一種精品肝素鈉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種精品肝素鈉的制備方法，屬于肝素鈉制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將膨脹珍珠巖負(fù)載復(fù)合酶得到自制酶制劑，用其預(yù)處理粗品肝素鈉，再經(jīng)過氧化氫一次氧化即可制得精品肝素鈉。實(shí)例證明，本發(fā)明方法獨(dú)特新穎，不僅避免了傳統(tǒng)精制方法中副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從最大程度降低了產(chǎn)品活性損失，且簡(jiǎn)化了精制步驟，有效提高了精品肝素鈉的效價(jià)和效價(jià)回收率，使得效價(jià)可達(dá)160～170u/mg，回收率達(dá)到98％以上。
【專利說明】
一種精品肝素鈉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種精品肝素鈉的制備方法，屬于肝素鈉制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉(HeparinSodium)是粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。肝素鈉是由豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類物質(zhì)。在體內(nèi)外均具有抗凝血作用，是目前主流的抗凝血藥品。但是普通肝素鈉的生物利用度低，副作用大，后來人們發(fā)現(xiàn)肝素鈉裂解獲取的硫酸氨基葡聚糖片段的鈉鹽，平均分子量為4000?6000道爾頓，稱為低分子肝素鈉。低分子肝素鈉注射液和肝素鈉注射液一樣屬于抗凝血酶m(ATm)依賴性凝血酶抑制劑。但與肝素鈉注射液相比，具有半衰期較長、抗血栓效果好、出血傾向較弱、給藥方便，但價(jià)格比較貴。而達(dá)肝素為其中一種。達(dá)肝素鈉注射液主要用于急性深靜脈血栓的治療，急性腎功能衰竭或慢性腎功能不全者進(jìn)行血液透析和血液過濾期間防止體外循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)生凝血，不穩(wěn)定型冠心病，如不穩(wěn)定型心絞痛和非Q-波型心肌梗塞，預(yù)防與手術(shù)有關(guān)的血栓形成。是目前主流的抗血栓類藥物。
[0003]肝素的精制過程主要是對(duì)粗品肝素鈉進(jìn)行除蛋白提純和脫色，達(dá)到國家藥典標(biāo)準(zhǔn)要求。在我國肝素的精制多采用高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化法或過氧化氫分次加入的二次氧化法生產(chǎn)工藝；同時(shí)也有資料報(bào)道，采用酶解結(jié)合氧化法精制肝素的記載。但是上述幾種工藝都存在不足;第一種高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化法存在二氧化錳吸食肝素，使肝素活性損失大，回收率低;過濾困難，生產(chǎn)周期長，色澤不好，質(zhì)量差等缺點(diǎn)；第二種過氧化氧分次加入的二次氧化法工藝，因產(chǎn)品色澤較好，目前被普遍采用。但該工藝主要存在二次氧化氫處理對(duì)肝素結(jié)構(gòu)造成破壞，難以得到較高效價(jià)的精品肝素產(chǎn)品的不足。
[0004]目前市面上肝素鈉提取工藝種類繁多，但還是需要一種保證產(chǎn)品活性、色澤的同時(shí)，還可以使得原料生產(chǎn)成本低廉，工藝簡(jiǎn)單的制備肝素鈉的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對(duì)目前常用高錳酸鉀和過氧化氫兩步氧化法或過氧化氫分次加入的二次氧化法生產(chǎn)精品肝素鈉，由此產(chǎn)生的產(chǎn)品活性損失大、色澤差、副產(chǎn)物二氧化錳降低產(chǎn)品收率且效價(jià)低的缺陷，提供了一種將膨脹珍珠巖負(fù)載復(fù)合酶得到自制酶制劑，用其預(yù)處理粗品肝素鈉，再經(jīng)過氧化氫一次氧化即可制得精品肝素鈉。該方法獨(dú)特新穎，不僅避免了傳統(tǒng)精制方法中副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從最大程度降低了產(chǎn)品活性損失，且簡(jiǎn)化了精制步驟，有效提高了精品肝素鈉的效價(jià)和效價(jià)回收率，使得效價(jià)可達(dá)160?170u/mg，回收率達(dá)到98%以上。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)稱取40?50g膨脹珍珠巖分別用濃度為0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氫氧化鈉溶液浸泡3?5h，移入布氏漏斗抽濾洗滌20?30min，得到表面改性的膨脹珍珠巖；
(2)按質(zhì)量比為5:3:1將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者總體積3?5倍的去離子水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入真空濃縮罐，在900?100Pa壓力下濃縮至其原體積的1/2得復(fù)合酶液，按固液比為1:3將上述表面改性的膨脹珍珠巖浸入復(fù)合酶液，放入超聲振蕩儀以200?300W功率振蕩浸漬過夜；
(3)浸漬結(jié)束后過濾分離得到濾渣，用真空凍干機(jī)在-40?-30°C下凍干后即得自制固定化復(fù)合酶制劑；
(4)稱取I?2kg粗品肝素鈉溶于其體積3?5倍質(zhì)量濃度為3%氯化鈉溶液中，攪拌10?20min后過濾去除濾渣得濾液，將得到的濾液裝入陶瓷酶解罐中，再加入濾液總質(zhì)量5?10%上述自制固定化復(fù)合酶制劑，用濃度為0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5?8.5，常溫酶解5?6h后過濾去除濾渣得無蛋白酶解液；
(5)向上述無蛋白酶解液中加入其體積1/10質(zhì)量濃度為30%過氧化氫溶液，在20?25°C下靜置氧化處理1?12h后過濾分離得到氧化液，向氧化液中加入其體積I?2倍的無水乙醇，放入4?6°C的冰水浴中靜置沉淀6?8h，用臥式離心機(jī)以3000?5000r/min轉(zhuǎn)速離心分離后得下層沉淀，真空干燥后即得精品肝素鈉。
[0007]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制得的精品肝素鈉按照醫(yī)學(xué)配制，通過灌封、滅菌、包裝等常規(guī)注射劑制備工藝，制成皮下注射的注射劑，使用時(shí)，注入人體即可，每日早晚一次，成人每次用量為15?20mg，連續(xù)注射3?5天，經(jīng)檢測(cè)，用作抗凝、抗血栓藥物，治療效果顯著，最終測(cè)得抗凝血因子a的值為160?170IU/mg，抗凝血酶值為0.65?0.75IU/mg。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明方法獨(dú)特新穎，避免了傳統(tǒng)精制方法中副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從最大程度降低了產(chǎn)品活性損失，且簡(jiǎn)化了靜置步驟；
(2)本發(fā)明有效提高了精品肝素鈉的效價(jià)和效價(jià)回收率，使得效價(jià)可達(dá)160?170u/mg，回收率達(dá)到98%以上，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0009]首先稱取40?50g膨脹珍珠巖分別用濃度為0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氫氧化鈉溶液浸泡3?5h，移入布氏漏斗抽濾洗滌20?30min，得到表面改性的膨脹珍珠巖;然后按質(zhì)量比為5:3:1將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者總體積3?5倍的去離子水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入真空濃縮罐，在900?100Pa壓力下濃縮至其原體積的1/2得復(fù)合酶液，按固液比為1:3將上述表面改性的膨脹珍珠巖浸入復(fù)合酶液，放入超聲振蕩儀以200?300W功率振蕩浸漬過夜;浸漬結(jié)束后過濾分離得到濾渣，用真空凍干機(jī)在-40?-30°C下凍干后即得自制固定化復(fù)合酶制劑;接下來稱取I?2kg粗品肝素鈉溶于其體積3?5倍質(zhì)量濃度為3%氯化鈉溶液中，攪拌10?20min后過濾去除濾渣得濾液，將得到的濾液裝入陶瓷酶解罐中，再加入濾液總質(zhì)量5?10%上述自制固定化復(fù)合酶制劑，用濃度為0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7.5?8.5，常溫酶解5?6h后過濾去除濾渣得無蛋白酶解液;最后向上述無蛋白酶解液中加入其體積1/10質(zhì)量濃度為30%過氧化氫溶液，在20?25°C下靜置氧化處理10?12h后過濾分離得到氧化液，向氧化液中加入其體積I?2倍的無水乙醇，放入4?6 °C的冰水浴中靜置沉淀6?8h，用臥式離心機(jī)以3000?5000r/min轉(zhuǎn)速離心分離后得下層沉淀，真空干燥后即得精品肝素鈉。
[0010]實(shí)例I 首先稱取40g膨脹珍珠巖分別用濃度為0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氫氧化鈉溶液浸泡3h，移入布氏漏斗抽濾洗滌20min，得到表面改性的膨脹珍珠巖;然后按質(zhì)量比為5:3:1將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者總體積3倍的去離子水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入真空濃縮罐，在900Pa壓力下濃縮至其原體積的1/2得復(fù)合酶液，按固液比為1:3將上述表面改性的膨脹珍珠巖浸入復(fù)合酶液，放入超聲振蕩儀以200W功率振蕩浸漬過夜;浸漬結(jié)束后過濾分離得到濾渣，用真空凍干機(jī)在-40°C下凍干后即得自制固定化復(fù)合酶制劑;接下來稱取Ikg粗品肝素鈉溶于其體積3倍質(zhì)量濃度為3%氯化鈉溶液中，攪拌1min后過濾去除濾渣得濾液，將得到的濾液裝入陶瓷酶解罐中，再加入濾液總質(zhì)量5%上述自制固定化復(fù)合酶制劑，用濃度為0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，常溫酶解5h后過濾去除濾渣得無蛋白酶解液;最后向上述無蛋白酶解液中加入其體積1/10質(zhì)量濃度為30%過氧化氫溶液，在20°C下靜置氧化處理1h后過濾分離得到氧化液，向氧化液中加入其體積I倍的無水乙醇，放入40C的冰水浴中靜置沉淀6h，用臥式離心機(jī)以3000r/min轉(zhuǎn)速離心分離后得下層沉淀，真空干燥后即得精品肝素鈉。
[0011]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，將本發(fā)明制得的精品肝素鈉按照醫(yī)學(xué)配制，通過灌封、滅菌、包裝等常規(guī)注射劑制備工藝，制成皮下注射的注射劑，使用時(shí)，注入人體即可，每日早晚一次，成人每次用量為15mg，連續(xù)注射3天，經(jīng)檢測(cè)，用作為抗凝、抗血栓藥物，治療效果顯著，最終測(cè)得抗凝血因子a的值為160 IU/mg，抗凝血酶值為0.65 IU/mg。
[0012]實(shí)例2
首先稱取45g膨脹珍珠巖分別用濃度為0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氫氧化鈉溶液浸泡4h，移入布氏漏斗抽濾洗滌25min，得到表面改性的膨脹珍珠巖;然后按質(zhì)量比為5:3:1將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者總體積4倍的去離子水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入真空濃縮罐，在950Pa壓力下濃縮至其原體積的1/2得復(fù)合酶液，按固液比為1:3將上述表面改性的膨脹珍珠巖浸入復(fù)合酶液，放入超聲振蕩儀以250W功率振蕩浸漬過夜;浸漬結(jié)束后過濾分離得到濾渣，用真空凍干機(jī)在_35°C下凍干后即得自制固定化復(fù)合酶制劑;接下來稱取1.5kg粗品肝素鈉溶于其體積4倍質(zhì)量濃度為3%氯化鈉溶液中，攪拌15min后過濾去除濾渣得濾液，將得到的濾液裝入陶瓷酶解罐中，再加入濾液總質(zhì)量8%上述自制固定化復(fù)合酶制劑，用濃度為0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，常溫酶解5.5h后過濾去除濾渣得無蛋白酶解液;最后向上述無蛋白酶解液中加入其體積1/10質(zhì)量濃度為30%過氧化氫溶液，在23°C下靜置氧化處理I Ih后過濾分離得到氧化液，向氧化液中加入其體積1.5倍的無水乙醇，放入5°C的冰水浴中靜置沉淀7h，用臥式離心機(jī)以4000r/min轉(zhuǎn)速離心分離后得下層沉淀，真空干燥后即得精品肝素鈉。
[0013]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，將本發(fā)明制得的精品肝素鈉按照醫(yī)學(xué)配制，通過灌封、滅菌、包裝等常規(guī)注射劑制備工藝，制成皮下注射的注射劑，使用時(shí)，注入人體即可，每日早晚一次，成人每次用量為18mg，連續(xù)注射4天，經(jīng)檢測(cè)，用作為抗凝、抗血栓藥物，治療效果顯著，最終測(cè)得抗凝血因子a的值為165IU/mg，抗凝血酶值為0.7 IU/mg 0
[0014]實(shí)例3
首先稱取50g膨脹珍珠巖分別用濃度為0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氫氧化鈉溶液浸泡5h，移入布氏漏斗抽濾洗滌30min，得到表面改性的膨脹珍珠巖;然后按質(zhì)量比為5:3:1將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者總體積5倍的去離子水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入真空濃縮罐，在100Pa壓力下濃縮至其原體積的1/2得復(fù)合酶液，按固液比為1:3將上述表面改性的膨脹珍珠巖浸入復(fù)合酶液，放入超聲振蕩儀以300W功率振蕩浸漬過夜;浸漬結(jié)束后過濾分離得到濾渣，用真空凍干機(jī)在-30°C下凍干后即得自制固定化復(fù)合酶制劑;接下來稱取2kg粗品肝素鈉溶于其體積5倍質(zhì)量濃度為3%氯化鈉溶液中，攪拌20min后過濾去除濾渣得濾液，將得到的濾液裝入陶瓷酶解罐中，再加入濾液總質(zhì)量10%上述自制固定化復(fù)合酶制劑，用濃度為0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，常溫酶解6h后過濾去除濾渣得無蛋白酶解液;最后向上述無蛋白酶解液中加入其體積1/10質(zhì)量濃度為30%過氧化氫溶液，在25 0C下靜置氧化處理12h后過濾分離得到氧化液，向氧化液中加入其體積2倍的無水乙醇，放入60C的冰水浴中靜置沉淀Sh，用臥式離心機(jī)以5000r/min轉(zhuǎn)速離心分離后得下層沉淀，真空干燥后即得精品肝素鈉。
[0015]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，將本發(fā)明制得的精品肝素鈉按照醫(yī)學(xué)配制，通過灌封、滅菌、包裝等常規(guī)注射劑制備工藝，制成皮下注射的注射劑，使用時(shí)，注入人體即可，每日早晚一次，成人每次用量為20mg，連續(xù)注射5天，經(jīng)檢測(cè)，用作為抗凝、抗血栓藥物，治療效果顯著，最終測(cè)得抗凝血因子a的值為170IU/mg，抗凝血酶值為0.75 IU/mg 0
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種精品肝素鈉的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)稱取40?50g膨脹珍珠巖分別用濃度為0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氫氧化鈉溶液浸泡3?5h，移入布氏漏斗抽濾洗滌20?30min，得到表面改性的膨脹珍珠巖； (2)按質(zhì)量比為5:3:1將胰蛋白酶、堿性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者總體積3?5倍的去離子水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)入真空濃縮罐，在900?100Pa壓力下濃縮至其原體積的1/2得復(fù)合酶液，按固液比為1:3將上述表面改性的膨脹珍珠巖浸入復(fù)合酶液，放入超聲振蕩儀以200?300W功率振蕩浸漬過夜； (3)浸漬結(jié)束后過濾分離得到濾渣，用真空凍干機(jī)在-40?-30°C下凍干后即得自制固定化復(fù)合酶制劑； (4)稱取I?2kg粗品肝素鈉溶于其體積3?5倍質(zhì)量濃度為3%氯化鈉溶液中，攪拌10?20min后過濾去除濾渣得濾液，將得到的濾液裝入陶瓷酶解罐中，再加入濾液總質(zhì)量5?10%上述自制固定化復(fù)合酶制劑，用濃度為0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5?8.5，常溫酶解5?6h后過濾去除濾渣得無蛋白酶解液； (5 )向上述無蛋白酶解液中加入其體積I /10質(zhì)量濃度為30%過氧化氫溶液，在20?25 °C下靜置氧化處理1?12h后過濾分離得到氧化液，向氧化液中加入其體積I?2倍的無水乙醇，放入4?6°C的冰水浴中靜置沉淀6?8h，用臥式離心機(jī)以3000?5000r/min轉(zhuǎn)速離心分離后得下層沉淀，真空干燥后即得精品肝素鈉。
【文檔編號(hào)】A61K31/727GK106084090SQ201610501525
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】郭舒洋, 張明, 林茂平
【申請(qǐng)人】郭舒洋