一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法
【專利摘要】一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法，以Y2O3、Yb2O3和Tm2O3為原料，制備上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，進(jìn)行硅烷化修飾后，用親和素進(jìn)一步修飾，制備親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，將生物素修飾的恩諾沙星適配體連接于親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面，制備恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料；最后均勻分散于致孔劑中，加入功能單體，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，制得恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針。優(yōu)點(diǎn)是：該探針具有分子印跡聚合物和適配體協(xié)同增效的雙重識(shí)別保障，識(shí)別能力更加高效、精準(zhǔn)；不但可以用于目標(biāo)物恩諾沙星的特異性識(shí)別和富集，還可以用于定量測(cè)定。
【專利說(shuō)明】
一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化 型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 恩諾沙星，是氟喹諾酮類抑菌劑中應(yīng)用最為廣泛的品種之一，常被用于獸醫(yī)臨床 和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。但因其耐藥性和潛在的致癌性引起了廣泛的關(guān)注。目前恩諾沙星的檢測(cè) 方法主要是儀器法和酶聯(lián)免疫法，然而儀器法所需儀器昂貴，操作復(fù)雜，酶聯(lián)免疫法需要抗 體，抗體穩(wěn)定性差，制備周期長(zhǎng)。這兩種方法都存在一定的問(wèn)題。
[0003] 適配體(Aptamer)是通過(guò)SELEX技術(shù)篩選得到的一段可以特異性識(shí)別并結(jié)合革巴分 子的寡聚核苷酸片段(DNA或RNA)。適配體能夠與靶標(biāo)分子發(fā)生特異性結(jié)合，且親和力高、特 異性強(qiáng)。與抗體相比，適配體篩選無(wú)需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)需要進(jìn)行全化學(xué)合成;篩選周期短， 有效避免抗體存在批次差異大的問(wèn)題，可實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn);適配體末端易于修飾上各種活性 基團(tuán)，可根據(jù)不同分析目的對(duì)其進(jìn)行固定修飾。這些優(yōu)點(diǎn)使其在分析檢測(cè)和傳感領(lǐng)域中顯 示出良好的應(yīng)用前景。
[0004] 分子印跡技術(shù)是模擬天然分子識(shí)別現(xiàn)象，人工合成對(duì)特定印跡分子具有高度選擇 性固態(tài)高分子聚合物的新技術(shù)。因其具有選擇性高、穩(wěn)定性好、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、可重復(fù)使用 等優(yōu)點(diǎn)，常常被譽(yù)為"仿生抗體"，表現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。
[0005] 熒光檢測(cè)是一種常用的快速檢測(cè)方法。作為新型發(fā)光材料的上轉(zhuǎn)換納米粒子 (UCNPs)發(fā)展迅速。UCNPs具有獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì)，以近紅外光作為激發(fā)光源，可有效避免樣品 基質(zhì)自發(fā)熒光的干擾，熒光背景信號(hào)干擾小。該材料還具有化學(xué)穩(wěn)定性好、熒光壽命長(zhǎng)、吸 收和發(fā)射帶窄、量子產(chǎn)率高以及毒性低等諸多優(yōu)點(diǎn)，是理想的熒光探針標(biāo)記物。
[0006] 本發(fā)明以上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子標(biāo)記，將分子印跡聚合物與適配體的高特異性結(jié) 合，制備一種可應(yīng)用于恩諾沙星識(shí)別與測(cè)定的適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提出一種對(duì)恩諾沙星同時(shí)具有富集和上轉(zhuǎn)換光信號(hào)傳感 復(fù)合材料的適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案： 一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法，采用上轉(zhuǎn)換熒光 納米材料作為載體偶聯(lián)恩諾沙星適配體，以甲基丙烯酸為功能單體，利用分子印跡技術(shù)中 的包埋法制備，其制備步驟如下： 一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法，制備步驟如下： (1)將Y2〇3、Yb2〇3和Tm2〇3硝酸化后，加入EDTA、CTAB的乙二醇溶液、HF和濃硝酸，進(jìn)行水 熱反應(yīng)，制得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm; (2) 將步驟(1)制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料0.05g-0.2g分散于60mL-100mL異丙醇中；依次加 入20mL-40mL的蒸餾水和2.5mL-5mL質(zhì)量濃度為25 %的氨水，室溫下攪拌15min-30min;滴加 40yL-80yL的正硅酸乙酯（TEOS)，攪拌3h后；滴加200yL-400yL的3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)，室溫下反應(yīng)lh-2h后停止攪拌，室溫下陳化2h-6h;離心分離，得到的固體物質(zhì)經(jīng)蒸 餾水洗滌三次，60°C _90°C烘干，得到硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (3) 將步驟（2)制得的硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg，分散于5mL-8mL濃度為 10mm〇l/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入1.25mL質(zhì)量濃度為25%戊二醛溶液，在室溫下振蕩 lh-2h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L的PBS洗三次，重新分散于5mL-8mL濃度為 10mm 〇l/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入lmL濃度為0 · lmg/mL-0 · 2mg/mL的親和素溶液中，在 37 °C振蕩17h-30h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L的PBS洗三次，得到親和素修飾的 上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (4) 將步驟(3)制備的親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg均勾分散于10mmol/L的 PBS中，加入200yL-300yU^度為lymol/L的恩諾沙星適配體溶液，在37°C振蕩17h-30h，離心 分離，得到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L的PBS洗三次，得到恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材 料； (5) 將步驟（4)制備的恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg分散于 10mmol/L的PBS中，加入lmL濃度為10yg/mL-30yg/mL恩諾沙星溶液，在37°C振蕩lh_2h，離心 分離，收集固體物質(zhì)； (6) 將步驟（5)得到的固體物質(zhì)均勻分散于致孔劑中，加入功能單體，振蕩15min-30min，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，所述固體物質(zhì)的質(zhì)量與致孔劑的體積之比為1 Omg: 5mL-l OmL， 固體物質(zhì)的質(zhì)量與功能單體的摩爾比101^:0.21111]1〇1-0.61]11]1〇1，固體物質(zhì)質(zhì)量與交聯(lián)劑的摩 爾比10mg: 10mmol-20mmol，固體物質(zhì)與引發(fā)劑的質(zhì)量比為10mg:0·01g-〇 .08g;在60°C-80°C 水浴振蕩器反應(yīng)12h-24h，水浴振蕩器的振蕩速度為150轉(zhuǎn)/分-300轉(zhuǎn)/分，將產(chǎn)物置于甲醇 中反復(fù)洗脫5次-10次，再用解離緩沖液反復(fù)洗脫5次-10次，制得恩諾沙星適配體/分子印跡 雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針。
[0009] 進(jìn)一步的，所述致孔劑為乙腈，功能單體為甲基丙烯酸，交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三 甲基丙烯酸酯，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
[0010] 進(jìn)一步的，所述適配體核酸序列為5'-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3'。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟（1)制備上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm時(shí)，將Y2〇3、Yb2〇3、Tm 2〇3按照 摩爾比0.78:0.2:0.02加入濃硝酸中，所述Y2〇 3與濃硝酸的摩爾體積比為0.78mol: 0.5mL-2!^，60°〇90°(：溶解后，揮發(fā)掉多余硝酸，加入蒸餾水，所述￥203與蒸餾水的摩爾體積比為 0.78mol:0.5mL-2mL，攪拌至全部溶解后按照EDTA與Y 2〇3氧化釔的摩爾比1:1加入EDTA，用濃 度為lmol/L_6mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7-8;加入濃度為0· 016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，Υ2Ο3 與CTAB的摩爾體積比為0.78mol: 25mL，100r/min-300r/min轉(zhuǎn)速下按照Y2O3氧化紀(jì)與HF的摩 爾體積比0.78mol: 1.5mL邊攪拌邊加入HF，得到白色乳狀液體;最后再按照Y2〇3與濃硝酸的 摩爾體積比0.78mol: 3.5mL加入濃硝酸，攪拌均勻后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中， 然后將水熱反應(yīng)釜擰緊后置于170°C-200°C條件下水熱反應(yīng)18h-24h。
[0012] 進(jìn)一步的，所述解離緩沖液是由 10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1， 20mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2組成。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料為載體，在其表面構(gòu)建對(duì)恩諾沙星具有高度選擇性的分子印跡聚合 物/適配體雜化表層，構(gòu)建熒光探針。其中適配體的固定是雜化探針成功制備的關(guān)鍵，首先 對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料進(jìn)行硅烷化修飾，以提高其生物親和性;然后用親和素對(duì)硅烷化的上轉(zhuǎn) 換發(fā)光材料進(jìn)一步修飾;最后利用親和素與生物素之間的特異性反應(yīng)，將生物素修飾的恩 諾沙星適配體連接于親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面，實(shí)現(xiàn)適配體的固定。該探針除了 具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料熒光信號(hào)的高靈敏性和低干擾性外，更重要的是，與傳統(tǒng)探針僅靠分 子印跡聚合物或者適配體的單重識(shí)別效能相比，該探針具有分子印跡聚合物和適配體協(xié)同 增效的雙重識(shí)別保障，識(shí)別能力更加高效、精準(zhǔn)。該探針不但可以用于目標(biāo)物恩諾沙星的特 異性識(shí)別和富集，還可以用于實(shí)際樣品中恩諾沙星的定量測(cè)定。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是不同濃度恩諾沙星對(duì)本發(fā)明的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒 光探針強(qiáng)度的影響圖； 圖2不同濃度恩諾沙星與本發(fā)明的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針 強(qiáng)度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖3是本發(fā)明的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm的透射電鏡圖； 圖4是本發(fā)明的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的透射電鏡圖； 圖5是本發(fā)明的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4:Yb，Tm、硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和恩諾沙星適配 體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的紅外光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 (1) 將0.78mol Y2〇3(氧化紀(jì)）、0.2mol Yb2〇3(氧化鐿）、0.02mol Tm2〇3(氧化鎊）加入 0.5mL濃硝酸中，60°C-70°C溶解后，揮發(fā)掉多余硝酸后，加入0.5mL蒸餾水?dāng)嚢柚寥咳芙?后加入0.78mol EDTA(EDTA與Y2〇3氧化釔的摩爾比為1:1)，用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7;加入 25mL濃度為0.016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，100r/min轉(zhuǎn)速下邊攪拌邊加入1.5mL HF，得到 白色乳狀液體;最后再加入3.5mL濃硝酸，攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，然后將水熱反 應(yīng)釜擰緊后置于200°C條件下水熱反應(yīng)18h，制得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4:Yb，Tm; (2) 將步驟（1)制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料0.05g分散于60mL異丙醇中；依次加入20mL的蒸 餾水和2 · 5mL質(zhì)量濃度為25 %的氨水，室溫下磁力攪拌15min;滴加40yL TE0S，磁力攪拌3h 后；滴加200yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下反應(yīng)lh后停止攪拌，室溫下陳化2h; 離心分離，得到的固體物質(zhì)經(jīng)蒸餾水洗滌三次，60°C烘干得到硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料；（3) 將步驟(2)制得的硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料1 Omg，分散于5mL濃度為lOmmo 1 /L磷酸緩沖鹽溶液 (roS)中，加入1.25mL質(zhì)量濃度為25%戊二醛溶液，在室溫下振蕩lh，離心分離，得到的固體 物質(zhì)用10mm 〇l/L PBS洗三次，重新分散于5mL濃度為10mm〇l/L PBS中，加入lmL濃度為 0. lmg/mL的親和素溶液中，在37°C振蕩17h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用lOmmo 1/L PBS洗 三次，得到親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (4) 將步驟(3)制備的1 Omg均勻分散于1 Ommo 1 /L PBS中，加入200μΙ^度為Ιμπιο 1 /L的恩 諾沙星適配體溶液，適配體核酸序列為5'-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGTTCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA -biotin-3'），在37°C振蕩 17h，離心分離，得 到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L PBS洗三次，得到恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (5) 將步驟(4)制備的恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料1 Omg分散于1 Ommo 1 /L PBS中，加入lmL濃度為10yg/mL恩諾沙星溶液，在37°C振蕩lh，離心分離，將得到的固體物 質(zhì)； (6) 將步驟(5)的固體物質(zhì)1 Omg均勾分散于1 OmL致孔劑乙腈中，加入0.6mmo 1功能單體 甲基丙烯酸，振蕩30min，加入20mmol交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和0.08g引發(fā)劑 偶氮二異丁腈，80°C水浴振蕩器反應(yīng)24h，水浴振蕩器的振蕩速度為300轉(zhuǎn)/分，將產(chǎn)物置于 甲醇中反復(fù)洗脫10次，再用解離緩沖液（l〇mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1， 20mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCh)反復(fù)洗脫10次，制得恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上 轉(zhuǎn)換熒光探針。
[0016] 實(shí)施例2 (1) 將0.78mol Y2〇3(氧化?乙）、0.2mol Yb2〇3(氧化鐿）、0.02mol Tm2〇3(氧化鎊)加入2mL 濃硝酸中，70°C-80°C溶解后，揮發(fā)掉多余硝酸后，加入2mL蒸餾水，攪拌至全部溶解后加入 0 · 78mol EDTA，用6mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8;加入25mL濃度為0 · 016g/mL的CTAB的乙二醇溶 液，300r/min轉(zhuǎn)速下邊攪拌邊加入1.5mL HF，得到白色乳狀液體;最后再加入3.5mL濃硝酸， 攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，然后將水熱反應(yīng)釜擰緊后置于170°C條件下水熱反應(yīng) 24h，制得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm; (2) 將步驟（1)制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料0.2g分散于100mL異丙醇中；依次加入40mL的蒸 餾水和5mL質(zhì)量濃度為25%的氨水，室溫下磁力攪拌30min;滴加80yL TE0S，磁力攪拌3h后； 滴加400yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下反應(yīng)2h后停止攪拌，室溫下陳化6h;離 心分離，得到的固體物質(zhì)經(jīng)蒸餾水洗滌三次，90°C烘干得到硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (3) 將步驟(2)制得的硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料50mg，分散于8mL濃度為lOmmo 1/L磷酸緩 沖鹽溶液(PBS)中，加入1.25mL質(zhì)量濃度為25%戊二醛溶液，在室溫下振蕩2h，離心分離，得 到的固體物質(zhì)用10mm 〇l/L PBS洗三次，重新分散于8mL 10mm〇l/L PBS中，加入lmL濃度為 0.2mg/mL的親和素溶液中，在37°C振蕩30h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用lOmmo 1/L PBS洗 三次，得到親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (4) 將步驟(3)制備的50mg均勻分散于10mmol/L PBS中，加入300μΙ^度為lymol/L的恩 諾沙星適配體溶液，適配體核酸序列為5'-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3'），在37°C振蕩30h，離心分離，得 到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L PBS洗三次，得到恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (5) 將步驟（4)制備的恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料5 0 m g分散于10 mm ο 1 / L PBS中，加入lmL濃度為30yg/mL恩諾沙星溶液，在37°C振蕩2h，離心分離，收集固體物質(zhì)；（6) 將步驟(5)的固體物質(zhì)1 Omg均勾分散于8mL致孔劑乙腈中，加入0.4mmo 1功能單體甲基丙稀 酸，振蕩20min，加入15mmol交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和0.05g引發(fā)劑偶氮二異 丁腈，70°C水浴振蕩器反應(yīng)18h，水浴振蕩器的振蕩速度為200轉(zhuǎn)/分，將產(chǎn)物置于甲醇中反 復(fù)洗脫8次，再用解離緩沖液（10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)反復(fù)洗脫8次，制得恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探 針。
[0017] 實(shí)施例3 (1) 將0.78mol Y2〇3(氧化?乙）、0.2mol Yb2〇3(氧化鐿）、0.02mol Tm2〇3(氧化鎊)加入lmL 濃硝酸中，80°C-90°C溶解后，揮發(fā)掉多余硝酸后，加入lmL蒸餾水，攪拌至全部溶解后加入 0.78mol EDTA，用3mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3;加入25mL濃度為0.016g/mL的CTAB的乙二醇 溶液，200r/min轉(zhuǎn)速下邊攪拌邊加入1.5mL HF，得到白色乳狀液體;最后再加入3.5mL濃硝 酸，攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，然后將水熱反應(yīng)釜擰緊后置于180°C條件下水熱反 應(yīng)20h，制得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm; (2) 將步驟(1)制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料O.lg分散于80mL異丙醇中；依次加入30mL的蒸餾 水和3mL質(zhì)量濃度為25 %的氨水，室溫下磁力攪拌20min;滴加60yL TE0S，磁力攪拌3h后;滴 加300yL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下反應(yīng)1.5h后停止攪拌，室溫下陳化4h;離 心分離，得到的固體物質(zhì)經(jīng)蒸餾水洗滌三次，80°C烘干得到硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (3) 將步驟(2)制得的硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料30mg，分散于6mL lOmmo 1/L磷酸緩沖鹽溶 液(PBS)中，加入1.25mL質(zhì)量濃度為25 %戊二醛溶液，在室溫下振蕩1.5h，離心分離，得到的 固體物質(zhì)用l〇mmol/L PBS洗三次，重新分散于6mL 10mmol/L PBS中，加入lmL濃度為 0.15mg/mL的親和素溶液中，在37°C振蕩25h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mm 〇l/L PBS洗 三次，得到親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (4) 將步驟(3)制備的30mg均勻分散于1 Ommo 1 /L PBS中，加入240μΙ^度為Ιμπιο 1 /L的恩 諾沙星適配體溶液，適配體核酸序列為5'-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3'），在37°C振蕩22h，離心分離，得 到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L PBS洗三次，得到恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (5) 將步驟（4)制備的恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料3 0 m g分散于10 mm ο 1 / L PBS中，加入lmL濃度為20yg/mL恩諾沙星溶液，在37°C振蕩1.5h，離心分離，收集固體物質(zhì)； (6)將步驟(5)的固體物質(zhì)1 Omg均勾分散于5mL致孔劑乙腈中，加入0.2mmo 1功能單體甲基丙 烯酸，振蕩15min，加入lOmmol交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和O.Olg引發(fā)劑偶氮二 異丁腈，60°C水浴振蕩器反應(yīng)12h，水浴振蕩器的振蕩速度為150轉(zhuǎn)/分，將得到的產(chǎn)物置于 甲醇中反復(fù)洗脫5次，再用解離緩沖液（10mmol/L HEPES，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1， 20mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCh)反復(fù)洗脫5次，制得恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上 轉(zhuǎn)換熒光探針。
[0018] 恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針（以下簡(jiǎn)稱探針)對(duì)恩諾沙星的 檢測(cè)數(shù)據(jù)： 圖1是在0.0 lg探針中分別加入5mL濃度為0、0.5、1、3、5、7、10ng/mL的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶 液。由圖1可知，隨著探針溶液中恩諾沙星濃度的不斷增大，探針的熒光強(qiáng)度不斷下降。
[0019] 圖2是在0.01 g探針中分別加入5mL濃度為0、0.5、1、3、5、7、10ng/mL的恩諾沙星標(biāo) 準(zhǔn)溶液。以恩諾沙星的濃度為橫坐標(biāo)，以探針在不同濃度恩諾沙星中熒光強(qiáng)度的變化為縱 坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.5ng/mL-10ng/mL，方程為y = 46.016x+145.38，相關(guān)系數(shù) R2為0.9901。
[0020]圖3為上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的透射電鏡，由圖可知粒徑約為50nm。圖4為恩諾沙星適配 體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的透射電鏡圖，由圖可知適配體/分子印跡雜化聚合物 被成功的包被于上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面，包被厚度約為20nm。
[0021]分別對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和恩諾沙星適配體/分子印跡雜 化型上轉(zhuǎn)換熒光探針三種材料進(jìn)行紅外光譜掃描，如圖5所示，上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的圖譜中可 以看出，165401^11(1 3421CHT1分別為氨基的彎曲和伸縮振動(dòng)峰。從硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料 圖譜看出，在798CHT 1和1095CHT1處出現(xiàn)了新的伸縮振動(dòng)峰，分別為Si-Ο和Si-0-Si，證明上 轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面被成功的進(jìn)行了硅烷化修飾，增加了上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的生物親和性，為 下一步熒光探針的合成奠定了基礎(chǔ)。從恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針 圖譜看出，在1172cm- 1,1263cm-1和1716cm-1處，出現(xiàn)了新吸收峰，主要是由于C-0和C = 0導(dǎo)致 的，在2993CHT1也出現(xiàn)了C-H振動(dòng)峰，這些結(jié)果證明功能單體甲基丙烯酸和交聯(lián)劑三羥甲基 丙烷三甲基丙烯酸酯被成功的聚合在了修飾后的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料表面，形成了恩諾沙星適 配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針。
[0022]實(shí)際樣品測(cè)定：選取鱸魚、鯰魚、鲅魚三種市場(chǎng)上常見(jiàn)魚類作為樣品，參考國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)方法農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-2-2006進(jìn)行樣品前處理，得到待測(cè)樣品溶液5mL，在待測(cè)溶液中加 入本發(fā)明實(shí)施例3的探針O.Olg，進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果如表1所示，三個(gè)加標(biāo)水平下 的回收率范圍為87.05%-96.24%，RSD值為1.19%-4.68%，均低于5%，說(shuō)明該探針可用于 實(shí)際水產(chǎn)樣品中恩諾沙星的檢測(cè)分析。
[0023]表1實(shí)際樣品分析(n = 3)

[0024]以上僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、 等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方法，其特征是:制備 步驟如下： (1) 將Y2〇3、Yb2〇3和Tm2〇3硝酸化后，加入EDTA、CTAB的乙二醇溶液、HF和濃硝酸，進(jìn)行水 熱反應(yīng)，制得上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm; (2) 將步驟（1)制備的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料0.05g-0.2g分散于60mL-100mL異丙醇中；依次加 入20mL-40mL的蒸餾水和2.5mL-5mL質(zhì)量濃度為25 %的氨水，室溫下攪拌15min-30min;滴加 40yL-80yL的正硅酸乙酯（TEOS)，攪拌3h后；滴加200yL-400yL的3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)，室溫下反應(yīng)lh-2h后停止攪拌，室溫下陳化2h-6h;離心分離，得到的固體物質(zhì)經(jīng)蒸 餾水洗滌三次，60°C _90°C烘干，得到硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (3) 將步驟（2)制得的硅烷化上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg，分散于5mL-8mL濃度為 10mm〇l/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入1.25mL質(zhì)量濃度為25%戊二醛溶液，在室溫下振蕩 lh-2h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L的PBS洗三次，重新分散于5mL-8mL濃度為 10mm 〇l/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入lmL濃度為0 · lmg/mL-0 · 2mg/mL的親和素溶液中，在 37 °C振蕩17h-30h，離心分離，得到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L的PBS洗三次，得到親和素修飾的 上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料； (4) 將步驟(3)制備的親和素修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10mg-50mg均勾分散于10mmol/L的 PBS中，加入200yL-300yU^度為lymol/L的恩諾沙星適配體溶液，在37°C振蕩17h-30h，離心 分離，得到的固體物質(zhì)用10mm〇l/L的PBS洗三次，得到恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材 料； (5 )將步驟（4)制備的恩諾沙星適配體修飾的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料10 m g - 5 0 m g分散于 lOmmol/L的PBS中，加入lmL濃度為10yg/mL-30yg/mL恩諾沙星溶液，在37°C振蕩lh_2h，離心 分離，收集固體物質(zhì)； (6)將步驟（5)得到的固體物質(zhì)均勻分散于致孔劑中，加入功能單體，振蕩15min-30min，加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，所述固體物質(zhì)的質(zhì)量與致孔劑的體積之比為1 Omg: 5mL-l OmL， 固體物質(zhì)的質(zhì)量與功能單體的摩爾比101^:0.21111]1〇1-0.61]11]1〇1，固體物質(zhì)質(zhì)量與交聯(lián)劑的摩 爾比10mg: 10mmol-20mmol，固體物質(zhì)與引發(fā)劑的質(zhì)量比為10mg:0·01g-〇 .08g;在60°C-80°C 水浴中振蕩反應(yīng)12h-24h，振蕩速度為150轉(zhuǎn)/分-300轉(zhuǎn)/分，將產(chǎn)物置于甲醇中反復(fù)洗脫5 次-10次，再用解離緩沖液反復(fù)洗脫5次-10次，制得恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn) 換熒光探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方 法，其特征是:所述致孔劑為乙腈，功能單體為甲基丙烯酸，交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基 丙烯酸酯，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方 法，其特征是：所述適配體核酸序列為5'_CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-biotin-3'。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方 法，其特征是:步驟（1)制備上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料NaYF4: Yb，Tm時(shí)，將Y2〇3、Yb2〇3、Tm 2〇3按照摩爾比 0.78:0.2:0.02加入濃硝酸中，所述Y2〇3與濃硝酸的摩爾體積比為0.78mol: 0.5mL-2mL，60 °C_90°C溶解后，揮發(fā)掉多余硝酸，加入蒸餾水，所述Y2〇3與蒸餾水的摩爾體積比為0.78mol: 0.5mL-2mL，攪拌至全部溶解后按照EDTA與Y2〇3氧化釔的摩爾比1:1加入EDTA，用濃度為 lmol/L_6mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7-8;加入濃度為0 · 016g/mL的CTAB的乙二醇溶液，Y2O3與 CTAB的摩爾體積比為0.78mol: 25mL，100r/min-300r/min轉(zhuǎn)速下按照Y2O3氧化紀(jì)與HF的摩爾 體積比0.78mol: 1.5mL邊攪拌邊加入HF，得到白色乳狀液體;最后再按照Y2〇3與濃硝酸的摩 爾體積比0.78mol: 3.5mL加入濃硝酸，攪拌均勻后，得到混合物溶液;將混合物溶液轉(zhuǎn)移至 水熱反應(yīng)釜中，然后將水熱反應(yīng)釜擰緊后置于170°C_200°C條件下水熱反應(yīng)18h-24h。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恩諾沙星適配體/分子印跡雜化型上轉(zhuǎn)換熒光探針的制備方 法，其特征是：所述解離緩沖液是由l〇mmol/L HEroS，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1， 20mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2組成。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106084114SQ201610404506
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】劉秀英, 朱力杰, 湯軼偉, 勵(lì)建榮, 高雪, 張德福
【申請(qǐng)人】渤海大學(xué)