一種二膦酸化合物及其制備方法與應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種二膦酸化合物，具有式Ⅱ的結(jié)構(gòu)：其中，R1為H、OH或者鹵素，R2是烴基基團(tuán)M，烴基基團(tuán)M結(jié)構(gòu)是線(xiàn)性的、具有支鏈的、環(huán)的或具有芳香族環(huán)的，該烴基基團(tuán)M具有1～20個(gè)碳原子；R3是?H、?OH、?CN或具有1～20個(gè)碳原子的烴基基團(tuán)N。本發(fā)明提供了一種新型二膦酸鹽化合物對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者，可使骨細(xì)胞的骨形成和骨破壞維持一個(gè)較為理想的動(dòng)態(tài)平衡。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種二麟酸化合物及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種新的二膦酸化合物，以及制備所述新的二膦酸鹽化合物的方法， 屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，0P)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增 加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。目前骨質(zhì)疏松癥在全球常見(jiàn)病、多發(fā)病中居第7位，患 者總數(shù)超過(guò)2億人，我國(guó)超過(guò)9000萬(wàn)人患不同程度骨質(zhì)疏松，60歲以上老人骨質(zhì)疏松患病率 約 50 % ~60 %。
[0003] 二膦酸已被廣泛應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤相關(guān)性疾病如高鈣血癥和骨痛 癥、變形性骨炎等代謝性骨病。二膦酸分子基本結(jié)構(gòu)為由兩個(gè)膦酸根與一個(gè)中心碳原子連 接，基本的P-C-P結(jié)構(gòu)(式1)可取代骨內(nèi)的Ρ-0-Ρ結(jié)構(gòu)，成為在體內(nèi)不易被酶分解的化合物， 不發(fā)生生物降解。
[0004]
[0005] 在式1結(jié)構(gòu)中，其中心碳原子上有兩個(gè)可變的側(cè)鏈(R'、R〃），通過(guò)改變這些側(cè)鏈的 化學(xué)修飾來(lái)增加骨親和力和抗骨重吸收的強(qiáng)弱。二膦酸是一類(lèi)主要用于增加骨質(zhì)疏松患者 骨量、減少骨折危險(xiǎn)、減緩Paget's病骨轉(zhuǎn)換、治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移并對(duì)癌癥患者升高的血鈣水 平有降低作用的藥物。二膦酸應(yīng)用和發(fā)展前景十分廣闊，但是仍有很多亟待研究和解決的 問(wèn)題。主要有：
[0006] 1、二膦酸治療骨質(zhì)疏松主要是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的活性達(dá)到治療目的，但其對(duì)成 骨細(xì)胞的促進(jìn)作用卻不明顯，這導(dǎo)致患者長(zhǎng)期治療后會(huì)引起骨脆性增加，增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。 因此增強(qiáng)二膦酸對(duì)成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用是必要的；
[0007] 2、目前上市的二膦酸長(zhǎng)期服用都會(huì)存在一定的肝、腎毒性等毒副作用，因此開(kāi)發(fā) 具有高效、低毒、副作用小的二膦酸是廣大骨質(zhì)疏松患者的福音并且應(yīng)用前景廣闊。
[0008] 硒是人體必須的微量礦物營(yíng)養(yǎng)元素，常取代含硫氨基酸中的硫而成為含硒氨基 酸，參與體內(nèi)的正常生理生化過(guò)程。最常見(jiàn)的含硒氨基酸為硒蛋氨酸和硒半胱氨酸。硒可以 通過(guò)改善鈣磷代謝增加血鈣含量和骨鈣沉積、減少骨鹽分解，降低機(jī)體對(duì)鋁的吸收，對(duì)高鋁 引發(fā)的骨質(zhì)疏松有一定的保護(hù)作用，因而降低骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。補(bǔ)硒可使機(jī)體的抗 氧化能力得到優(yōu)化，從而降低發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥和骨質(zhì)疏松的可能性。此外，硒蛋白 對(duì)于骨代謝十分重要，缺硒往往同骨量減少以骨關(guān)節(jié)病密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松患者血清中谷 胱甘肽過(guò)氧化物酶以及其它抗氧化物質(zhì)含量也較對(duì)照組低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的二膦酸藥物所存在的毒副作用問(wèn)題，結(jié)合二 膦酸類(lèi)藥物和硒元素，開(kāi)發(fā)出一種新的含硒烷基的二膦酸鹽，同時(shí)兼顧二膦酸獨(dú)特的抗骨 質(zhì)疏松活性和硒的抗氧化能力。該新型化合物具有更好的抗骨質(zhì)疏松活性和更佳的生理效 應(yīng)，同時(shí)對(duì)肝腎等器官的毒副作用更小。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：
[0011] -種二膦酸化合物，具有式π的結(jié)構(gòu)：
[0012]
[0013] 式中，
[0014] 辦為!1、0!1或者鹵素。
[0015] R2是烴基基團(tuán)M，烴基基團(tuán)Μ結(jié)構(gòu)是線(xiàn)性的、具有支鏈的、環(huán)的或具有芳香族環(huán)的， 該烴基基團(tuán)Μ具有1~20個(gè)碳原子。烴基基團(tuán)Μ任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自!1、-0?3、-卩、-(：1、-31?、4(1〇 2、-3021?和-01?的基團(tuán)取代。顯然，烴基基團(tuán)1應(yīng)該是二價(jià)烴基基團(tuán)。當(dāng)烴基基團(tuán) Μ上的取代基團(tuán)為Η的時(shí)候，等價(jià)于烴基基團(tuán)Μ沒(méi)有其他的取代基，即烴基基團(tuán)可以是沒(méi)有被 取代的烴基基團(tuán)。
[0016] R3是-H、-〇H、-CN或具有1~20個(gè)碳原子的烴基基團(tuán)Ν，該烴基基團(tuán)Ν是線(xiàn)性的、支鏈 的、環(huán)的或芳香族的烴基基團(tuán)。其中，烴基基團(tuán)N具有1~20個(gè)碳原子。烴基基團(tuán)N任選地被一 個(gè)或多個(gè)選自^? 3、4、-(：1、-31?、4(1〇2、-3021?和-01?的基團(tuán)取代。當(dāng)烴基基團(tuán)~上的取代 基團(tuán)為Η的時(shí)候，等價(jià)于烴基基團(tuán)N沒(méi)有其他的取代基。
[0017] 優(yōu)選的，烴基基團(tuán)Μ和烴基基團(tuán)Ν可以是C1-C6的烷基、C1-C6的烯基、C1-C6的炔基， C5-C7的雜環(huán)或芳環(huán)，所述的雜環(huán)基團(tuán)可以包含1~4個(gè)獨(dú)立的選自氮、硫和氧的雜原子，以 使得這些雜環(huán)或者雜芳環(huán)的單一雜原子的數(shù)量至少為2。
[0018] 所述的取代基R各自獨(dú)立的選自：氫原子、-C00R'、-C0R'、-C0N(R'）2，C1~C1(^^^ 基、Cl~CIO的取代烷基、C2~C6的烯基、C2~C6的取代烯基、C2~C6的炔基、C2~C6的取代 炔基、芳基或取代芳基；
[0019]其中，R'各自獨(dú)立地選自：氫、C1~C6的烷基、芳基、取代基R"取代的C1~C6的烷基 或取代基R"取代的芳基；
[0020] 其中，取代基R"獨(dú)立地選自-OH、鹵原子、-NH2、-CN、C1-C4的烷基，C2-C4的烯基。 [0021] 優(yōu)選的，還可以進(jìn)一步的優(yōu)選取代基R為：Η、-C00H、-⑶0CH3、-COOC2H 5、-C00C3H7、_ COOC4H9、-COOCH2X、-COOC2H4X、-C0H、-COCH3、-COC2H5、-COC3H7、-C0C6H5、-⑶CH 2X、-COC2H4X、- CONH (CH3)、-CON (CH3) 2、-CON (CH3) C2H5、-CON (C2H5) 2、-CON (CH3) C3H7、-CON (C2H5) C3H7、甲基、 乙基、丙基、丁基、鹵取代甲基、鹵取代乙基、鹵取代丙基、鹵取代丁基、乙烯基、丙烯基、丁烯 基、齒取代乙烯基、齒取代丙烯基、齒取代丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、苯基、甲基苯基、 乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、三甲基苯基、甲乙基苯基、二乙基苯基、甲丙基苯基、鹵取 代苯基、氣基苯基、氛基苯基等。其中X為鹵素原子。
[0022]進(jìn)一步，所述的化合物中，RAH或0H。
[0023]進(jìn)一步，所述的化合物中，為鹵素。優(yōu)選的，R^F、Cl、BrSl。
[0024] 進(jìn)一步，所述的式Π 化合物，在辦中，烴基基團(tuán)Μ是具有1-10個(gè)碳原子的烴基基團(tuán)。 最好是具有1-5個(gè)碳原子的烴基基團(tuán)，其上至少有1個(gè)氨基或N(R) 2取代基。此N(R)2基團(tuán)上的 取代基R表示以支鏈、線(xiàn)性、環(huán)狀、芳香族、雜環(huán)或者芳雜環(huán)的構(gòu)型存在的具有1~12單元組 的烷基基團(tuán)、或者氫。兩個(gè)R基團(tuán)之間相互獨(dú)立，互不影響。進(jìn)一步的，取代基R選擇范圍與上 述取代基R的選擇范圍一樣。
[0025] 進(jìn)一步，所述的化合物中，烴基基團(tuán)Μ多個(gè)N(R)2基團(tuán)取代。
[0026] 進(jìn)一步，所述的化合物中，烴基基團(tuán)Μ是帶支鏈的烴基基團(tuán)，且烴基基團(tuán)Μ具有1~5 個(gè)碳原子，其上至少有1個(gè)氨基或N(R) 2取代基。此N(R)2基團(tuán)上的取代基R選擇范圍與上述R 取代基的選擇范圍一樣。
[0027]進(jìn)一步，優(yōu)選的所述的辦為以下基團(tuán)之一 ：1_氨基-1，2-亞乙基，1-氨基-1，3-亞丙 基，氨基亞甲基，二甲氨基亞甲基，1-氨基-2-氯-1，2-亞乙基，1-二甲氨基-1，2-亞乙基，-CH2-、-C2H5-、C3H5、_CH( CH2NH2) CH2-、_CH( CH = CHNH2) CH2-、-CH2CH (NH2) CH2-、-CH (C6H5) CH (NH2) CH2-、_CH (CH3) CH (NH2) CH2-、_CH (NH2) CH (NH2) CH2-、_CH (CH2NH2) CH2CH2-、_CH (CH3) CH (CH2NH2) CH2-、-CH (CH2NH2) CH (CH3) CH2-、-CH2CH (NH2) CH2CH2-、_CH( CH3) CH2CH2CH (NH2)-、-CH2CH(CH3)CH2CH(NH2)-、-CH(CH = CH2)CH(NH2)CH2-、-CH(CH = CH2)CH2CH(NH2)-、-CH (CONHCH3)-、-C(CON(CH3)2)-、-C(⑶ N(CH3)C2H5)-、-C(CON(C2H5)2)-、-C(CON(CH3)C3H7)-、-C (⑶ N(C2H5)C3H7)-、-CH(CH2(NH2)CH = CH2)-、-CH(CH = CH2)CH(NH2)-、-CH(NH2)C5H4-、-CH (NH2) CH2C5H4-、-CH2CH (NH2) C5H4-、-CH2C5H4CH (NH2)-等。
[0028] 進(jìn)一步，所述的化合物中，R3為H、0H、CN或帶支鏈的烴基基團(tuán)N，烴基取代基N具有1 ~10個(gè)碳原子。
[0029] 進(jìn)一步，所述的R3為以下基團(tuán)之一:-!1、-0!1、-01甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、丁基、 環(huán)丁基、戊基、環(huán)戊基、環(huán)己基、庚基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、1-環(huán) 戊基-乙基、2-甲硫基-丙基、2-甲氧基-丙基、2-二氣甲基-丙基、環(huán)丙基、-〇?3、-〇12〇?3、 _ CH2CH2CF3、_CH( CH3) CF3、-CH2X、-C2H5X、-C3H6X、-C4H7X、-CH2SCH3、-CH2SCH2X、-CH2SC2H5、-CH2SC3H7、-CH2SC4H9、-CH2CH2SCH3、-CH2CH2SCH2X、-CH2CH2SC2H5、-CH2CH2SC3H7、-CH2CH2SC4H9、- CHNHCH3、_CHN( CH3) 2、-CHNHC2H5、-CHNHCH2CH2CH3、_CHNHCH( CH3) 2、_CHN( CH3) C2H5、_CHN( CH3) C3H7、-CHN(CH3)C4H9、-CH2C0NHCH3、-CH2C0NHC2H5、-CH2C0NHC3H7、-CH2C0NHC4H9、-CH2CH2CONHCH3、-CH2CH2 ⑶ NHC2H5、-CH2CH2CONHC3H7、-CH2CH2CONHC4H9、_CH( CH3) C0NHCH3、-CH (CH3) CONHC2H5、_CH( CH3) CONHC3H7、_CH( CH3) CONHC4H9、-CH2SO2CH3、-CH2SO2C2H5、-CH2SO2C3H7、-CH2SO2C4H9、-CH2CH2SO2CH3、-CH2CH2SO2C2H5、-CH2CH2SO2C3H7、-CH2CH2SO2C4H9、_CH( CH3) SO2CH3、_ CH( CH3) SO2C2H5、_CH( CH3) SO2C3H7、_CH( CH3) SO2C4H9、-C3H6SO2CH3、-C3H6SO2C2H5、-C3H6SO2C3H7、-C3H6SO2C4H9、-CH2OCH3、-CH2OC2H5、-CH2OC3H7、-CH2CH2OCH3、-CH2CH2OC2H5、-CH2CH2OC3H7、-CH (CH3) OCH3、_CH (CH3) OC2H5、_CH (CH3) OC3H7、-C3H6〇CH3、-C3H6OC2H5、-C3H 60c3H7，其中 X為鹵原子。
[0030] 進(jìn)一步，所述的化合物中，含硒二膦酸選自以下品質(zhì)表現(xiàn)最佳。
[0031]
[0032]
[0033] 本發(fā)明還提供了上述具有式Π 結(jié)構(gòu)的二膦酸化合物的三種制備方法。
[0034] 一種制備上述具有式Π 結(jié)構(gòu)二膦酸化合物的方法，先合成一種含硒有機(jī)羧酸m， 結(jié)構(gòu)如下：
[0035] HOOC-R2-Se-R3
[0036] 式m
[0037] 通過(guò)式m合成含硒的二膦酸化合物。
[0038] 方法一：
[0039] 含硒有機(jī)羧酸(式m)中加入硼烷類(lèi)的醚類(lèi)溶液，將有機(jī)羧酸上面的氫取代形成硼 烷酯，反應(yīng)時(shí)間約30min~120min，反應(yīng)溫度為0°C~60°C，其中式m化合物與硼烷的摩爾比 為1:1~1:5。再加入烷基類(lèi)亞磷酸酯進(jìn)行親核取代，反應(yīng)時(shí)間為2h~24h，式ΙΠ 化合物與烷 基亞磷酸酯的摩爾比為1:2~1:6。最后加入醇，發(fā)生醇水解反應(yīng)，繼續(xù)反應(yīng)lh~4h。最終得 到式Π 結(jié)構(gòu)的二膦酸。
[0040] 進(jìn)一步，所述的硼烷類(lèi)的醚類(lèi)溶液中的醚類(lèi)為四氫呋喃和/或1，4-二氧六環(huán)。
[0041] 進(jìn)一步，所述的的醇水解中的醇為甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的一種或幾種。
[0042] 按照上述制備方法一，可以制備得到式Π 結(jié)構(gòu)的二膦酸化合物。上述制備方法的 過(guò)程如下：
[0043]
[0044] 本發(fā)明還提供了另外一種方法合成式Π 結(jié)構(gòu)二膦酸。
[0045] 方法二：
[0046] 將式ΙΠ 化合物與亞磷酸、三氯化磷在80°C~120°C溫度下反應(yīng)2h~8h，向反應(yīng)物中 加入水，1 g化合物m中加入lmL~40mL水，于90 °C~120 °C回流lh~6h，化合物m與亞磷酸的 摩爾比為1:1~1:6，化合物m與三氯化磷摩爾比為1:2~1:6，反應(yīng)液過(guò)濾，濾液中加入醇溶 液并于-5 °C~5 °C放置12h~48h，抽濾，固體用水洗滌，60 °C~120 °C真空干燥4h~10h，得到 具有式Π 結(jié)構(gòu)的二膦酸。
[0047] 進(jìn)一步，濾液中加入醇溶液中的醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等試劑。
[0048]按照上述制備方法二，可以制備得到式Π 結(jié)構(gòu)的二膦酸化合物。上述制備方法的 過(guò)程如下：
[0049]
[0050] 二膦酸鹽類(lèi)藥物用于治療骨質(zhì)疏松，其主要作用是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性、誘導(dǎo) 破骨細(xì)胞的凋亡起到抑制骨吸收，阻止骨吸收及骨微結(jié)構(gòu)的破壞。盡管上市的二膦酸類(lèi)化 合物對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用越來(lái)越強(qiáng)，但其對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用的影響較弱，這可能會(huì)導(dǎo) 致患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)地增加。
[0051] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0052]本發(fā)明提供了一種新型二膦酸鹽化合物以及制備所述化合物的方法和用途，并且 已經(jīng)鑒別出該化合物的結(jié)構(gòu)特征。在細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)中，使用已經(jīng)上市并廣泛使用的阿倫膦 酸鈉和唑來(lái)膦酸作為陽(yáng)性對(duì)照藥。通過(guò)系列SCDP化合物對(duì)體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的 評(píng)價(jià)研究表明，SCDP化合物不僅保持與阿倫膦酸鈉和唑來(lái)膦酸相似的抑制破骨細(xì)胞活力， 還具有比阿侖膦酸鈉和唑來(lái)膦酸較好的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用。故可以初步推斷，對(duì)老年 骨質(zhì)疏松患者，可使骨細(xì)胞的骨形成和骨破壞維持一個(gè)較為理想的動(dòng)態(tài)平衡。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 本發(fā)明中未特別說(shuō)明的百分比均為重量百分比。
[0054] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明 上述主題范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本
【發(fā)明內(nèi)容】
所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范 圍。
[0055]實(shí)施例1:合成SCDP-1化合物
[0056]本實(shí)施例舉二膦酸化合物為:3_硒羥基-2-氨基-1-羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結(jié)構(gòu) 式如下
[0057]
[0058]該化合物具體制備方法如下：
[0059] 將3-硒羥基2-氨基-丙酸1.68g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后加 入兒茶酚硼烷2.4g，反應(yīng)2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9.0g，反應(yīng)2h后，加入甲醇 40mL反應(yīng)2h。減壓蒸餾至油狀物產(chǎn)生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結(jié)晶得到白 色固體3-硒羥基-2-氨基-1-羥基亞丙基-1，1-二膦酸。
[0060] 該白色固體鑒定：
[0061] 4-^^(4001^,020)32.65(1^10,31.41-1.72(0,21015^51,111/2)315.88(?) [0062]經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-硒羥基-2-氨基-1-羥基亞丙基-1，1-二膦酸。 [0063]實(shí)施例2:合成S⑶P-2化合物
[0064]本實(shí)施例舉二膦酸化合物為:3_甲硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結(jié)構(gòu)式 如下
[0065]
[0066]該化合物具體制備方法如下：
[0067] 將3-甲硒基-2-氨基-丙酸1.82g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后加 入兒茶酚硼烷2.4g，反應(yīng)2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9. Og，反應(yīng)2h后，加入甲醇 40mL反應(yīng)2h。減壓蒸餾至油狀物產(chǎn)生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結(jié)晶得到白 色固體3-甲硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。
[0068] 該白色固體鑒定：
[0069] 4-^^(40011^,020)32.68(1^10,31.43-1.74(0,210 4,0.98(5,31015^51,111/ ζ)329·89(+Η)
[0070] 經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-甲硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1_二膦酸。 [0071]實(shí)施例3:合成SCDP-3化合物
[0072]本實(shí)施例舉二膦酸化合物為:4_甲硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結(jié)構(gòu) 式如下：
[0073；
[0074]該化合物具體制備方法如下：
[0075] 將4-甲硒基-2-氨基-丁酸1.96g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后加 入兒茶酚硼烷2.4g，反應(yīng)2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9. Og，反應(yīng)2h后，加入甲醇 40mL反應(yīng)2h。減壓蒸餾至油狀物產(chǎn)生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結(jié)晶得到白 色固體4-甲硒基-氨基-1羥基亞丁基-1，1-二膦酸。
[0076] 該白色固體鑒定：
[0077] 1H-NMR(400MHz,D20)52.68(TaH),5l.53(Q,2H) ,5l.32(T,2H)5,0.99(S,3H)〇MS (ESI，m/z)343.87(+H)
[0078] 經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為4-甲硒基-2-氨基-1羥基亞丁基-1，1_二膦酸。 [0079] 實(shí)施例4:合成S⑶P-4化合物
[0080]本實(shí)施例舉二膦酸化合物為：3_烯丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結(jié) 構(gòu)式如下：
[0081]
[0082]該化合物具體制備方法如下：
[0083] 將3-烯丙硒基-2氨基-丙酸2.08g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后 加入兒茶酚硼烷2.4g，反應(yīng)2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9.0g，反應(yīng)2h后，加入甲 醇40mL反應(yīng)2h。減壓蒸餾至油狀物產(chǎn)生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結(jié)晶得到 白色固體3-硒丙硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。
[0084] 該白色固體鑒定：
[0085] 1H-NMR(400MHz,D20)55.68(MaH)55.08(D,2H),52.63(TaH),52.10(D,2H),52.02 (D,2H)〇MS(ESI,m/z)355.87(+H)
[0086] 經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-烯丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1_二膦酸。 [0087] 實(shí)施例5:合成S⑶P-5化合物
[0088]本實(shí)施例舉二膦酸化合物為:3_丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結(jié)構(gòu) 式如下-
[0089]
[0090]該化合物具體制備方法如下：
[0091] 將3-丙硒基-2-氨基-丙酸2. lg、亞磷酸3.9g和甲苯10ml的混合物加熱至80°C，緩 慢滴入三氯化磷5.6g，滴畢同溫反應(yīng)4h，加入水20mL，加熱回流反應(yīng)4h。反應(yīng)液冷卻后加至 無(wú)水乙醇30ml中，冷凍析晶，過(guò)濾，濾餅用水重結(jié)晶，得白色固體。
[0092] 該白色固體鑒定：
[0093] 4-^1^(40010^,020)32.73(1^11)41.45-1.73(0,210 41.33(1211)41.42(]^ 2H),5l.02(T,3H)〇MS(ESI,m/z)37.88(+H)
[0094]經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1_二膦酸。
[0095] S⑶P系列化合物骨顯像研究
[0096] 99Tcm標(biāo)記化合物的制備及穩(wěn)定性研究
[0097] 99Tcm 標(biāo)記 SCDP 化合物：各 SCDP 濃度為 5mg/mL，SnCl2 為 50mg/mL。
[0098] 分別向 0 · 4mL SCDP-1、SCDP-2、SCDP-3、SCDP-4和SCDP-5溶液中加入PBS緩沖液 1.5mL，再加入SnCl 2溶液30yL，最后加入"Tcm〇4-淋洗液20yL(74MBq)，用PBS定容至2mL，震蕩 混勻靜置l〇min，并用濾頭過(guò)濾。最后將標(biāo)記溶液進(jìn)行紙薄層掃描(TLC)，標(biāo)記率大于95%方 可進(jìn)行體內(nèi)注射。
[0099] 對(duì)照藥99Tcm標(biāo)記亞甲基二膦酸(MDP):向5mg MDP中加入2.4mL PBS，然后向其中加 入"Tcm〇4-淋洗液25yL(93MBq)，用PBS定容至2.5mL，震蕩混勻靜置lOmin，并用濾頭過(guò)濾。最 后將標(biāo)記溶液進(jìn)行紙薄層掃描(TLC)，標(biāo)記率大于95%方可進(jìn)行體內(nèi)注射。
[0100] 標(biāo)記化合物穩(wěn)定性研究：經(jīng)研究各SCDP化合物及對(duì)照藥MDP在標(biāo)記后其標(biāo)記率皆 大于95%。
[0101] 99Tcm標(biāo)記化合物兔骨顯像結(jié)果
[0102] 用雙探頭電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描成像系統(tǒng)對(duì)給與99Tcm#記藥物的各組進(jìn)行掃 描，通過(guò)固定的感興趣區(qū)域做骨與肌肉、骨與血、骨與肝、骨與腎、骨與膀胱的放射性計(jì)數(shù)比 值，分別計(jì)算30、60、120、180、240min時(shí)，骨與組織對(duì)放射性物質(zhì)的攝取比值結(jié)果見(jiàn)表1。 [0103]表1兔感興趣區(qū)域放射性計(jì)數(shù)比值表
[0104]
[0105]
[0106]從表1可見(jiàn)，各SCDP系列化合物其趨骨性與對(duì)照藥MDP相當(dāng)，故SCDP化合物可開(kāi)發(fā) 為一種供臨床診斷用骨顯像劑。
[0107]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)系列SCDP化合物的抗骨質(zhì)疏松能力。
[0108] 采用成骨細(xì)胞（OBs)及破骨細(xì)胞（OCs)兩種體外細(xì)胞模型對(duì)這五種SCDP化合物 (SCDP-1、SCDP-2、SCDP-3、SCDP-4和SCDP-5)的體外抗骨質(zhì)疏松能力進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，并以目 前臨床上被公認(rèn)治療骨質(zhì)疏松藥物阿侖膦酸(ALN)和唑來(lái)膦酸(Z0L)作為陽(yáng)性對(duì)照。系列 SCDP化合物對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響用KM種（昆明種)24h內(nèi)新出生乳鼠顱蓋骨為源代的成骨 細(xì)胞，評(píng)價(jià)藥物對(duì)促成骨細(xì)胞增殖能力和促成骨細(xì)胞礦化能力影響。系列SCDP化合物對(duì)破 骨細(xì)胞功能的影響用購(gòu)自日本C0SM0BI0公司的大鼠破骨細(xì)胞前體試劑盒，評(píng)價(jià)藥物對(duì)抑制 破骨細(xì)胞活力的影響。
[0109] 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)，取24h內(nèi)新出生乳鼠10只左右，拉頸處死后投入盛有75%乙 醇的燒杯內(nèi)消毒5min。成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)采用通用的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)出符合實(shí)驗(yàn)要求數(shù)量 和質(zhì)量的成骨細(xì)胞。
[0110] 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（CTL組）、唑來(lái)膦酸組（Z0L組）、阿侖膦酸組（ALN組）和5個(gè) SCDP化合物組，各實(shí)驗(yàn)組濃度為HTVol/L。數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P< 0.05認(rèn)為與對(duì)照組(CTL組)有顯著性差異。
[0111] 促成骨細(xì)胞增殖能力
[0112] 大鼠成骨細(xì)胞以3 X103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μΙ，每組設(shè)6個(gè)平行 孔進(jìn)行測(cè)定。過(guò)夜培養(yǎng)后(37°C，5%C02)，待細(xì)胞貼壁完全，吸干培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組情況 每孔分別加入含對(duì)應(yīng)藥物的培養(yǎng)基1〇〇μ1，繼續(xù)培養(yǎng)后第1、2、3天取每組6孔樣本進(jìn)行檢測(cè)。 增殖能力測(cè)定采用CCK-8試劑盒在測(cè)定，原理為CCK-8溶液中的WST-8可被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫 酶氧化還原后生成的橙黃色甲臢染料溶解在培養(yǎng)基中，生成的甲臢量與活細(xì)胞的數(shù)量成正 比，測(cè)定溶液的吸光度值(0.D)即可間接反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，即增殖能力。以成骨細(xì)胞增殖促 進(jìn)率為評(píng)價(jià)結(jié)果。成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)率=[(0. D^n/0. -1 ] X 100 %。結(jié)果見(jiàn)下表2:
[0113]表2促成骨細(xì)胞增殖平均促進(jìn)率（％ )
[0114]
[0115] 促成骨細(xì)胞礦化能力
[0116] 每組設(shè)3個(gè)平行孔進(jìn)行測(cè)定，大鼠成骨細(xì)胞以4X104/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，每 孔體積500μ1。過(guò)夜培養(yǎng)后（37 °C，5 %⑶2)，待細(xì)胞貼壁完全，吸干培養(yǎng)基。每孔分別加入含 對(duì)應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基500μ1，向加樣培養(yǎng)基中加入礦化誘導(dǎo)劑(含2πιΜβ-甘油磷酸鈉(β- GP)，10nM地塞米松和50yg/mL抗壞血酸），每3d換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)至第21天，每組3孔樣本 進(jìn)行檢測(cè)。
[0117]礦化能力測(cè)定用細(xì)胞的茜素紅染色，其中礦化結(jié)節(jié)被染成橘紅色。再向染色的成 骨細(xì)胞中加入10 %西吡氯胺溶液，每孔加200μ1，靜置30min，橘紅色紅色結(jié)節(jié)逐漸被溶解， 溶液呈現(xiàn)紫紅色。將溶液轉(zhuǎn)入96孔板中，每孔100μΙ，于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(0.D)。 礦化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)率（％) = [ (0. Dffia/o. -1 ] X 100 %。結(jié)果見(jiàn)下表3:
[0118]表3促成骨細(xì)胞礦化能力平均促進(jìn)率（％ )
[0119]
[0120]系列SCDP化合物藥物對(duì)促成骨細(xì)胞增殖能力和促成骨細(xì)胞礦化能力影響結(jié)果表 明，對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力各SCDP藥物與Z0L和ALN比較，皆具有一定的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作 用;在反映藥物對(duì)骨形成作用的礦化能力，各SCDP藥物促進(jìn)作用顯著優(yōu)于Z0L和ALN。從上述 結(jié)果表明，各SCDP化合物皆有促成骨能力。
[0121] 對(duì)破骨細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究
[0122] 破骨細(xì)胞的骨吸收能力測(cè)定采用日本C0SM0BI0公司的破骨細(xì)胞骨吸收檢測(cè)試劑 盒進(jìn)行測(cè)定。取出骨吸收檢測(cè)試劑盒中的48孔板，每孔小心沿孔壁加入0.25mL試劑盒中的 BONE RESORPTION ASSAY FACS，每孔接種細(xì)胞懸液500yL，每孔接種細(xì)胞6.5X103cells/ mL。每孔加入100 X藥物母液各5yL。連續(xù)培養(yǎng)4~7天，中間不換液。連續(xù)培養(yǎng)4天后，從骨吸 收檢測(cè)板各孔中取l〇〇yL細(xì)胞培養(yǎng)上清至96孔板中。96孔板各孔中加入50yL試劑盒中的 BONE RESORPTION ASSAY BUFFER，輕輕混勻。用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值，若骨吸收 效果不明顯，可將骨吸收檢測(cè)板全部更換新鮮無(wú)酚紅的培養(yǎng)基，再相應(yīng)加入藥物，再連續(xù)培 養(yǎng)至7d后重復(fù)檢測(cè)。抑制破骨細(xì)胞活力抑制率（％) = [1-(0.1)|^/0.0?0]\100%。結(jié)果見(jiàn) 下表4:
[0123] 表4抑制破骨細(xì)胞活力平均抑制率（％ )
[0124]
[0125] 系列SCDP化合物藥物對(duì)破骨細(xì)胞抑制活力，從表4結(jié)果可見(jiàn)，除SCDP-1、與SCDP-5 外，在第4天抑制破骨細(xì)胞抑制活力低于Z0L和ALN外，其它各SCDP都優(yōu)于Z0L和ALN。在第7天 各SCDP藥物的抑制破骨細(xì)胞活力與Z0L和ALN相當(dāng)。
[0126] 總之，通過(guò)系列SCDP化合物對(duì)體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的評(píng)價(jià)研究，表明， S⑶P化合物不僅保持與Z0L和ALN相似的抑制破骨細(xì)胞活力，還具有比Z0L和ALN較好的促進(jìn) 成骨細(xì)胞增殖作用。故可以初步推斷，對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者，可使骨細(xì)胞的骨形成和骨破壞 維持一個(gè)較為理想的動(dòng)態(tài)平衡。
[0127] 實(shí)施例6
[0128] 按照實(shí)施例1的合成方法一，合成以下二膦酸化合物：
[0129]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種二麟酸化合物，具有式π的結(jié)構(gòu)：式中， 化為Η、ΟΗ或者面素。 R2是控基基團(tuán)Μ，控基基團(tuán)Μ結(jié)構(gòu)是線(xiàn)性的、具有支鏈的、環(huán)的或具有芳香族環(huán)的，該控 基基團(tuán)Μ具有1~20個(gè)碳原子;控基基團(tuán)Μ任選地被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選自H、-CF3、-F、-C1、- SR、-N(R)2、-S02R和-OR的基團(tuán)取代;顯然，控基基團(tuán)Μ應(yīng)該是二價(jià)控基基團(tuán)； R3是-H、-〇H、-CN或具有1~20個(gè)碳原子的控基基團(tuán)Ν，該控基基團(tuán)Ν是線(xiàn)性的、支鏈的、 環(huán)的或芳香族的控基基團(tuán)；其中，控基基團(tuán)N具有1~20個(gè)碳原子;控基基團(tuán)N任選地被一個(gè) 或多個(gè)選自H、-C的、斗、-(：1、-51?、-則1〇2、-5〇21?和-〇如勺基團(tuán)取代； 所述的取代基R各自獨(dú)立的選自：氨原子、-C00R'、-C0R'、-C0N(R'）2，C1~CIO的烷基、 Cl~CIO的取代烷基、C2~C6的締基、C2~C6的取代締基、C2~C6的烘基、C2~C6的取代烘 基、芳基或取代芳基； 其中，R '各自獨(dú)立地選自：氨、C1~C6的烷基、芳基、取代基r取代的C1~C6的烷基或取 代基R"取代的芳基； 其中，取代基護(hù)獨(dú)立地選自-OH、面原子、-畑2、-CN、Cl-C4的烷基，C2-C4的締基。2. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，控基基團(tuán)Μ和控基基團(tuán)N是C1-C6的燒 基、C1-C6的締基、C1-C6的烘基，C5-C7的雜環(huán)或芳環(huán)，所述的雜環(huán)基團(tuán)可W包含1~4個(gè)獨(dú)立 的選自氮、硫和氧的雜原子，W使得運(yùn)些雜環(huán)或者雜芳環(huán)的單一雜原子的數(shù)量至少為2。3. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，優(yōu)選取代基R為:H、-C00H、-C00C曲、- C00C2 也、-C00C3 出、-C00C姐9、-C00CH2X、-COOC2H4X、-C0H、-C0C 曲、-C0C2 也、-C0C3 出、-C0C6曲、- C0CH2X、-COC2H4X、-C0NH (邸3)、-CON (邸3) 2、-CON (邸3) C2也、-CON (C2也）2、-CON (邸3) C3出、-CON (C2曲)C3出、甲基、乙基、丙基、下基、面取代甲基、面取代乙基、面取代丙基、面取代下基、乙 締基、丙締基、下締基、面取代乙締基、面取代丙締基、面取代下締基、乙烘基、丙烘基、下烘 基、苯基、甲基苯基、乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、Ξ甲基苯基、甲乙基苯基、二乙基苯 基、甲丙基苯基、面取代苯基、氨基苯基、氯基苯基等;其中X為面素原子。4. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，Ri為面素原子、Η或 OHo5. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的式Π 化合物，在R2中，控基基團(tuán)Μ 是具有1-10個(gè)碳原子的控基基團(tuán)；最好是具有1-5個(gè)碳原子的控基基團(tuán)，其上至少有1個(gè)氨 基或N(R)2取代基;此N(R)2基團(tuán)上的取代基R表示W(wǎng)支鏈、線(xiàn)性、環(huán)狀、芳香族、雜環(huán)或者芳雜 環(huán)的構(gòu)型存在的具有1~12單元組的烷基基團(tuán)、或者氨；兩個(gè)R基團(tuán)之間相互獨(dú)立，互不影 響。6. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，控基基團(tuán)Μ被多個(gè)N (R)2基團(tuán)取代。7. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，控基基團(tuán)Μ是帶支鏈 的控基基團(tuán)，且控基基團(tuán)Μ具有1~5個(gè)碳原子，其上至少有1個(gè)氨基或N(R)2取代基。8. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，優(yōu)選的所述的R2為W下基團(tuán)之一 ：1-氨 基-1,2-亞乙基，1-氨基-1,3-亞丙基，氨基亞甲基，二甲氨基亞甲基，1-氨基-2-氯-1,2-亞 乙基，1-二甲氨基-1,2-亞乙基，-畑2-、-C2出-、C油5、-CH (C出畑2) C出-、-CH( CH = CHN出） C出-、-C此 CH (N此）C此-、-CH (C6曲）CH (N此）C此-、-CH (C曲）CH (N出）C出-、-CH (畑2) CH (N出） CH2-、-CH (C此畑2) CH2C出-、-CH (CH3) CH (C此畑2) C此-、-CH (CH2N出）CH (CH3) CH2-、-CH2CH (畑2) CH2C此-、-CH (CH3) CH2C出 CH (畑2) -、-OfeCH (CH3) CH2CH(畑2) -、-CH (CH=CH2) CH (畑2) C出-、-CH (CH = CH2^H2CH(NH2)-、-CH(CONHCH3)-、-C(CON(Ol3)2)-、-C(CON(CH3)C2H5)-、-C(CON (C2 也）2)-、-C(C0N(CH3)C3 出）-、-C(C0N(C2 也）C3 出）-、-CH(C 出（N 出）CH=CH2)-、-CH(CH = CH2) CH (畑2) -、-CH (畑2) C5H4-、-CH (畑2) CH2C5H4-、-CH2CH (畑2) C5H4-、-CH2C5H4CH (畑2 )-等。9. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，R3為H、0H、CN或帶支 鏈的控基基團(tuán)N，控基取代基N具有1~10個(gè)碳原子。10. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的R3為W下基團(tuán)之一 CN、甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、下基、環(huán)下基、戊基、環(huán)戊基、環(huán)己基、庚基、乙締基、丙締基、下 締基、乙烘基、丙烘基、下烘基、1-環(huán)戊基-乙基、2-甲硫基-丙基、2-甲氧基-丙基、2-二氣甲 基-丙基、環(huán)丙基、-CF3、-C此 CF3、-C此 C此 CF3、-CH (C曲）CF3、-C此X、-C2曲X、-C抽6X、-C祖7乂、- 畑25畑3、-畑25畑2乂、-畑25〔2出、-畑25〔3化、-畑25〔姐9、-畑2畑25畑3、-畑2畑25畑2乂、- C出 C出 SC2 也、-C出 C出 SC3 出、-C出 C出 SC姐9、-CHNHC出、-CHN( C出）2、-CHNHC 抽5、-CHNHC出 C出 C出、- CHNHCH (C曲）2、-CHN (C出）C2曲、-CHN (C出）C3出、-CHN (C出）C姐9、-C此 CON肥曲、-C出 C0NHC2曲、- 畑2CONHC3H7、-CH2CONHC4H9、-CH2CH2CONH畑3、-CH2CH2CONHC2H5、-CH2CH2CONHC3H7、- CH2CH2CONHC姐9、-畑（畑3) C0NHCH3、-畑（畑3) CONHC2H5、-畑（畑3) CONHC3H7、-畑（畑3 ) CONHC4H9、-C出S化C出、-C出S化C2也、-C出S化C3出、-OfeS化C4H9、-C出C出S化C出、-C出C出SO2C2也、- C出 C此 S化 C3出、-C出 C此 S化 C姐9、-CH (C出）S〇2C出、-CH (C曲）S化 C2曲、-CH (C出）SO2C3出、-CH (C出） S〇2C姐 9、-C3H6SO2C 出、-C3H6SO2C2H5、-C3H6SO2C3H7、-C3H6SO2C姐9、-C 出 0C出、-C 出 OC2H5、- C此0?；?、-C此C出0C曲、-C此C出0。曲、-C此C此0。出、-CH (C出）0C出、-CH (C出）0。也、-CH (C出） 0C3出、-C3也0C出、-C3也0C2也、-C3也Oc抽7，其中X為面原子。11. 如權(quán)利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，含砸二麟酸是W下 之一：12.-種制備上述具有式π結(jié)構(gòu)二麟酸化合物的方法，先合成一種含砸有機(jī)簇酸虹，結(jié) 構(gòu)如下： 冊(cè) OC-R2-Se-R3 式虹 通過(guò)式虹合成含砸的二麟酸化合物。13. 根據(jù)權(quán)利要求12制備上述具有式Π 結(jié)構(gòu)二麟酸化合物的方法，其特征在于， 含砸有機(jī)簇酸（式虹）中加入棚燒類(lèi)的酸類(lèi)溶液，將有機(jī)簇酸上面的氨取代形成棚燒 醋，反應(yīng)時(shí)間約30min~120min，反應(yīng)溫度為0°C~60°C，其中式虹化合物與棚燒的摩爾比為 1:1~1:5。再加入烷基類(lèi)亞憐酸醋進(jìn)行親核取代，反應(yīng)時(shí)間為化~2地，式虹化合物與烷基 亞憐酸醋的摩爾比為1:2~1:6。最后加入醇，發(fā)生醇水解反應(yīng)，繼續(xù)反應(yīng)化~地。 最終得到式Π 結(jié)構(gòu)的二麟酸。14. 根據(jù)權(quán)利要求12制備上述具有式Π 結(jié)構(gòu)二麟酸化合物的方法，其特征在于， 將式虹化合物與亞憐酸、Ξ氯化憐在80°C~120°C溫度下反應(yīng)化~化，向反應(yīng)物中加入 水，1 g化合物虹中加入ImL~40血水，于90 °C~120 °C回流化~化，化合物虹與亞憐酸的摩爾 比為1:1~1:6,化合物虹與Ξ氯化憐摩爾比為1:2~1:6,反應(yīng)液過(guò)濾，濾液中加入醇溶液并 于-5 °C~5 °C放置1化~48h，抽濾，固體用水洗涂，60°C~120°C真空干燥地~lOh，得到具有 式Π 結(jié)構(gòu)的二麟酸。15. 上述的二麟酸化合物在治療骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07F9/38GK106083925SQ201610539886
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】李明起, 潘俊男, 王翰, 曾永龍, 曹剛, 文德仲, 程作用, 鄧啟民, 段玉春, 蔣雪, 劉媛媛
【申請(qǐng)人】成都云克藥業(yè)有限責(zé)任公司