用于檢測川崎病的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】提供用于檢測川崎病的方法及試劑盒。具體而言，提供用于測序或測量miRNA的試劑在制備用于檢測川崎病(KW)的試劑、微陣列或試劑盒中的用途，其中，所述miRNA選自miR?941、miR?182?5p和miR?183?5p的至少一種；以及用于檢測川崎病的微陣列或試劑盒，該微陣列或試劑盒包含用于在檢測樣本內(nèi)測序或測量下列miRNA：miR?941、miR?182?5p或miR?183?5p的至少一個(gè)的表達(dá)水平的試劑。
【專利說明】
用于檢測川崎病的方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測方法及試劑盒，特別是一種利用測量特定miRNA的表達(dá)水平 來檢測川崎病的方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在先前技術(shù)章節(jié)中討論的標(biāo)的主題不應(yīng)當(dāng)被假定為先前技術(shù)，僅作為在先前技術(shù) 章節(jié)中提及的結(jié)果。相似地，在先前技術(shù)章節(jié)中陳述的問題W及對(duì)該問題的原因的理解不 應(yīng)被假定為之前在先前技術(shù)中已習(xí)知。在先前技術(shù)章節(jié)中之標(biāo)的主題可僅僅代表不同的方 法，于該些方法中及該些方法本身亦可能作為發(fā)明。
[0003] 川崎病化awasaki disease，腳)是造成血管發(fā)炎作用的小兒疾病。雖然川崎病在 所有種族和族群中都有報(bào)告，然而此疾病主要影響的還是亞太族裔的孩童。
[0004] 川崎病初期和最明顯的癥狀是發(fā)燒至少五天。如果沒有治療，大約百分之20至25 的受影響孩童會(huì)導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈動(dòng)脈瘤，且川崎病在已開發(fā)國家中是年輕孩童后天性屯、臟疾 病的主要元兇。在開始發(fā)燒的前面10天內(nèi)成功地檢測川崎病，且接續(xù)高劑量靜脈注射免疫 球蛋白（IVIG)可大幅地降低冠狀動(dòng)脈損傷的發(fā)生率。
[0005] 根據(jù)美國屯、臟協(xié)會(huì)(American Hea;rt Association,AHA)于2004年的診斷基準(zhǔn)，目 前針對(duì)川崎病并沒有決定性的實(shí)驗(yàn)室診斷測試，且川崎病的診斷大多數(shù)為臨床診斷。運(yùn)些 診斷基準(zhǔn)包括發(fā)燒超過5日、兩側(cè)非化脈性結(jié)膜炎、粘膜變化、手腳的硬結(jié)性血管性水腫、崎 形皮疹（dysmo;rphous skin rashes)W及直徑大于1.5cm的急性非化脈性頸部淋己結(jié)腫大 (曰cute nonpurulent cervic曰1 lymph曰denop曰thy)〇
[0006] 然而，AHA基準(zhǔn)與日本循環(huán)器學(xué)會(huì)的指導(dǎo)方針略微不同，其使得川崎病的臨床診斷 復(fù)雜化。此外，傳染性疾病，像是葡萄球菌或鏈球菌的感染，可能會(huì)擬似川崎病。在受感染的 孩童中，臨床醫(yī)師難W精確地診斷川崎病且迅速地給藥IVIGW防止冠狀動(dòng)脈疾病。
[0007] 針對(duì)川崎病之經(jīng)濟(jì)且精確的實(shí)驗(yàn)室診斷測試的需求未被滿足，而本發(fā)明滿足此需 求與其他需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明掲露用于在受試者上檢測川崎病的方法，其包含:在受試 者的檢測樣本中測量miR-182-5p(SEQ ID No:2)的表達(dá)水平的步驟，其中，相對(duì)于在沒有川 崎病或控制組樣本中的miR-182-5p表達(dá)水平，在該受試者的檢測樣本中較高的miR-182-5p 表達(dá)水平指示受試者患有川崎病。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明掲露用于在受試者上檢測川崎病的方法，其包含:在受 試者的檢測樣本中測量miR-941 (SEQ ID NO: 8)的表達(dá)水平的步驟，其中相對(duì)于在無川崎病 或控制組樣本中的miR-941表達(dá)水平，受試者的較高的miR-941表達(dá)水平指示受試者患有川 崎病。
[0010] 在又另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明也掲露用于在受試者內(nèi)檢測川崎病的方法，其包含： 在受試者的檢測樣本中測量miR-183-5p(SEQIDN0:3)的表達(dá)水平的步驟，其中相較于無 川崎病或控制組樣本中的miR-183-5p表達(dá)水平，受試者的檢測樣本中有較高的miR-183-5p 表達(dá)水平指示受試者患有川崎病。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，提供用于在受試者內(nèi)檢測川崎病的方法，其包含測量 受試者的檢測樣本內(nèi)下列11111?酷3:11111?-182-59、11111?-183-59或11111?-941的至少一個(gè)的表達(dá)水 平的步驟，其中，相對(duì)于在無川崎病或控制組樣本中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平，在檢測樣本中 下列11111?酷:11111?-182-59、11111?-183-59或11111?-941的至少一個(gè)的較高表達(dá)水平是指示受試者 患有川崎病。
[0012] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，提供的是用于在受試者上檢測川崎病的方法，包含在受試者的 檢測樣本中測量下列miRNA:miR-182-5p、miR-183-5p、或miR-941的至少兩個(gè)的表達(dá)水平的 步驟，其中相對(duì)于在無川崎病或控制組樣本中相應(yīng)的miRNAs的表達(dá)水平，在測試樣本中上 述miRNAs的至少兩個(gè)的較高miRNA表達(dá)水平指示受試者患有川崎病。
[0013] 本發(fā)明也掲露用于在受試者上檢測川崎病的試劑盒，其包含在檢測樣本中用于測 序或測量下列miRNAs:miR-941、miR-182-5p或miR-183-5p的至少一個(gè)的表達(dá)水平的試劑。 在一實(shí)施例中，試劑盒進(jìn)一步包含指示用于測量miRNA的試劑是用于檢測川崎病的標(biāo)記。
[0014] 本發(fā)明也提供用于測序或測量miRNAs試劑在制備用于檢測川崎病化W)的試劑、微 陣列或試劑盒中的用途，其中，所述miRNAs選自：miR-941、miR-182-5p或miR-183-5p的至少 一個(gè)。
[0015] 在另一個(gè)例示性實(shí)施例中，提供一種用于建立川崎病特異的機(jī)器學(xué)習(xí)演算法的方 法，其包含：（a)測定下列來自無川崎病的受試者的參考樣本池 W及患有川崎病的受試者的 參考樣本池的miRNAs:miR-223-：3p(SEQ ID N0:l)、miR-182-5p(SEQ ID N0:2)、miR-183-5p (WQIDN0:3)、miR-378a-：3p((WQIDN0:4)、miR-30c-5p(WQIDN0:5)、miR-148a-：3p (沈Q ID NO:6)、miR-27a-：3p(SEQ ID N0:7)、miR-941(SEQ ID N0:8)、miR-140-：3p(SEQ ID N0:9)或miR-30e-：3p(SEQ ID N0:10)的至少一個(gè)的ACt值；W及(b)將從步驟(a)來自無川 崎病的受試者的該參考樣本池的至少一個(gè)Act值，W及來自有川崎病的受試者的該參考樣 本池的至少一個(gè)A Ct值存取(registering)進(jìn)入機(jī)器學(xué)習(xí)演算法；W及(C)使用在步驟(b) 的機(jī)器學(xué)習(xí)演算法建立二元分類模型(binary classification model)。
[0016] 在又另一個(gè)例示性實(shí)施例亦提供使用本文描述的川崎病特異機(jī)器學(xué)習(xí)演算法W 診斷川崎病的方法。
[0017] 此專利中使用的術(shù)語"發(fā)邸V'該發(fā)邸V'此發(fā)邸'、W及"本發(fā)邸'是旨在廣泛地指 稱本專利W及W下專利的申請(qǐng)專利范圍的全部適格標(biāo)的。包含運(yùn)些術(shù)語的陳述應(yīng)該被理解 成非對(duì)本文描述的主題標(biāo)的之限制，或是非對(duì)W下專利的申請(qǐng)專利范圍的意義或范疇之限 審IJ。被此專利涵蓋的發(fā)明的實(shí)施例是藉由W下申請(qǐng)專利范圍所定義，而非被此
【發(fā)明內(nèi)容】
所 定義。
【發(fā)明內(nèi)容】
是本發(fā)明的各種態(tài)樣的上位總覽，并且介紹一些將在W下實(shí)施方式章節(jié)中 進(jìn)一步描述的概念。此
【發(fā)明內(nèi)容】
非旨在界定所主張之專利標(biāo)的之主要或必要技術(shù)特征，也 非旨在獨(dú)立使用W決定所主張的專利標(biāo)的之范疇。專利標(biāo)的應(yīng)藉由參考整份說明書的合適 部分、任意或全部的圖式W及每一項(xiàng)申請(qǐng)專利范圍來理解。
[0018] 在與附圖及下列實(shí)施方式一同閱讀下，本發(fā)明將變得更顯而易知。
【附圖說明】
[0019] 本發(fā)明的描述性實(shí)施例將參考W下圖式于下文中更詳細(xì)地說明：
[0020] 圖1是描述使用qPCR分析31個(gè)發(fā)熱的控制組樣本化X軸上標(biāo)記為"C'）中W及37個(gè) 川崎病樣本（在X軸上標(biāo)記為"D")中的10個(gè)miRNA:miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、 111王尺-378日-39、11111?-30。-59、11111?-148日-化、11111?-27日-39、11111?-941、11111?-14〇-化或11111?-3〇6-化 的表達(dá)水平（Act)的長條圖。*林*、林*、林、^及*分別代表i)<0.0001、p<0.001、p<0.01 W及 p<0.05〇
[0021 ] 圖2是根據(jù)第1圖中10個(gè)miRNA表達(dá)水平（A Ct)的支持向量機(jī)器(suppod vector machines，SVM)分類模型的ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本申請(qǐng)案主張于2015年4月3日申請(qǐng)之美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/142,742的效益，其全部 內(nèi)容于此并入作為參考。
[0023] 如本文所使用，用語"一"指稱用語的語法對(duì)象的一個(gè)W上之一個(gè)或多個(gè)（即，至少 一個(gè))。
[0024] 術(shù)語"受試者"可指稱疑似患有川崎病的脊椎動(dòng)物。受試者包括溫血?jiǎng)游铮T如哺 乳類，像是靈長類，且較佳地是人類。非人類的靈長類也是受試者。術(shù)語受試者包括馴養(yǎng)動(dòng) 物，諸如貓、狗等，家畜(舉例來說，牛、馬、豬、綿羊、山羊等似及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(舉例來說，小鼠、 兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等）。
[00劇如本文可交替地使用的，"微RNAV'miR"或'miRNA"指稱來自miR基因的未經(jīng)處理 (例如，前體)的或經(jīng)處理(例如:成熟）的RNA轉(zhuǎn)錄本。微RNA是大約22個(gè)核巧酸長度的內(nèi)生性 非編碼單股RNAs，且構(gòu)成新一類的基因調(diào)節(jié)子(化ua，等人。（2009年）化rr .Opin.Mol.化er. (分子治療學(xué)新見），11:189-199)。
[00%]本文的所有數(shù)字可被"約"修飾來理解。
[0027] 診斷川崎病的方法
[0028] 本發(fā)明是部分地基于特定miRNA的鑒別，該些特定miRNA的表達(dá)水平在檢測樣本中 相較于無川崎病的樣本中的相應(yīng)miRNA的預(yù)定量是增加的。本發(fā)明的一些實(shí)施例是關(guān)于診 斷受試者是否具有川崎病，或是否有發(fā)展川崎病的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包含:測量來自受試者的 檢測樣本中至少一個(gè)miR的表達(dá)水平，且與無川崎病或控制組樣本中的相應(yīng)miR的表達(dá)水平 相比較，其中相對(duì)于該控制組樣本，在檢測樣本中較高miRNA表達(dá)水平則是該受試者具有川 崎病的指標(biāo)。
[0029] 在無川崎病或控制組樣本中的預(yù)定的miRNA表達(dá)水平是來自無川崎病的個(gè)體的代 表性樣本池，且是在無川崎病或控制組樣本中的平均數(shù)、中位數(shù)或其他統(tǒng)計(jì)學(xué)操縱變數(shù)，或 其他整合的或集結(jié)的代表性miRNA表達(dá)水平。
[0030] 較高的miRNA表達(dá)水平是相對(duì)的術(shù)語，且可藉由將在檢測樣本中的miRNA表達(dá)水平 與來自已知無川崎病的受試者的參考樣本池的miRNA表達(dá)水平相比較而測定。在一些實(shí)施 例中，在檢測樣本中的miRNA表達(dá)水平比來自已知無川崎病受試者的參考樣本池的miRNA表 達(dá)水平高5%、高10%、高15%、高20%、高25%、高30%、高35%、高40%、高45%、高50%、高 55%、高 60%、高 65%、高 70%、高 75%、高 80%、高 85%、高 90%、高 95%、高 100%、高 150%、 高200%、高250%、高300%、高350%、高400%、高450%、高500%。
[0031] 在一實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量下列miRNA:miR-223-3p、miR-182-5p、 miR-183-5p、miR-378a-^、miR-30c-5p、miR-148a-3p、miR-27a-^、miR-941、miR-14〇-3p、 或miR-30e-化的至少一個(gè)的表達(dá)水平，W診斷川崎病。
[0032] 在另一實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量下列miRNAs:miR-182-5p、miR-183- 5p或miR-941的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平W診斷川崎病。
[0033] 在一個(gè)例示性實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量miR-182-5p的表達(dá)水平W進(jìn) 行川崎病診斷。在另一個(gè)例示性實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量miR-183-5p的表達(dá) 水平W進(jìn)行川崎病診斷。在又另一個(gè)例示性實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量miR-941 的表達(dá)水平W進(jìn)行川崎病診斷。
[0034] 在又另一個(gè)實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量下列11111?^4:11111?-223-3口、11111?- 182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、miR-148a-：3p、miR-27a-3p、miR-941、miR- 140-化或miR-30e-化的兩個(gè)或更多的表達(dá)水平，W診斷川崎病。
[00巧]在一些實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量下列11111?酷:1]111?-27曰-3口、1]111?-148曰- 3口、11111?-30。-59、11111?-306-39、11111?-378日-39、11111?-233-化或11111?-140-化的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá) 水平W診斷川崎病。
[0036] 在一個(gè)例示性實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量miR-182-5pW及miR-183-5p 的表達(dá)水平W進(jìn)行川崎病診斷。在另一個(gè)例示性實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量 miR-182-5p及miR-941的表達(dá)水平W進(jìn)行川崎病的診斷。在又另一個(gè)例示性實(shí)施例中，在受 試者的檢測樣本中測量miR-183-5pW及miR-941的表達(dá)水平W進(jìn)行川崎病診斷。在又另一 個(gè)例示性實(shí)施例中，在受試者的檢測樣本中測量miR-182-5p、miR-183-5pW及miR-941的表 達(dá)水平W進(jìn)行川崎病的診斷。在一些實(shí)施例中，兩個(gè)或更多miRNA的表達(dá)水平的組合對(duì)于川 崎病診斷提供了較高的精確度、敏感性或特異性。
[0037] miRNA表達(dá)水平的測量指稱量化存在于樣本中的miRNA的量。測量特異的或任何 miRNA的表達(dá)水平可藉由使用任何所屬技術(shù)領(lǐng)域已知或是本文描述的方法來達(dá)成，像是透 過實(shí)時(shí)PCR、北方墨點(diǎn)法分析、或那些所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者已知的其他技術(shù)。測 量miRNA的表達(dá)水平包括測量miRNA的成熟形式或與miRNA表達(dá)相關(guān)的前體形式的表達(dá)。
[0038] 在特定的實(shí)施例中，至少一個(gè)miRNA的量是使用北方墨點(diǎn)法分析來偵測。舉例來 說，整體細(xì)胞的RNA可在核酸萃取緩沖液的存在下，藉由均質(zhì)化接著離屯、而從細(xì)胞純化。沉 淀核酸，且DNAW去氧核醋核酸酶化nase)處理W及沉淀作用來移除。RNA分子接著根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 技術(shù)，在瓊脂糖凝膠上藉由凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素過濾器。RNA接著藉由加熱 被固定（immobilized)在過濾器上。特定RNA的偵測及定量是藉由使用互補(bǔ)于所要的RNA的 合適標(biāo)記DNA或RNA探針來完成。舉例來說，請(qǐng)參閱，分子轉(zhuǎn)殖:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，J. Sambrook等 人，編著，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press) ,1989 年，第7章，其全部掲露內(nèi)容并入于此作為參考。
[0039] 在一些實(shí)施例中，理想是使用微陣列。微陣列是核酸、蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞或其他 能使復(fù)雜生化樣本能夠平行分析的其他物質(zhì)的微觀有序陣列。微陣列可使用各種技術(shù)來制 造，其包括W精細(xì)尖銳的細(xì)針印刷在玻片上、使用預(yù)先制作好的遮罩進(jìn)行光刻、使用動(dòng)態(tài)微 鏡裝置(dynamic micromirror devices)進(jìn)行光刻、噴墨印刷、或在微電極陣列上進(jìn)行電化 學(xué)程序。
[0040] miRNA的微陣列分析，舉例來說，可根據(jù)任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的通常知識(shí)來完成。在 一個(gè)實(shí)施例中，RNA是從細(xì)胞或樣本中萃取，使用變性聚丙締酷胺凝膠電泳從總RNA中W尺 寸挑選出小的RNA( 18至26個(gè)核巧酸RNA)。寡核巧酸鏈接物是附接至小RNA的5 '及3 '端，且結(jié) 果接合產(chǎn)物被使用作為10個(gè)循環(huán)的放大作用的反應(yīng)之RT-PCR的模板。正義股PCR引子具有 附接在其5端的蛋光基團(tuán)，因而蛋光地標(biāo)記該P(yáng)CR產(chǎn)物的正義股。PCR產(chǎn)物被變性且接著與微 陣列雜交。PCR產(chǎn)物，被稱為在陣列上互補(bǔ)于對(duì)應(yīng)的miRNA捕獲探針序列的標(biāo)祀核酸，將透過 堿基對(duì)被雜合至捕獲探針被貼附的位點(diǎn)。當(dāng)使用微陣列雷射掃瞄器激發(fā)時(shí)，位點(diǎn)將發(fā)出蛋 光。接著就特定miRNA的復(fù)本數(shù)目而言，藉由使用一些正控制組及負(fù)控制組W及陣列數(shù)據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)化方法來評(píng)估每個(gè)位點(diǎn)的蛋光強(qiáng)度，來達(dá)成特定miRNA的表達(dá)水平的評(píng)定。
[0041 ] 在一實(shí)施例中，微陣列包含用于測序或測量選自由miR-223-^、miR-182-5p、miR- 183-5p、miR-378a-^、miR-30c-5p、miR-148a-3p、miR-27a-^、miR-941、miR-14〇-3p、miR- 30e-化或其組合所組成的群組的miRNAs的miRNA-特異性探針寡核巧酸。
[0042] 在一些實(shí)施例中，定量RT-PCR的使用是理想的。定量RT-PCR(qRT-PCR)是用W快速 地測量聚合酶連鎖反應(yīng)的產(chǎn)物的數(shù)量的聚合酶連鎖反應(yīng)的改良。qRT-PCR通常針對(duì)決定遺 傳序列，像是miRNA是否存在于樣本中，W及若存在于樣本中則樣本中的復(fù)本數(shù)有多少的目 的來使用。任何可測定核酸分子，其包含miRNA的表達(dá)的PCR方法皆落入本發(fā)明的范疇內(nèi)。在 本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中有一些已知的qRT-PCR方法的變化，包括，但不限于:透過瓊脂糖凝 膠電泳，使用SYBR綠(雙股DNA染料)W及使用蛋光報(bào)導(dǎo)探針。
[0043] 差別地表達(dá)在川崎病及無川崎病受試者上的miRNA的鑒別允許W數(shù)種方法使用此 資訊。舉例來說，可評(píng)估特定的處理方式(例如測定療程對(duì)有川崎病的受試者而言是否有效 地防止冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥）。相似地，藉由將檢測樣本內(nèi)的miRNA表達(dá)水平與來自無川崎病樣 本的已知表達(dá)基因譜比較可完成或確認(rèn)診斷。此外，運(yùn)些miRNA表達(dá)譜允許在川崎病內(nèi)抑制 miRNA表達(dá)的候選藥物的篩選，或是將差預(yù)后基因譜轉(zhuǎn)換成較佳的預(yù)后基因譜。
[0044] 在一個(gè)例示性實(shí)施例中，提供用于建立川崎病特異性的機(jī)器學(xué)習(xí)演算法的方法， 其包含：（a)測定來自無川崎病的受試者的參考樣本池 W及來自患有川崎病的受試者的參 考樣本池的下列 miRNAs:miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、 miR-148a-化、miR-27a-3p、miR-941、miR-140-化或miR-30e-化的至少一個(gè)的ACt值；W及 (b)將從步驟(a)來自無川崎病的受試者的該參考樣本池的至少一個(gè)Act值，W及來自有川 崎病的受試者的該參考樣本池的至少一個(gè)Act值存取進(jìn)入機(jī)器學(xué)習(xí)演算法；W及(C)使用 在步驟(b)的機(jī)器學(xué)習(xí)演算法建立二元分類模型。
[0045] 在另一個(gè)實(shí)施例中，提供診斷川崎病的方法，其包含：（a)測定來自檢測樣本的下 列miRNAs:miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、miR-148a-3p、 miR-27a-：3p、miR-941、miR-140-3p或 miR-30e-：3p 的至少兩個(gè)的 Act值；W及(b)將來自步驟 (a)的A Ct值的一個(gè)或多個(gè)存取至本文描述的川崎病特異性機(jī)器學(xué)習(xí)演算法。
[0046] 機(jī)器學(xué)習(xí)網(wǎng)路的非限制性實(shí)例包含支持向量機(jī)器（Suppod Vector Machines, SVM)、人工類神經(jīng)網(wǎng)路（artificial neural networks)、決策樹學(xué)習(xí) （decision tree learning)(例如：CART、ID3、C4.5、CHAID、MARS、W及條件推理樹（Conditional Inference lYees))、基于實(shí)例的學(xué)習(xí) （instance based learning)(例如：K-最近鄰居法化-Nearest Neighbor))、貝氏網(wǎng)路（Bayesian networks)、基因演算法W及整體學(xué)習(xí) （ensemble learning)(例如：套袋(Bagging)與推進(jìn)(Boosting))。
[0047] 在一例示性實(shí)施例中，提供診斷川崎病的方法，其包含：（a)測定來自檢測樣本的 下列miRNAs :miR-182-5p、miR-183-5p、miR-941 的至少一個(gè)的 A Ct值；W及(b)將來自步驟 (a)的A Ct值之一個(gè)或多個(gè)存取至本文描述的川崎病特異性機(jī)器學(xué)習(xí)演算法中。在一個(gè)實(shí) 施例中，機(jī)器學(xué)習(xí)演算法是支持向量機(jī)器(SVM)。
[0048] 用于診斷川崎病的試劑盒
[0049] 本發(fā)明也提供用于診斷川崎病的試劑盒。試劑盒包含用于在檢測樣本內(nèi)測序或測 量下列miRNAs :miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、miR- 148日-化、11111?-27日-39、11111?-941、11111?-14〇-化或11111?-3〇6-39的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的試 劑。
[0050] 相較于在無川崎病樣本中的相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平而言，若在檢測樣本中的miRNA 表達(dá)水平較高，貝臟由使用試劑盒來診斷出川崎病。檢測樣本的非限制性實(shí)例包含體液(例 如:血清、血液、滲出液）W及組織。
[0051] 在一實(shí)施例中，試劑盒進(jìn)一步包含用于川崎病診斷的指示。在另一實(shí)施例中，試劑 是RT-PCR。在另一實(shí)施例中，試劑是特異于測序或測量SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、沈Q ID N0:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9 或SEQ ID NO: 10的miRNA的探針寡核巧酸。試劑可為在所屬技術(shù)領(lǐng)域中已知用于測量特異 性或任何miRNA的表達(dá)水平的試劑。
[0052] 本發(fā)明的實(shí)施例藉由下列實(shí)例來描述，其不W任何方式被解釋為強(qiáng)加對(duì)其范疇的 限制性。相反地，應(yīng)當(dāng)清楚地認(rèn)知到本申請(qǐng)可具有各種其他實(shí)施例、其修飾、W及其等效物， 在閱讀本文的描述之后，對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域具有通常知識(shí)者而言可意味著該些實(shí)施 例、修飾及等效物而不背離本發(fā)明的精神。在下列實(shí)例描述的研究期間，除非另有說明，否 則將遵照常規(guī)程序。W下僅為了說明性的目的而描述一些程序。
[0053] 在實(shí)例中所使用的材料及方法的描述
[0054] 于臺(tái)灣的高雄長庚紀(jì)念醫(yī)院，從被診斷出患有川崎病及無患有川崎病(發(fā)燒控制 組或"FC")的病患收集全血液樣本。透過內(nèi)科醫(yī)師診斷的臨床川崎病被認(rèn)為是本研究的黃 金準(zhǔn)則。FC是發(fā)燒超過5日然并非患有川崎病的病患。
[0055] 31個(gè)川崎病W及37個(gè)FC受試者被招收進(jìn)訓(xùn)練組，且19個(gè)川崎病及33個(gè)FC受試者被 招收進(jìn)盲測組。川崎病患的30%具有陽性冠狀動(dòng)脈病灶。廢棄或移除收集的血液樣本中的 紅血球。使用mirVana miRNA分離試劑盒（萊富生命科技(；Life technology)，CA，USA)萃取 剩余的白血球(WBC)部分的RNA，并進(jìn)一步藉由NGS或是實(shí)時(shí)PCR( qPCR)分析來處理。
[0056] 結(jié)果
[0化7] 藉由NGS的miRNA表達(dá)譜
[0化引12個(gè)FC的WBC樣本W(wǎng)及12個(gè)川崎病的WBC樣本隨機(jī)地選自訓(xùn)練組，且萃取的RNA被 匯總W形成四個(gè)RNA基因庫（兩個(gè)川崎病匯總的RNA基因庫W及兩個(gè)FC匯總的RNA基因庫）。 匯總的基因庫W Tni S eq愈Sma 11 RNA (宜曼達(dá)(111 um i na))樣本制備流程來制備，接著W次 世代測序(NGS)平臺(tái)來測序，其每個(gè)基因庫需要超過5百萬的序列讀數(shù)。在FASTQ格式的初始 序列讀數(shù)WmiRSeq(CT Pan等人，《用于測序品質(zhì)評(píng)估及miRNA剖析的便于使用獨(dú)立工具試 劑盒》（A User-Friendly Standalone Toolkit for Sequencing Quality Evaluation and miRNA Profiling),生物醫(yī)學(xué)研究國際期刊（Biomed Res Int) ,2014 年；2014:462135) 來分析，W評(píng)估整體測序品質(zhì)并測定miRNA表達(dá)基因譜，其顯示NGS數(shù)據(jù)是高品質(zhì)且一致。被 偵測且修整的3'轉(zhuǎn)接子的讀數(shù)的大部分是22-nt長，其暗示分析的序列讀數(shù)的大多數(shù)(超過 80%)是屬于miRNA基因。
[0059] 執(zhí)行叢聚分析W測試FC和川崎病樣本是否能基于miRNA表達(dá)基因譜來區(qū)分。熱圖 圖像顯示超過20個(gè)hsa-miRNAs在FC及川崎病樣本中差別地表達(dá)(在川崎病樣本中表達(dá)較 高），且挑選其中10個(gè)進(jìn)一步作qPCR驗(yàn)證。
[0060] qPCR 驗(yàn)證
[0061 ] 使用TaqMan巧MicroRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(萊富生命科技)來制備cDNA。在Veriti 96孔 熱循環(huán)儀(萊富生命科技)上根據(jù)制造商的說明執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍且 稀釋產(chǎn)物的扣1被用于qPCR反應(yīng)。使用7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（萊富生命科技）W及TaqMan 化iversal PCR預(yù)混液II不含UNG(萊富生命科技)來執(zhí)行定量RT-PCR。實(shí)時(shí)PCR循環(huán)條件為： 95°C10分鐘，接著進(jìn)行95°C15秒40個(gè)循環(huán)，W及60°C1分鐘。MicroRNA表達(dá)豐度藉由使用小 核仁RNA U6作為內(nèi)生控制組的A Ct值來測定。
[0062] qPCR驗(yàn)證顯示10個(gè)miRNA表達(dá)水平與NGS的表達(dá)水平一致。如第1圖所示，八個(gè) miRNA的A Ct在川崎病樣本與非川崎病樣本之間是差別地表達(dá)(P值）：
[0063] 1.hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-941W及hsa-miR-27a-3p(p< 0.0001);
[0064] 2.hsa-miR-148a-：3p(p<0.001);
[00化]3.hsa-miR-30c-5pW及hsa-miR-30e-3p(p<0.01);W及
[0066] 4.hsa-miR-378a-：3p(p<0.05)。
[0067] 雖然hsa-miR-233-3p和hsa-miR-140-3p的表達(dá)水平在川崎病樣本與發(fā)燒控制組 樣本之間沒有顯著的差異，但仍觀察出差別表達(dá)的趨勢(shì)(與控制組樣本相比，川崎病樣本的 ACt較低）（參見第l圖）。
[006引 KD特異性SVM校準(zhǔn)模型的執(zhí)行
[0069] 使用支持向量機(jī)器(SVM)的libsvm模組來發(fā)展川崎病特異性SVM校準(zhǔn)模型，W基于 miRNA表達(dá)來區(qū)別FC及川崎病樣本。使用來自37個(gè)FC及31個(gè)川崎病樣本的10個(gè)miRNAs的A Ct(闊值循環(huán))值，來發(fā)展川崎病特異的SVM校準(zhǔn)模型，且采用5倍交叉驗(yàn)證策略W剔除過度 配適 W 及乏適。10 個(gè) miRNAs(miR-223-：3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-：3p、miR-30c- 5p、miR-148a-化、miR-27a-3p、miR-941、miR-140-化W及miR-30e-化）的ACt值是使用SVM 校準(zhǔn)模型加權(quán)且運(yùn)算W計(jì)算出總分?jǐn)?shù)?？偡?jǐn)?shù)在0至1之間。若總分?jǐn)?shù)大于或等于0.5,其被 分類為陽性病例（川崎?。?，然而總分?jǐn)?shù)若小于0.5則被分類為陰性病例(FC)。如第姻所示， 用于診斷川崎病的最終SVM排列模型具有83.3%的敏感度及92.5%的特異性，致使87.9% 的整體精確度。此外，auROC值高達(dá)0.9。
[0070] 在獨(dú)立的定群上執(zhí)行獨(dú)立的盲測，該定群包含33個(gè)FC及19個(gè)川崎病受試者?；?上述的程序從收集的血液樣本中萃取RNA，且WqRT-PCR分析miRNA的表達(dá)基因譜。在川崎病 特異性SVM模型校準(zhǔn)后，19個(gè)川崎病樣本的中的16個(gè)被診斷為川崎病;33個(gè)FC樣本中的27個(gè) 被診斷為無川崎病，結(jié)果有六個(gè)偽陽性。因此，基于所測量的10個(gè)miRNA的Act值，相較于由 醫(yī)生診斷的川崎?。S金準(zhǔn)則），盲測展現(xiàn)了 84.20%的敏感性及81.8%的特異性，致使 82.7%的整體精確度。
[0071] 表2
[0072]
[0073] 從上述衍生的川崎病特異性SVM校準(zhǔn)模型，基于miR-182-5p、miR-183-5p及miR- 941的A Ct，被用于計(jì)算運(yùn)些miRNAs單獨(dú)或組合的敏感性、特異性和精確度。結(jié)果顯示于表 3。
[0074] 表3，]13日-11111?-182-59、113日-11111?-183-59及113日-11111?-941于川崎病診斷的敏感性、特 異性及精確度
[0075]
[0076] 結(jié)果顯示針對(duì)miR-182-5p診斷川崎病的精確度是69.16%，針對(duì)11111?-941診斷川崎 病的精確度是70.81%。相比之下，針對(duì)11111?-182-59及11111?-941組合診斷川崎病的精確度增 加至 75.22%。
[0077] 針對(duì)miR-183-5p診斷川崎病的敏感度是75.71%，針對(duì)11111?-182-5?診斷川崎病的 敏感度是58.57%。相比之下，針對(duì)11111?-182-59^及11111?-183-59的組合診斷川崎病的敏感度 增加至90.48 %。
[0078] 針對(duì)miR-182-5P診斷川崎病的特異性是78.21%，針對(duì)11111?-183-59診斷川崎病的 特異性是83.93%，針對(duì)miR-941診斷川崎病的特異性是73.93%。相比之下，川崎病檢測中 針對(duì)11111?-182-59、11111?-183-59^及11111?-941組合的特異性增加至87.14%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于測序或測量miRNA的試劑在制備用于檢測川崎病(KW)的試劑、微陣列或試劑盒 中的用途，其中，所述miRNA選自miR-941、miR-182-5p和miR-183-5p的至少一種。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA為miR-182-5p及miR-183-5p。3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA為miR-183-5p及miR-941。4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA為miR-182-5p及miR-941。5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA為miR-182-5p及miR-183-5p及 miR-941。6. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于測序或測量miRNA的試劑還包括用 于測序或測量 miR-27a-3p、miR-148a-3p、miR-30c-5p、miR-30e-3p、miR-378a-3p、miR-233-3p和hsa-miR-140_3p中的至少一種miRNA的試劑。7. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA表達(dá)水平藉由實(shí)時(shí)PCR來測定。8. -種用于檢測川崎病的微陣列或試劑盒，其特征在于，包含： 用于在一檢測樣本內(nèi)測序或測量下列miRNA:miR-941、miR-182-5p或miR-183-5p的至 少一個(gè)的表達(dá)水平的試劑。9. 如權(quán)利要求8所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，所述檢測樣本是血清。10. 如權(quán)利要求8所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，所述試劑是實(shí)時(shí)PCR。11. 如權(quán)利要求8所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，所述試劑是特異于miR-941、 miR-182-5p或miR-183-5p的探針寡核苷酸。12. 如權(quán)利要求8所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包含用于測量下列 miRNA:miR-27a-3p、miR-148a-3p、miR-30c-5p、miR-30e-3p、miR-378a-3p、miR-233-3p或 hsa-miR-140_3p的至少一個(gè)的試劑。13. 如權(quán)利要求12所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，所述試劑用于實(shí)時(shí)PCR。14. 如權(quán)利要求12所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，所述試劑是特異于^1?-27&-3卩、11111?-148&-3卩、11111?-30(3-5卩、11111?-3〇6-3卩、11111?-378&-3卩、11111?-233-3卩或118&-11111?-14〇-3卩的 探針寡核苷酸。15. 如權(quán)利要求8所述的微陣列或試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包含標(biāo)記指示用于測量 所述miRNA的所述試劑是用于檢測川崎病。16. -種用于建立川崎病特異性機(jī)器學(xué)習(xí)演算法的方法，其特征在于，包含： (a) 測定來自無川崎病的受試者的參考樣本池以及患有川崎病的受試者的參考樣本池 的下列miRNA:miR-223-3p(SEQ ID NO:l)、miR-182-5p(SEQ ID NO:2)、miR-183-5p(SEQ ID NO:3)、miR-378a-3p((SEQ ID N0:4)、miR-30c-5p(SEQ ID NO:5)、miR-148a-3p(SEQ ID NO:6)、miR-27a-3p(SEQ ID NO:7)、miR-941(SEQ ID N0:8)、miR-140-3p(SEQ ID NO:9)或 miR-30e-3p(SEQIDN0:10)的至少一個(gè)的ΔCt值； (b) 將從步驟(a)來自無川崎病的所述受試者的所述參考樣本池的ACt值的至少一個(gè)， 以及來自有川崎病的所述受試者的所述參考樣本池的ACt值的至少一個(gè)存取進(jìn)入一機(jī)器 學(xué)習(xí)演算法；以及 (c) 使用來自步驟(b)的所述機(jī)器學(xué)習(xí)演算法建立二元分類模型。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106047991SQ201610194943
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年3月31日 公開號(hào)201610194943.1, CN 106047991 A, CN 106047991A, CN 201610194943, CN-A-106047991, CN106047991 A, CN106047991A, CN201610194943, CN201610194943.1
【發(fā)明人】郭和昌, 李松洲, 詹文慶
【申請(qǐng)人】長庚醫(yī)療財(cái)團(tuán)法人高雄長庚紀(jì)念醫(yī)院