一種黃粉蟲天然抗氧化八肽的分離鑒定及功能分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃粉蟲肽的分離鑒定及功能分析方法，采用超聲處理、技術篩選、超濾分子截流、分子篩、反相高壓液相色譜(HPLC)柱層析、質(zhì)譜和氨基酸分析等技術，從誘導的黃粉蟲中分離到氨基酸序列為SEQ ID NO:1的八肽，并進一步驗證其抗氧化活性，證實其抗氧化功能強于谷胱甘肽，為該天然抗氧化八肽的產(chǎn)品開發(fā)應用奠定了基礎。
【專利說明】
一種黃粉蟲天然抗氧化八肽的分離鑒定及功能分析
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃粉蟲八肽的分離鑒定方法及其應用，屬于生物技術學領域。
【背景技術】
[0002] 黃粉蟲(Tenebrio molitor Linne)別名大黃粉蟲，黃粉甲，俗稱面包蟲，屬昆蟲 綱，鞘翅目，擬步行甲科，粉蟲屬。黃粉蟲原屬倉庫害蟲，但近年來國內(nèi)外廣大科技工作者在 實驗材料選取，飼料生產(chǎn)和食品、保健品研發(fā)等領域?qū)S粉蟲進行了深入的研究并取得了 一系列重要的突破，給予其集實驗昆蟲和資源昆蟲于一身的黃粉蟲以"蛋白質(zhì)飼料寶庫"之 美譽。黃粉蟲是一種具有飼用、食用、藥用等多種利用價值的昆蟲資源，具有廣闊的開發(fā)與 利用前景。
[0003] 黃粉蟲是一種高蛋白、高脂肪和氨基酸含量較全面的昆蟲資源，其含有多種糖類、 維生素、礦物質(zhì)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，lkg黃粉蟲干粉含蛋白質(zhì)489g、脂肪288g、糖類107g、硫胺 素0.65mg、核黃素5.2mg、維生素4.4mg、鉀13.7g、鈣1.38g、磷6.83g、鐵65mg，此外還富含鈉、 鎂、鋅、銅、錳、硒等礦物質(zhì)元素。
[0004] 黃粉蟲作為飼料昆蟲歷史悠久，已廣泛用于多種飼養(yǎng)業(yè)。作為飼料，黃粉蟲不僅蛋 白質(zhì)含量高，氨基酸比例合理，脂肪酸質(zhì)量和微量元素含量均優(yōu)于魚粉;而且黃粉蟲幼蟲適 宜活體直接飼喂，對動物生長的促進作用是其它飼料所不能比的。在家禽生產(chǎn)中，用黃粉蟲 飼喂雛雞、鵪鶉、烏雞、斗雞、鴨、鵝等禽類，喂養(yǎng)的雛禽不僅生長發(fā)育快、產(chǎn)卵期提前，繁殖 率及成活率都有提高，而且可抗病能力增強。但長期以來，對于黃粉蟲如何提高飼喂雛禽抗 病能力的研究卻鮮有報導。
[0005] 自從Harman自由基理論的提出，人們逐漸認識到動物體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與衰 老和眾多疾病密切相關。自由基，又稱游離基，是獨立存在、外層軌道上帶有一個或一個以 上未配對電子的原子、原子團或分子，其特點為化學反應活性高、不穩(wěn)定。在機體內(nèi)過多的 自由基可損傷生物大分子，影響細胞的正常結構和功能。自由基可攻擊生命大分子物質(zhì)及 細胞壁，造成機體的多種損傷和病變，加速機體的衰老。在食品等復雜體系中，過多自由基 的存在也會嚴重影響體系的穩(wěn)定性。動物體內(nèi)有多種自由基，尤以氧自由基最多，也稱為活 性氧，它們是需氧生物有氧呼吸的產(chǎn)物。
[0006] 生物體內(nèi)存在由抗氧化劑和抗氧化酶構成的抗氧化防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)是需氧生物 減輕氧化損傷而形成的氧化應激機制，正常情況下機體依靠體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)一方面 直接清除氧自由基，另一方面使受自由基損傷的生物大分子，在監(jiān)視和修復系統(tǒng)的作用下 得以改正，即使還剩下未被很好修復的細胞，也可通過凋亡機制由吞噬細胞清除，上述生物 反應維持了自由基生成與清除的動態(tài)平衡。但當機體處于不良環(huán)境狀態(tài)下，以及隨著年齡 的增長，體內(nèi)的自由基將會產(chǎn)生過多或清除過慢。當活性氧的濃度超過細胞防御能力時，氧 化損傷就可改變細胞的結構和功能，影響機體健康。目前，已知哺乳動物體內(nèi)有兩類消除自 由基的系統(tǒng):一類為酶促系統(tǒng)，主要包括超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(P0D);另一類為非酶促系統(tǒng)，主要包括維生素 E、維生 素 C、類胡蘿卜素、白蛋白和金屬結合蛋白。生理狀況下，機體的自由基產(chǎn)生及清除處于平衡 狀態(tài)，一旦機體這種平衡失調(diào)，則自由基對組織細胞將產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷。上述自由基清 除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內(nèi)多余的自由基，減輕多余自由基對機體的損傷。已有研究 證實，氧化損傷與人類及其他動物的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈硬化等的發(fā)病機理有 關。
[0007] 動物體通過適當攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì) 過氧化，幫助機體抵御疾病。由于天然抗氧化劑具有較強抗氧化活性和很高安全性，因此人 們把研究重點逐步轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑，從各種植物、動物組織中提取，如茶多酚、大豆異黃 酮、肌肽、枸杞多糖、大豆肽，以及慈菇、扇貝、六月霜的提取物等等。而且重要的是生物體內(nèi) 的許多具有抗氧化活性的物質(zhì)屬于蛋白質(zhì)類，由于蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的乳化特性，能在油水 界面起介導作用，因此其在清除生物體內(nèi)過量自由基，抑制膜脂質(zhì)過氧化方面更具有重要 意義。
[0008] 隨著營養(yǎng)學和生物技術的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)介于蛋白質(zhì)和氨基酸間的肽類，由于其 特殊的結構特點，與氨基酸和大分子蛋白質(zhì)等相比較，其食用安全性更高，具有極強的活性 和多樣性，且其抗氧化性更為顯著。通常把這類具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自 由基功效的生物活性肽稱為抗氧化活性肽(簡稱抗氧化肽）?？寡趸钚噪木哂幸种企w內(nèi)血 紅蛋白、自由鐵離子、體外單線態(tài)氧和脂氧合酶催化的脂肪酸敗的功效。
[0009] 抗氧化肽的開發(fā)與應用已成為國內(nèi)外研究的熱點。肽類產(chǎn)品的制備途徑通常分 為:化學合成、生物工程(重組技術)和從生物中篩選天然肽類三種?；瘜W合成常受到合成起 始點的基礎結構的限制，生物工程技術也存在如不正確轉(zhuǎn)錄而導致蛋白折疊不準確等問 題，從生物中篩選天然肽來具有來源豐富、物質(zhì)天然的有點，因而倍受研究者關注。
[0010]針對抗氧化肽研究現(xiàn)狀，本發(fā)明
【申請人】選用黃粉蟲之一長期以來重要的飼料蛋白 資源進行研究，對其作為飼料的價值進行深入研究，進一步探究其提高飼喂動物抗病能力 的機制，從黃粉蟲體內(nèi)經(jīng)濟、高效地分離獲得一種新型抗氧化肽，并研究其抗氧化功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 技術問題
[0012] 本研究采用了超聲處理、技術篩選、超濾分子截流、分子篩、反相高壓液相色譜 (HPLC)柱層析、質(zhì)譜和氨基酸分析等技術，從超聲誘導的黃粉蟲中分離到一個全新的八肽， 命名為TM-1，并鑒定其氨基酸的結構組成，并進一步驗證其抗氧化活性，對其在體內(nèi)的抗氧 化調(diào)節(jié)機制進行深入系統(tǒng)的研究，從而為黃粉蟲抗氧化肽的臨床應用提供理論依據(jù)，并有 望推進生物活性學理論的發(fā)展。
[0013]技術方案
[0014] 本發(fā)明的一個方面涉及到黃粉蟲抗氧化活性小肽的分離、純化及質(zhì)譜分析鑒定， 首先利用超濾濃縮技術，通過微孔濾膜(排阻率為l〇〇〇Da)在外來壓力作用下，回收分子量 lOOODa以下的有效成分獲得粗提物；
[0015] 將獲得的粗提物經(jīng)真空干燥，再次濃縮；
[0016] 濃縮后粉末經(jīng)再溶解后，用分子篩和反向高效液相色譜(RP-HPLC)分離，從而獲得 多種黃粉蟲活性肽成分；
[0017] 將收獲的各活性肽成分經(jīng)M0DIL-T0F質(zhì)譜分析，測定上述活性肽的完整的氨基酸 序列，并對上述活性肽組分的抗氧化功能進行檢測，獲得具有抗氧化功能的P-7組分，進一 步分析得到該組分的氨基酸序列為IIVCPYDK，命名為TM-1。
[0018] 本發(fā)明的另一方面涉及一種黃粉蟲天然抗氧化肽制品，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1 IIVCPYDK。
[0019] 本發(fā)明的再一方面涉及一種黃粉蟲天然抗氧化肽制品的應用，將上述天然抗氧化 肽制品用作飼料添加劑。
[0020] 進一步的，本發(fā)明操作的具體步驟如下：
[0021] -種黃粉蟲天然抗氧化肽的分離鑒定方法，具體步驟為：
[0022] (1)樣品處理，稱取100g黃粉蟲幼蟲超聲處理后，經(jīng)液氮反復凍融、碾碎混勻，獲得 黃粉蟲勻漿樣品；
[0023] (2)蛋白抽提，在上述獲得的黃粉蟲勻漿樣品中加入50ml蛋白抽提液，置于4°C過 夜處理，充分抽提后，將所獲得的樣品經(jīng)離心4°C，12000g，30min處理后取上清備用，其中蛋 白抽提液為50mM HEPES pH7.0，10mM b-ME，lmM EDTA，1.0mM Na3V04 pH 7.0,50mM NaF pH 7.0,ImM PMSF,2mM benzamidine,lmg/ml leupeptin,pepstain A，aprotinin;
[0024] (3)去除雜蛋白等大分子物質(zhì)，將步驟(2)中獲得的上清置于80°C水浴中充分反應 lh后，再次離心，4°C，12000g，60min，分為三層，上層為多脂層，中層為小分子多肽層，下層 為雜蛋白層，取中間上清液；
[0025] (4)將步驟(3)中獲得的上清液通過1000Da超濾膜進行超濾處理，超濾獲得的樣品 進行真空凍干操作；
[0026] (5)將步驟(4)真空凍干處理獲得的粉末用0.01MPBS(PH = 7.2)稀釋，12000g離心 l〇min，然后將獲得的上清液通過0.22um濾膜過濾；
[0027] (6)將步驟(5)中過濾處理后的樣品經(jīng)分子篩（Sephadex G-50)純化分析，收獲活 性峰P7(見圖1)，并真空凍干處理；
[0028] (7)將真空凍干粉用B液（2%乙腈，0.065%三氟乙酸）稀釋，12000g離心10min，然 后用0 · 22μηι濾膜過濾；
[0029] (8)高效液相純化分析取濾液經(jīng)反向，收獲滯留時間的活性，Α液為100%乙腈，Β液 為2%乙腈加0.065%三氟乙酸；
[0030] (9)收獲的洗脫液經(jīng)MALDI-T0F-MS分析，氨基酸序列為SEQ ID N0:1 IIVCPYDK。
[0031] 本發(fā)明還采用改良FRAP法、羥自由基清除率的測定方法以及超氧自由基清除率的 測定方法對黃粉蟲天然抗氧化八肽TM-1的抗氧化活性進行檢測，并與常規(guī)的抗氧化劑谷胱 甘肽進行了對比。
[0032] 在研究了該黃粉蟲天然抗氧化八肽抗氧化生物活性的基礎上，本發(fā)明還對其在飼 料制備中的應用進行了研究。
[0033] 有益效果
[0034]獲得TM-1有中進行所有的反應，便于自動化操作，加入過量的反應物可以獲得高 效率的產(chǎn)物多種途徑，除上述方法以外，固相多肽合成技術也是當下流行可行的方法。固相 合成肽現(xiàn)在可以在程序控制的自動化多肽合成儀上進行，即在一個反應容器，同時產(chǎn)物很 容易分離、純化。本發(fā)明中，由生物公司采用固相合成TM-1，純度可達97%以上。
[0035] 本發(fā)明所述的天然抗氧化八肽的提取和鑒定方法具有原料來源豐富、價格低廉、 簡便快速的特點，而且其所提純制備的抗氧化八肽純度高且安全環(huán)保，與化學合成的抗氧 化肽相比，具有無毒、無殘留，不受合成起始點的核酸結構限制，選擇昆蟲作為原材料，具有 較高的食用安全性，具有生產(chǎn)成本低、周期短、得率高的特點，可廣泛應用了飼料添加等領 域，具有極大的產(chǎn)業(yè)價值。
【附圖說明】
[0036] 圖1:高效液相色譜分離黃粉蟲活性肽，箭頭所指為P-7的洗脫峰 [0037]圖2:黃粉蟲活性肽的化學組成
[0038]圖3:總抗氧化能力實驗，與谷胱甘肽對照組比較，抗氧化效果差異極顯著（P< 0.01)
[0039] 圖4:羥自由基實驗，與谷胱甘肽對照組比較，抗氧化效果差異極顯著(P<0.01)
[0040] 圖5:清除02- ·自由基的活性實驗，與谷胱甘肽對照組比較，抗氧化效果差異極顯 著（Ρ<0·01)
【具體實施方式】：
[0041] 實施例1、黃粉蟲肽的分離與鑒定：
[0042] (1)樣品處理，稱取100g黃粉蟲幼蟲超聲處理后，經(jīng)液氮反復凍融、碾碎混勻，獲得 黃粉蟲勻漿樣品；
[0043] (2)蛋白抽提，在上述獲得的黃粉蟲勻漿樣品中加入50ml蛋白抽提液，置于4°C過 夜處理，充分抽提后，將所獲得的樣品經(jīng)離心4°C，12000g，30min處理后取上清備用，其中蛋 白抽提液為50mM HEPES pH7.0，10mM b-ME，lmM EDTA，1.0mM Na3V04 pH 7.0,50mM NaF pH 7.0,ImM PMSF,2mM benzamidine,lmg/ml leupeptin,pepstain A，aprotinin;
[0044] (3)去除雜蛋白等大分子物質(zhì)，將步驟(2)中獲得的上清置于80°C水浴中充分反應 lh后，再次離心，4°C，12000g，60min，取中間上清液(上層為多脂層，中層為小分子多肽層， 下層為雜蛋白層）；
[0045] (4)將步驟(3)中獲得的上清液通過lOOODa超濾膜進行超濾處理，超濾獲得的樣品 進行真空凍干操作；
[0046] (5)將步驟⑷真空凍干處理獲得的粉末用roS稀釋，12000g離心10min，然后將獲 得的上清液通過〇 · 22um濾膜過濾；
[0047] (6)將步驟(5)中過濾處理后的樣品經(jīng)分子篩（Sephadex G-50)純化分析，收獲活 性峰1(見圖1)，并真空凍干處理；
[0048] (7)將真空凍干粉用B液（2%乙腈，0.065%三氟乙酸）稀釋，12000g離心10min，然 后用0 · 22μηι濾膜過濾；
[0049] (8)高效液相純化分析取濾液經(jīng)反向，收獲滯留時間的活性。Α液為100%乙腈，Β液 為2%乙腈加0.065%三氟乙酸；
[0050] (9)收獲的洗脫液經(jīng)MALDI-T0F-MS分析，氨基酸序列為SEQ ID N0:1 IIVCPYDK。 [0051 ]該方法首次實現(xiàn)了抗氧化活性肽從黃粉蟲的天然分離。
[0052]實施例2、黃粉蟲天然抗氧化八肽的抗氧化實驗：
[0053]本實施例采用改良FRAP法、.羥自由基清除率的測定方法以及超氧自由基(02- ·) 清除率的測定方法對黃粉蟲天然抗氧化八肽TM-1的抗氧化活性進行檢測，并與常規(guī)的抗氧 化劑谷胱甘肽進行對比。
[0054] 1.還原能力的測定
[0055] 采用改良FRAP(Ferric Reducing Ability of Plasma)法進行還原能力測定。檢 測原理是:抗氧化劑能將三價鐵離子還原為二價鐵離子，而二價鐵離子能使菲啉類物質(zhì)形 成穩(wěn)固的絡合物而呈現(xiàn)出明顯的藍色，并于593nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度的大小計 算樣品抗氧化活性/還原能力的強弱。該方法反映的不是樣品針對某一種自由基的清除活 性，而是樣品總還原能力。取3.0m 1新配的FRAP試劑[25m 1醋酸鹽緩沖液（30OmM，pH3.6)， 2 · 5ml TPTZ(10mM)，鹽酸溶液(40mM)，2 · 5ml FeCl3(20mM)溶液組成]，分別向其中加入2ml 濃度為(^]?、10(^]?、20(^]\1、30(^]\1、40(^]\1和50(^]\1各種濃度的黃粉蟲八肽1]\1-1溶液和谷胱甘 肽溶液，加熱到37°C，維持反應10分鐘，形成藍色的Fe 2+-TPTZ復合物，593nm測吸光度，以0~ 500μΜ FeS04制作標準曲線。還原力標準曲線的制作：取不同體積的0.217ImM FeS04溶液， 用蒸餾水補充至2mL，再加入3mL TPTZ工作液，混勾后于37°C反應30min后于59nm處測定吸 光度，由吸光度對FeS04進行回歸后，制定還原力標準曲線方程。根據(jù)還原力標準曲線方程， 樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeS04微摩爾數(shù)表示。
[0056]從附圖3種的結果可以看出，隨著TM-1濃度的增加，還原力不斷增加。表明TM-1還 原能力隨著濃度的增加而增強，呈正相關。且比谷胱甘肽效果強。
[0057] 2.羥自由基清除率的測定方法
[0058]參照Fenton反應的方法建立反應體系模型。H2〇2與Fe2+混合后產(chǎn)生羥自由基，輕自 由基具有很高的反應活性，存活時間短，但在反應體系中加入水楊酸能有效地捕捉羥自由 基并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在510nm處有強吸收，若加入具有清除羥自由基功能的被測物便 會與水楊酸競爭羥自由基，從而使紫色產(chǎn)物的生成量減少。簡言之，反應管中分別加入lml 硫酸亞鐵溶液(6mM)，lml樣品（TM-1和谷胱甘肽)和lmlH2〇2(6mM)。將該混合物搖勻、孵育10 分鐘，接著加入lml水楊酸(6mM)。10分鐘后，在510nm處測定溶液的吸光度。
[0059] 清除率的計算公式如下:清除率=[l-(Ai-Aj)/Ao]X100%。
[0060] 其中，Ao為空白溶液的吸光值;Ai為樣品中加入水楊酸溶液的吸光值;Aj為樣品中 無水楊酸溶液的吸光值。
[0061] 從附圖4種的結果可以看出，羥自由自由基(0H-)生成的能力被TM-1明顯抑制，呈 劑量效應且其清除活性比谷胱甘肽強。
[0062] 3.超氧自由基(02- ·)清除率的測定方法
[0063]超氧自由基(〇2_ ·)清除率的測定方法參照Markulund的方法。在堿性條件下(pH =8.34)鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應生成02 ·-和有色中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在322nm處 有一特征吸收峰，當加入〇2 ·-清除劑時〇2 ·-的生成受到抑制，鄰苯三酚自氧化過程受阻， 溶液在325nm處吸收減弱。故通過測定A325值可以推斷清除劑對〇2 ·-的清除作用。簡單地 說，2.25ml磷酸鹽緩沖溶液(50mM，pH值8.3)與1.6ml超純水或樣品（TM-1和谷胱甘肽)混合。 該混合物于25°C放置20分鐘后，加入0.15ml新鮮制備的0.2mM鄰苯三酚溶液(溶解于0.01M 鹽酸溶液）。在325nm處，計算線性范圍內(nèi)鄰苯三酸自氧化反應增加的吸光度。每隔30s記錄 反應啟動后的A325值，測定3分鐘。TM-1對超氧陰離子自由基的清除活性，計算公式如下：
[0064] 清除率=(1-Δ As/Δ Ac) X 100%
[0065] Δ As，樣品溶液線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值；Δ Ac，空白溶液線性范圍內(nèi)每 分鐘吸光度的增加值。
[0066]附圖5的結果表明，超氧陰離子自由基(02_·)生成的能力被TM-1明顯抑制，呈劑 量效應且其清除活性比谷胱甘肽強。
[0067]實施例3、黃粉蟲天然抗氧化八肽作為飼料添加劑使用 [0068] 1、產(chǎn)品組分及使用
[0069] 400只1日齡白羽肉雞分別稱重，依據(jù)體質(zhì)量將肉雞分為4組，每組100只。1組為對 照組，2組為10mM/Kg黃粉蟲天然抗氧化八肽組，3組為50mM/Kg黃粉蟲天然抗氧化八肽組，4 組為250mM/Kg黃粉蟲天然抗氧化八肽組，飲水使用，實驗周期為42d。分析黃粉蟲天然抗氧 化八肽對雞免疫及抗氧化能力的影響。通過該試驗發(fā)現(xiàn)天然抗氧化八肽能夠顯著提高小鼠 抗體水平，并且具有調(diào)節(jié)細胞免疫反應的功能。
[0070] 2、免疫器官指數(shù)測定
[0071] 飼養(yǎng)試驗結束后，每組隨機抽取15只共計抽取40只雞進行指標測定。稱取活質(zhì)量 后，頸動脈放血致死解剖觀察各臟器變化;采集解剖雞只的胸腺、脾和法氏囊，沖淋去血污， 在濾紙上吸去多余水份，修剪組織周圍脂肪，稱質(zhì)量獲得各免疫器官的質(zhì)量，根據(jù)活質(zhì)量計 算免疫器官指數(shù)。
[0072]免疫器官指數(shù)/(mg/g)=免疫器官質(zhì)量/活質(zhì)量
[0073] 結果表明，黃粉蟲天然抗氧化八肽能夠顯著提高雞體的肉雞免疫器官指數(shù)表(表 1)〇
[0074] 表1黃粉蟲天然抗氧化八肽飼料添加劑對肉雞免疫器官指數(shù)的影響
[0075]
[0076] 注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P〈0.05)
[0077] 3、抗氧化能力的測定
[0078]收集中抽取雞只的頸動脈血清，以南京建成生化檢測試劑盒測定血清中總抗氧化 能力(T 一 A0C)總超氧化物歧化酶(T 一 S0D)和還原型谷胱甘肽(GSH)的水平測定方法參照試 劑盒說明書操作。
[0079]結果表明：黃粉蟲天然抗氧化八肽能夠顯著提高雞體的抗氧化水平(表2)。
[0080] 表2黃粉蟲天然抗氧化八肽飼料添加劑對肉雞血清抗氧化能力的影響
[0081]
[0082]注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P〈0.05)
[0083] 所有上述的首要實施這一知識產(chǎn)權，并沒有設定限制其他形式的實施這種新產(chǎn)品 和/或新方法。本領域技術人員將利用這一重要信息，上述內(nèi)容修改，以實現(xiàn)類似的執(zhí)行情 況。但是，所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權利。
[0084] 9
【主權項】
1. 一種黃粉蟲天然抗氧化八肽，其特征在于，所述的八肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:1 或在所述序列中取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，由此衍生獲得的具有相同抗氧化功 能的多肽。2. 如權利要求1所述的黃粉蟲天然抗氧化八肽的分離鑒定方法，其具體步驟為： (1) 樣品處理，稱取l〇〇g黃粉蟲幼蟲超聲處理后，經(jīng)液氮反復凍融、碾碎混勻，獲得黃粉 蟲勻漿樣品； (2) 蛋白抽提，在步驟（1)獲得的黃粉蟲勻漿樣品中加入50ml蛋白抽提液，置于4°C過夜 處理，充分抽提后，將所獲得的樣品經(jīng)離心4°C，12000g，60min處理后取上清備用； (3) 去除雜蛋白等大分子物質(zhì)，將步驟（2)中獲得的上清置于80°C水浴中充分反應lh 后，再次離心，4°C，12000g，60min，分為三層，上層為多脂層，中層為小分子多肽層，下層為 雜蛋白層，取中間上清液； (4) 將步驟(3)中獲得的上清液通過lOOODa超濾膜進行超濾處理，超濾獲得的樣品進行 真空凍干操作； (5) 將步驟（4)真空凍干處理獲得的粉末用0.01M PH7.2PBS溶液稀釋，12000g離心 lOmin，然后將獲得的上清液通過0.22um濾膜過濾； (6) 將步驟(5)中過濾處理后的樣品經(jīng)分子篩（Sephadex G-50)純化分析，收獲活性峰 I，并真空凍干處理； (7) B液（2%乙腈，0.065%三氟乙酸)稀釋真空凍干的樣品，12000g離心10min，然后用 0 · 22μηι濾膜過濾； (8) 高效液相純化分析取濾液經(jīng)反向，收獲滯留時間的活性峰，其中使用的Α液為100 % 乙腈，B液為2%乙腈加0.065%三氟乙酸； (9) 收獲的洗脫液經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，氨基酸序列為SEQ ID N0:1IIVCPYDK。3. 如權利要求2所述的黃粉蟲天然抗氧化八肽的分離鑒定方法，其中步驟(2)中所述蛋 白抽提液為：HEPES溶液，PH7 · 0，50mM;添加 b-ME，1 OmM; EDTA，ImM; Na3V04，1 · OmM; NaF，50mM; ?]^?，1111]\1;匕6112&1111(1；[116,2111]\1;蛋白酉每抑制齊[|16即6卩1：；[11、卩6卩8七&；[11八和卩1'〇1：；[11；[11，111^/1111。4. 如權利要求1所述的的黃粉蟲天然抗氧化八肽的應用，將上述天然抗氧化八肽制品 用作飼料添加劑。
【文檔編號】A23K20/147GK106084007SQ201610489623
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月26日
【發(fā)明人】劉曉東, 王為棟, 張福波, 葛珍珍, 單虎, 王述柏, 秦志華
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學