勻，數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單;本發(fā)明的試劑盒采用長(zhǎng) 片段DNA擴(kuò)增方法結(jié)合Ion Torrent測(cè)序技術(shù)的方式，具有高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、低成 本的優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 為了更清楚地說(shuō)明本申請(qǐng)實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。顯而易見(jiàn)地，下面所描述的附圖僅僅是本申請(qǐng)的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其他 的附圖。
[0043] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中家系成員TYR基因上的突變位點(diǎn)測(cè)序。
[0044] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中家系成員TYR基因上家系譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 為了使本申請(qǐng)的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用W解釋本申請(qǐng)，并不 用于限定本申請(qǐng)。
[0046] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種引物組、DNA體外擴(kuò)增方法、試劑盒及引物組、試劑盒和 DNA體外擴(kuò)增方法在TYR基因突變檢測(cè)W及黑色素合成異常篩查中的應(yīng)用。本說(shuō)明書中所述 "突變"可W是一個(gè)或多個(gè)堿基的插入、取代和/或缺失，或基因擴(kuò)增突變。所述"擴(kuò)增突變" 是指基因或基因的外顯子或基因的外顯子的區(qū)域的拷貝數(shù)選擇性地增加的現(xiàn)象和過(guò)程， 屬于基因拷貝數(shù)變異(Copy ruimber variations,CNV)的一種，擴(kuò)增突變很有可能導(dǎo)致相應(yīng) 蛋白表達(dá)的增加。
[0047] 本發(fā)明實(shí)施例的引物組分別用于擴(kuò)增TYR基因的相應(yīng)區(qū)域的長(zhǎng)片段，然后將擴(kuò)增 的目標(biāo)片段進(jìn)行基因型分析W確定基因突變情況，例如，將擴(kuò)增后的目標(biāo)片段進(jìn)行高通量 二代測(cè)序，W獲得擴(kuò)增的目標(biāo)片段的序列信息，并由此獲得突變檢測(cè)結(jié)果。其中，高通量二 代測(cè)序技術(shù)為現(xiàn)有技術(shù)，是在基于第一代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上被廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷與 攜帶者的篩查，詳細(xì)信息已在【背景技術(shù)】中予W介紹，運(yùn)里就不再陳述。
[0048] 本發(fā)明實(shí)施例的引物組設(shè)及到TYR基因的大部分區(qū)域，包括外顯子和內(nèi)含子，其包 括選自表1所示引物對(duì)中的至少1對(duì)或全部16對(duì)引物:具體引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)域具體如下 表1所示。
[0049] 表1檢測(cè)引物對(duì)
[0化1 ]
[0052] 為設(shè)計(jì)特異性的引物，首先需要獲取眼皮膚白化病致病基因 TYR的信息：通過(guò) Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM， http://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得眼皮膚白 化病致病基因信息，特別是獲取TYR基因的位置信息和突變位點(diǎn)信息，見(jiàn)表2"0MIM數(shù)據(jù)庫(kù)是 一種持續(xù)更新的關(guān)于人類基因和遺傳素亂的數(shù)據(jù)庫(kù)，主要著眼于可遺傳的或遺傳性的基因 疾病，包括文本信息和相關(guān)參考信息、序列紀(jì)錄、圖譜和相關(guān)其他數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0053] 表2眼皮膚白化病致病基因 TYR的位置信息 rnns4i
[005引其次，根據(jù)TYR基因設(shè)計(jì)特異性引物：
[0056] W基因組DNA為模板，根據(jù)UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)序列 (GR化37/hgl9)，W及TYR序列位置，共設(shè)計(jì)16對(duì)長(zhǎng)片段引物擴(kuò)增致病基因 TYR的全長(zhǎng)，包含 內(nèi)含子和外顯子，每對(duì)引物擴(kuò)增約10化的片段長(zhǎng)度，具體的引物序列及擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域如表1 所示。然后經(jīng)高通量二代測(cè)序(NGS)篩選突變位點(diǎn)。
[0057] 再次，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)模板中的目標(biāo)基因（即TYR基因）進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。其中，使用 上述的引物組作為PCR反應(yīng)的引物。
[0058] 提取外周血基因組DNA作為模板。提取方法可W采用多種市售的試劑盒，比如 QIAGEN公司的DNA提取試劑盒，或者OMEGA的基因組DNA提取試劑盒。
[0059] 在本發(fā)明實(shí)施例中，PCR反應(yīng)總體系為，包括長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶0.抓;模板30ng;上 游引物0.化1;下游引物0.化IdPCR擴(kuò)增條件為:在94°C下預(yù)變性lmin;98°C下變性10s;在65 。(:下退火30s，在68 °C下延伸lOmin，擴(kuò)增循環(huán)執(zhí)行30次;然后，在68 °C下解育30min。
[0060] 每對(duì)引物W上述PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可W擴(kuò)增出約10化長(zhǎng)度的DNA片段，本 發(fā)明實(shí)施例所設(shè)計(jì)16對(duì)引物，共擴(kuò)增16段約lOkb長(zhǎng)度的DNA片段，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.48,所有片段總長(zhǎng)序列幾乎包含了TYR基因的所有外顯子和內(nèi)含子序列。
[0061] 本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒，包括上述的引物組，還包括W下一種或多種試劑： 用于從樣品提取基因組DNA的試劑，例如DNA提取液、裂解酶、緩沖液等等;利用所述引物組 中的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)的試劑，例如DNA擴(kuò)增酶;用于處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物W使擴(kuò)增產(chǎn)物能夠 進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑，W及用于對(duì)處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑。
[0062] 本發(fā)明實(shí)施例所采用的高通量測(cè)序法為Ion Torrent測(cè)序法。優(yōu)選使用Life Technologies公司的Ion PGM測(cè)序儀進(jìn)行。Ion Torrent測(cè)序技術(shù)也被本領(lǐng)域技術(shù)人員稱為 二代測(cè)序技術(shù)，其是基于DNA合成過(guò)程所產(chǎn)生的化學(xué)變化。DNA聚合酶W單鏈DNA為模板，按 堿基互補(bǔ)原理，合成互補(bǔ)的DNA鏈。DNA鏈每延伸一個(gè)堿基時(shí)，就會(huì)釋放一個(gè)質(zhì)子，導(dǎo)致局部 pH變化。Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序忍片的每個(gè)微孔里的微球表面含有約100萬(wàn)個(gè)DNA分子拷 貝。測(cè)序時(shí)核巧酸分子連續(xù)流過(guò)忍片微孔。如果一個(gè)核巧酸與某個(gè)微孔中的DNA分子互補(bǔ)， 則該核巧酸被合成到DNA分子中，并且釋放質(zhì)子，該微孔中溶液的pH發(fā)生變化。離子傳感器 檢測(cè)到抑變化后，將該化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息。如果DNA鏈含有兩個(gè)相同的堿基，貝U 記錄電壓信號(hào)是雙倍的。如果堿基不匹配，則無(wú)質(zhì)子釋放，也就沒(méi)有電壓信號(hào)的變化。Ion Torrent測(cè)序技術(shù)屬于直接檢測(cè)DNA的合成，即，邊合成邊檢測(cè)。另外，Ion Torrent測(cè)序技術(shù) 不需要CCD掃描、巧光激發(fā)等環(huán)節(jié)，幾秒鐘就可檢測(cè)合成插入的堿基，大大縮短了運(yùn)行時(shí)間， 從而提高了檢測(cè)效率。
[0063] 試劑盒需要實(shí)現(xiàn)的功能，例如從外周血中提取基因組DNA等是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)， 并且市場(chǎng)上有很多成熟完善的商品化試劑可供選擇。
[0064] 試劑盒包含的用于處理擴(kuò)增產(chǎn)物W使得擴(kuò)增產(chǎn)物能用于高通量測(cè)序技術(shù)中的試 劑。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般無(wú)法直接用于高通量測(cè)序，還需要進(jìn)行處理，例如，末端修復(fù)，連接接 頭和標(biāo)簽、純化、修復(fù)缺口等。對(duì)于掌握高通量測(cè)序的普通技術(shù)人員而言，上述處理步驟和 所需要的試劑是容易理解的。本申請(qǐng)的實(shí)施例也提供了示例性的處理方法。
[0065] 試劑盒包含的用于對(duì)處理后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑。高通量測(cè)序通常 是在微孔忍片上進(jìn)行的。目前，商業(yè)化的忍片和反應(yīng)試劑容易購(gòu)得，例如可購(gòu)自Life Technologies Inc.。
[0066] 具體地，樣本基因組DNA的提?。喝⊥庵莒o脈血2ml，構(gòu)祿酸鋼抗凝。采用QIAamp DM Min化it(Qiagen)提取全血基因組DM，并放置-20°C保存。
[0067] PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為，長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶0.抓，DNA模板30ng和上下游引物（10山〇 各0.化1。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性1111111;98°(：1〇3,65°(：退火3〇3,68°(：延伸1〇111111;30個(gè)循環(huán)后 68 °C解育30min。取擴(kuò)增產(chǎn)物化1經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[006引 Ion Torrent測(cè)序：PCR產(chǎn)物混合后，通過(guò)Ion 化ear Plus Reagent Kit化ife technologies)酶切片段化，并采用 Ion Plus Fragment Library Kit 化；Lfe technologies)和Ion Xpress Barcode Adapter l_16(Xife technology)連接標(biāo)簽接頭 (Barcode Adapter),不同的家系成員使用不同的標(biāo)簽接頭(Barcode Adapter)。連接完成 后通過(guò)E-gel電泳制備平均大小約25化P的文庫(kù)模板，純化處理后再用Ion Plus Fragment Library Kit化ife technologies)進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備文庫(kù)，制備好的DNA文庫(kù)需要通過(guò) 如bit 2.0進(jìn)行定量，然后稀釋成相應(yīng)的濃度再通過(guò)Ion化e Touch進(jìn)行乳液PCR，并通過(guò)磁 珠顆粒在Ion OneTouch ES上對(duì)陽(yáng)性模板進(jìn)行富集，最后采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(Life technologies)及Ion To;rrent318忍片在Ion Torrent PGM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)， 共125測(cè)序循環(huán)。
[0069] 測(cè)序結(jié)果分析:采用Ion Torrent Suite v3.0軟件進(jìn)行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取及 序列比對(duì)和過(guò)濾。得到的突變位點(diǎn)經(jīng)dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾后，檢索肝豆?fàn)詈俗冃詳?shù)據(jù)庫(kù) 化t1:p: //www. wi Isondi sease. med. ua化erta. ca/database . asp)，篩選可能的致病突變位 點(diǎn)。
[0070] 核屯、家系遺傳分析和突變驗(yàn)證:二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)并經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到的后續(xù)突變位 點(diǎn)，在患者及其家系成員中相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序分析，確定符合孟德?tīng)栯[性遺傳規(guī)律 的位點(diǎn)為該先證運(yùn)的致病基因突變位點(diǎn)。
[0071] 在本發(fā)明實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了 16對(duì)引物，采用長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增方法對(duì)眼皮膚白 化病的致病基因 TYR進(jìn)行富集，然后在Ion Torrent PGM/ion Proton二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全 基因重測(cè)序。應(yīng)用該引物的試劑盒的擴(kuò)增片段能夠全面覆蓋TYR基因的所有外顯子、內(nèi)含子 及其他區(qū)域，因而此試劑盒W及引物在的分子診斷中具有非常高的實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0072] 實(shí)施例
[0073] 1、家系情況：
[0074] 先證者臨床表現(xiàn)為皮膚、頭發(fā)、和眼虹膜黑色素幾乎完全缺失，眼球水平振顫、畏 光明顯。父母雙方家族中無(wú)其他患者，先證者父母均表型正常，非近親婚配，且孕期無(wú)用藥 史或不良環(huán)境接觸史。本研究經(jīng)深圳市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 所有基因診斷均取得患者家屬的同意并簽署知情同意書。
[00巧]2、檢測(cè)方法：
[0076] (1)標(biāo)本收集和DNA提取:取先證者及其父母的外周靜脈血各2mL，構(gòu)祿酸鋼抗凝。 采用市面銷售的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA MiniKit，Qiagen公司產(chǎn)品）提取全血基因組 DNA，并放置-20°C保存。
[0077] (2)致病基因全長(zhǎng)基因序列分析:篩查致病基因酪氨酸酶基因（tyrosinase,TYR) 的位置信息如表2所示。
[0078] W基因組DNA為模板，根據(jù)UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)序列 (GR化37/hgl9)，共設(shè)計(jì)16對(duì)長(zhǎng)片段引物擴(kuò)增上述基因全長(zhǎng)(包括全部?jī)?nèi)含子和外顯子），每 對(duì)引物擴(kuò)增約10化的片段長(zhǎng)度。本發(fā)明實(shí)施例的PCR引物設(shè)計(jì)合理、高效、特異性強(qiáng)、靈敏度 高，通過(guò)該引物在合適條件下擴(kuò)增出的條帶單一，無(wú)非特異性條帶，且由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)，與 短片段擴(kuò)增方法相比測(cè)序結(jié)果更為均勻，數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單，具體的引物序列如表1所示。
[0079] (3)PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系為20化，長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶0.抓，DM模板30ng和上下游引物（10 咖)各 0.化 L。反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 1111111;98°(：1〇3,65°(：退火3〇3,68°(：延伸1〇111111;30個(gè)循環(huán) 后68 °C解育30min。取擴(kuò)增產(chǎn)物化L經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0080] 每對(duì)引物根據(jù)上述PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增出約10化長(zhǎng)度的DNA片段，本發(fā)明實(shí)施例所設(shè) 計(jì)16對(duì)引物，共擴(kuò)增16段約10化長(zhǎng)度的DNA片段，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.48。
[0081] (4)Ion Torrent測(cè)序：PCR產(chǎn)物混合后，通過(guò)Ion Siear Plus Reagent KitiXife technologies公司生產(chǎn)）酶切片段化，并采用Ion Plus Fragment Library Kit化ife technologies公司生產(chǎn)）和Ion Xpress Barcode Adapters l-16(Life technologies公司 生產(chǎn))連接Barcode Adapter,不同的家系成員使用不同的Barcode Adapter。連接完成后通 過(guò)E-gel電泳制備平均大小約250bp的文庫(kù)模板，純化處理后再用Ion Plus Fragment Ubra巧Kit化ife technologies公司生產(chǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備文庫(kù)。制備好的DM文庫(kù)需要 通過(guò)Qubit 2.0進(jìn)行定量，然后稀釋成相應(yīng)的濃度再通過(guò)Ion化eTouch進(jìn)行乳液PCR，并通 過(guò)磁珠顆粒在Ion OneTouch ES上對(duì)陽(yáng)性模板進(jìn)行富集，最后采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(Life technologies公司生產(chǎn)）及Ion Torrent 318忍片在Ion Torrent PGM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，共125個(gè)測(cè)序循環(huán)。
[0082] (5)測(cè)序結(jié)果分析:采用Ion Torrent Suite v3.0軟件進(jìn)行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取 及序列比對(duì)和過(guò)濾。得到的突變位點(diǎn)經(jīng)化SNP數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾后，檢索HGMD、L0VD等數(shù)據(jù)庫(kù)及查 詢相關(guān)文獻(xiàn)，并查詢檢索白化病數(shù)據(jù)庫(kù)化ttp://www. i巧CS.0巧/a化inism/)篩選出可能的 突變位點(diǎn)。
[0083] (6)核屯、家系遺傳分析和突變驗(yàn)證:二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)并經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到的候選突 變位點(diǎn)，在患者及其家系成員中相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序分析，確定符合孟德?tīng)栯[性遺傳 規(guī)律的位點(diǎn)為該先證者的致病基因突變位點(diǎn)。
[0084] 3、結(jié)果分析：
[0085] (1)基因測(cè)序質(zhì)量：從表3可W看出，父親、母親和患者的樣本測(cè)序讀數(shù)分別為 663752、579868和416271，測(cè)序平均深度分別為363.8、319.2和241.7,平均讀長(zhǎng)分別是 184bp、185bp和189bp。
[00化]表3 Ion Torrent的測(cè)序質(zhì)量
[0087]
[008引（2)基因測(cè)序診斷：先證者：先證者的TYR基因共檢測(cè)到2種雜合突變，分別為 0.9291郵(：和(3.11996〉1'。父親:父親的1￥1?基因檢測(cè)到1種雜合突變，(3.11996〉1'。母親:母親 的TYR基因檢測(cè)到1種雜合突變，c.929insC，詳見(jiàn)表4。
[0089] 表4家系成員中的白化病基因突變情況
[0090]
[0091] *突變位點(diǎn)參考人類基因組GR化37/hgl9版本;a等位基因父親來(lái)源，b等位基因母親 來(lái)源;致病基因用粗體顯示。
[0092] (3)Sange;r驗(yàn)證結(jié)果：如圖1所示，先證者為0CA I型患者，致病基因?yàn)門YR基因，致 病突變?yōu)镃. 929insC和C. 1199G〉T構(gòu)成雙重雜合子突變，其中C. 1199G〉T突變遺傳來(lái)自父親， c.929insC遺傳來(lái)自母親。W上結(jié)果符合孟德?tīng)柍Ｈ旧w隱性遺傳規(guī)律，如圖2所示。建議該 家庭在二胎妊娠過(guò)程中做產(chǎn)前基因診斷，W避免再出生于先證者類似病情的患兒。
[0093] 上述案例說(shuō)明，高通量二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)并經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到的后續(xù)突變位點(diǎn)，在患 者及其家系成員中相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序分析，確定符合孟德?tīng)栯[性遺傳規(guī)律的位點(diǎn)為 該先證者的致病基因突變位點(diǎn)。
[0094] 在本發(fā)明實(shí)施例中，首先，采用長(zhǎng)片段DNA擴(kuò)增方法結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)篩查眼皮膚 白化病TYR致病基因的突變。與傳統(tǒng)方法相比，該測(cè)序方法覆蓋了基因全部區(qū)域，包括TYR全 部外顯子和內(nèi)含子，能全面獲取患者在致病基因 TYR中核巧酸序列情況，明確突變位點(diǎn)，為 檢測(cè)基因突變提供了可靠的方法，具有很強(qiáng)的靈敏度和準(zhǔn)確性，為眼皮膚白化病的臨床診 斷提供分子生物學(xué)的診斷依據(jù)。
[0095] 其次，本發(fā)明實(shí)施例的PCR引物設(shè)計(jì)合理、高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高，利用該引物 通過(guò)檢測(cè)外周血提取DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，得到所需的PCR產(chǎn)物再進(jìn)行測(cè)序，與全基因組測(cè)序、 外顯子組測(cè)序方法相比，具有高效、低成本的優(yōu)勢(shì)。
[0096] 再次，本發(fā)明實(shí)施例設(shè)計(jì)的引物在合適條件下擴(kuò)增出的條帶單一，無(wú)非特異性條 帶，且由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)，與短片段擴(kuò)增方法相比測(cè)序結(jié)果更為均勻，數(shù)據(jù)分析更為簡(jiǎn)單。
[0097] 第四，本發(fā)明實(shí)施例針對(duì)TYR基因全部外顯子、內(nèi)含子進(jìn)行PCR擴(kuò)增再測(cè)序，可W為 發(fā)現(xiàn)眼皮膚白化病在致病基因中的新突變科學(xué)研究提供技術(shù)手段。
[0098] 第五，本發(fā)明實(shí)施例還可W應(yīng)用在其他與TYR突變相關(guān)的疾?。ㄈ缙つw惡性黑素 瘤、白癒風(fēng)等)的檢測(cè)或者篩查。
[0099] 顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì) 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可W做出其它不同形式的變化或 變動(dòng)。運(yùn)里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予W窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或 變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種引物組，其特征在于，該引物組包括用于在PCR中擴(kuò)增TYR基因多個(gè)長(zhǎng)片段的檢 測(cè)引物對(duì)，該引物組包括選自下列引物對(duì)中的至少1對(duì)： 序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的引物對(duì)； 序列如SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的引物對(duì)； 序列如SEQIDN0:19和SEQIDN0:20所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30所示的引物對(duì)； 序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的引物對(duì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組包含所述16對(duì)引物對(duì)。3. -種DNA體外擴(kuò)增方法，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA片段，其特征在于，使用如權(quán)利要求1或 2所述的引物組作為PCR引物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA體外擴(kuò)增方法，其特征在于，所述PCR的反應(yīng)體系為20μ1， 包括長(zhǎng)片段擴(kuò)增酶〇. 5U;模板30ng;上游引物0.4μ1;下游引物0.4μ1; 所述PCR的反應(yīng)條件為： 擴(kuò)增階段：在94°C下預(yù)變性lmin;98°C下變性10s;在65°C下退火30s，在68°C下延伸 lOmin； 對(duì)所述擴(kuò)增階段循環(huán)執(zhí)行30次； 循環(huán)執(zhí)行30次后，在68°C下孵育30min。5. -種試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括權(quán)利要求1或2所述的引物組。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括以下一種或多種試劑： 用于從樣品提取基因組DNA的試劑； 利用所述引物組中的引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)的試劑； 用于處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以使擴(kuò)增產(chǎn)物能夠進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑； 以及 用于對(duì)處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序的試劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述高通量測(cè)序?yàn)镮on Torrent測(cè)序。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述利用所述引物組中的引物對(duì)進(jìn)行 PCR反應(yīng)的試劑采用權(quán)利要求4所述的DNA體外擴(kuò)增方法。9. 權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的引物組，或權(quán)利要求3至4任一項(xiàng)的DNA體外擴(kuò)增方法，或權(quán)利 要求5至8任一項(xiàng)的試劑盒，在TYR基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的引物組，或權(quán)利要求3至4任一項(xiàng)的DNA體外擴(kuò)增方法，或權(quán) 利要求5至8任一項(xiàng)的試劑盒，在黑色素合成異常篩查中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106047871SQ201610639373
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月5日 公開(kāi)號(hào)201610639373.2, CN 106047871 A, CN 106047871A, CN 201610639373, CN-A-106047871, CN106047871 A, CN106047871A, CN201610639373, CN201610639373.2
【發(fā)明人】洪文旭, 段山, 汪保江, 林圣 , 谷學(xué)英, 邵豪
【申請(qǐng)人】深圳市人口和計(jì)劃生育科學(xué)研究所