快速解除丙酸積累的復合菌及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了提供快速解除丙酸積累的復合菌的制備方法，該方法包括如下步驟：1)以右旋糖酐廢水厭氧消化器出水為原始接種物，以丙酸鈉作為碳源，進行接種培養(yǎng)至培養(yǎng)物中丙酸降解率達到50?80％，甲烷含量為30?50％；2)將步驟1)所得物轉移到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并按每ml步驟1)所得物中的培養(yǎng)液，加入如下細菌：Pelotomaculum schinkii 2.5?5×107個、Pelotomaculum propionicicum1?2.5×107個、Syntrophobacter wolinii 1?3×106個、Methanospirillum hungatei 0.4?1.4×107個、Methanoculleus palmolei 0.5?1.4×107個、Methanoculleus bourgensis 0.5?1.4×107個、Methanosarcina barkeri0.5?2.5×107個、Methanosarcina mazei 1?3×107個；將步驟2)所得物進行密封培養(yǎng)，即得所述快速解除丙酸積累的復合菌。本發(fā)明還提供了上述復合菌在厭氧消化技術中，特別在沼氣發(fā)酵的應用。本發(fā)明所得復合菌能快速高效的解除丙酸的積累，大幅提升厭氧消化的效率和穩(wěn)定性。
【專利說明】
快速解除丙酸積累的復合菌及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領域，具體涉及快速解除丙酸積累的復合菌及其制備方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 厭氧消化技術常用于處理有機廢物(如城市污水、工業(yè)廢水和農業(yè)廢料）。在厭氧 消化技術中，有機酸(丙酸、丁酸和乙酸)積累常常導致有機負荷過高和酸化現象，造成厭氧 消化工藝運行效率低、穩(wěn)定性差，嚴重影響了該技術的廣泛應用。
[0003] 丙酸是有機廢棄物厭氧轉化過程中的一種重要中間產物。丙酸比其它揮發(fā)性脂肪 酸更加難以降解，原因在于丙酸的降解需要更多的能量和更低的氫分壓。這使得丙酸的降 解成為影響厭氧消化的效率和穩(wěn)定性至關重要的問題。因此，獲得高效水解丙酸的菌系，快 速解除丙酸積累，對提高厭氧消化運行效率和穩(wěn)定性具有重要的意義。
[0004]然而，目前所知具有丙酸氧化能力的細菌只有為數不多幾類，如Pelotomaculum和 Methanospirillum。然而，現有技術中，對丙酸實現完全水解通常需要三個月以上，即使在 2013年實現了對水解周期的縮短，但對高濃度丙酸卻無法實現很好的水解。
[0005] 因此，亟待尋找能夠快速且高效水解丙酸的菌系。

【發(fā)明內容】

[0006] 針對現有技術的缺點，本發(fā)明的目的之一在于提供快速解除丙酸積累的復合菌的 制備方法，該方法包括如下步驟：
[0007] 1)以右旋糖酐廢水厭氧消化器出水為原始接種物，以丙酸鈉作為碳源，進行接種 培養(yǎng)至培養(yǎng)物中丙酸降解率達到50-80%，甲烷含量為30-50% ;
[0008] 2)將步驟1)所得物轉移到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并按每ml步驟1)所得物中的細胞，加 入如下細菌：
[0009]
[0010] 3)將步驟2)所得物進行密封培養(yǎng)，即得所述快速解除丙酸積累的復合菌。
[0011] 丙酸的厭氧氧化反應是一個吸熱反應（吉布斯自由能AG>0)，不能自發(fā)發(fā)生。但 是，當其與氫營養(yǎng)型的產甲烷菌共培養(yǎng)時，氫營養(yǎng)型產甲烷菌將其產生的氫氣轉化為甲烷， 降低反應體系中的氫分壓，此時AG〈0,丙酸的厭氧氧化過程可以自發(fā)進行，這一過程也可 稱為丙酸的互營氧化。
[0012] 然而，雖然研究人員對上述原理已然知曉，但如何穩(wěn)定而高效的解除丙酸積累，是 一直尚未攻克的難題。
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人經過大量實驗的摸索發(fā)現，當將上述細菌進行互配時，可以顯著 的促進丙酸的積累的解除。如本發(fā)明的一個實施例所示，由本發(fā)明制備方法所得復合菌可 以在啟動后11天內便可完全的水解濃度高達15000m g//L的丙酸鈉。原因可能在于本發(fā)明復 合菌系對包含丁酸和乙酸在內的有機酸均有較好的水解功能，從而維持了厭氧發(fā)酵的正常 運行。但盡管有如此推測，本發(fā)明所得的效果依然令人驚訝。
[0014] 優(yōu)選的，在步驟1)接種時，接種量為1-20 %，培養(yǎng)條件為于25-55°C、pH= 6.0-9.0 下密封培養(yǎng)。
[0015] 本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的生理生化實驗發(fā)現，在上述培養(yǎng)條件下所得的效果較 好。
[0016] 優(yōu)選的，步驟1)中，丙酸鈉的添加量為1000-15000mg/L。
[0017] 優(yōu)選的，步驟1)和步驟2)中所用培養(yǎng)基，按每升培養(yǎng)基計，包括lg NH4Cl，lg酵母 粉，lg胰蛋白胨，〇.5g半胱氨酸鹽酸鹽，50ml大量元素溶液，10ml微量元素溶液，10ml維生素 141，10mg 刃天青；所述大量元素每升包括 6g KH2P〇4，12g NaCl，2g MgCl2.6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸，1.35g FeCl3 · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0. lg ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0 . Olg H3B03,0.024g Na2Mo〇4 · 2H20，lg NaCl，0.12g NiCh · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20。
[0018] 優(yōu)選的，步驟3)中培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為25-55°C，pH為6.0-9.0。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述方法制備得到的復合菌。
[0020] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述復合菌在厭氧消化上的應用，特別是在沼氣發(fā) 酵上的應用。
[0021]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所得復合菌能快速高效的解除丙酸的積累，可以在8天 內完全水解濃度為3000mg/L的丙酸鈉，對于濃度高達15000mg/L的丙酸鈉也可以在11天內 完全水解;本發(fā)明所得復合菌解除了發(fā)酵酸化帶來的不利影響，使得厭氧消化的效率和穩(wěn) 定性大為提升。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明復合菌對丙酸的水解能力圖；
[0023]圖2為復合菌群對pH的適應能力圖；
[0024]圖3為復合菌群對丙酸鈉的代謝能力圖。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據上述
【發(fā)明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。 [0026]下述實施例中所用的BCTY培養(yǎng)基的配方為:按每升培養(yǎng)基計，由lg NH4Cl，lg酵母 粉，lg胰蛋白胨，〇.5g半胱氨酸鹽酸鹽，50ml大量元素溶液，10ml微量元素溶液，10ml維生素 141，10mg 刃天青；所述大量元素每升包括 6g KH2P〇4，12g NaCl，2g MgCl2.6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸，1.35g FeCl3 · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0. lg ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0 . Olg H3B03,0.024g Na2Mo〇4 · 2H20，lg NaCl，0.12g NiCh · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20組成。
[0027] 實施例1
[0028] 配制厭氧的BCTY培養(yǎng)液，加入終濃度為3000mg/L的丙酸鈉，分裝150ml于250ml厭 氧瓶中，接種10% (V/ν)右旋糖酐廢水厭氧消化器出水，密封，40°C靜止培養(yǎng)。待丙酸降解率 達到80%，甲烷含量為50%左右，按照以下三種方案添加功能菌株(個細胞/ml培養(yǎng)液）：
[0029] 方案一 ：Pelotomaculum schinkii 2 · 5 X 107，Pelotomaculum propionicicum 1 X 107，Syntrophobacter wolinii 1 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 4X106， Methanoculleuspalmolei 5X 106，Methanoculleus bourgensis 5X 106，Methanosarcina barkeri 5X 106，Methanosarcina mazei 1X107。
[0030] 方案二：Pelotomaculum schinkii 4 X 107，Pelotomaculum propionicicum 1.5 X 107，Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungatei 1.4X107， Methanoculleuspalmolei 1X 107，Methanoculleus bourgensis 1X 107，Methanosarcina barkeri 1 ·5X 107，Methanosarcina mazei 2X107。
[0031] 方案三：Pelotomaculum schinkii 5 X 107，Pelotomaculum propionicicum 2.5 X 107，Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungatei 1.4X107， Methanoculleuspalmolei 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2·5X107，Methanosarcina mazei 3 X107；
[0032] 密封，40°C靜止培養(yǎng)，監(jiān)測丙酸降濃度和甲烷產量，結果見圖1。實施例2復合菌群 對pH的適應能力
[0033] 配制厭氧的BCTY培養(yǎng)液，加入終濃度為3000mg/L的丙酸鈉，分裝150ml于250ml厭 氧瓶中，接種20% (V/V)右旋糖酐廢水厭氧消化器出水，密封，20°C靜止培養(yǎng)。待丙酸降解率 達到70 %，甲烷含量為40 %左右，按照以下方案添加功能菌株（個細胞/ml培養(yǎng)液）： Pelotomaculum schinki i 5 X 107，Pelotomaculumpropionicicum 2.5Χ107， Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 1.4X107， Me thanocul 1 euspalmo 1 e i 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2 · 5 X 107，Methanosarcina mazei 3X107。
[0034] 密封，20°C靜止培養(yǎng)，獲得水解丙酸產甲烷復合菌群。將獲得的菌群分別接種于pH 6.0，pH 7.0，pH 8.0，pH 9.0的新鮮BCTY培養(yǎng)基中，接種量20%(V/V)，丙酸終濃度為 3000mg/L，監(jiān)測丙酸濃度和甲烷產量，結果見圖2。
[0035]實施例3復合菌群對丙酸鈉的代謝能力
[0036] 配制厭氧的BCTY培養(yǎng)液，加入終濃度為10000mg/L的丙酸鈉，分裝150ml于250ml厭 氧瓶中，接種1%(v/v)右旋糖酐廢水厭氧消化器出水，密封，55°C靜止培養(yǎng)。待丙酸降解率 達到50 %，甲烷含量為30 %左右，按照以下方案添加功能菌株（個細胞/ml培養(yǎng)液）： Pelotomaculum schinki i 5 X 107，Pelotomaculumpropionicicum 2.5Χ107， Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 1.4X107， Me thanocul 1 euspalmo 1 e i 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2.5X 107,Methanosarcina mazei 3X107。
[0037] 密封，55°C靜止培養(yǎng)，獲得水解丙酸產甲烷復合菌群。將獲得的菌群接種于pH 7.0 的新鮮BCTY培養(yǎng)基中，接種量1 % (V/V)，丙酸終濃度分別為lg/L，3g/L，5g/L，7g/L，10g/L， 15g/L，20g/L，30g/L，密封，40 °C靜止培養(yǎng)，監(jiān)測培養(yǎng)液中的丙酸相對含量，結果見圖3。
[0038] 丙酸相對含量=監(jiān)測時發(fā)酵液中的丙酸濃度(mg/L)/培養(yǎng)液中的初始丙酸濃度 (mg/L) X100%〇
【主權項】
1. 快速解除丙酸積累的復合菌的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1) 以右旋糖酐廢水厭氧消化器出水為原始接種物，以丙酸鈉作為碳源，進行接種培養(yǎng) 至培養(yǎng)物中丙酸降解率達到50-80%，甲烷含量為30-50% ; 2) 將步驟1)所得物轉移到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并按每ml步驟1)培養(yǎng)液，加入如下細菌： Pelotomaculum schinkii 2·5_5 X107個 Pelotomaculum propionicicum 1-2.5X107個 Syntrophobacter wolinii 1-3 X106個 Methanospirilium hungatei 0.4-1·4X107個 Methanoculleuspalmolei 0.5-1 ·4Χ 107 個 Methanoculleus bourgensis 0.5-1.4X107個 Methanosarcina barkeri 0 ·5_2·5 X107個 Methanosarcina mazei 1-3X107個； 3) 將步驟2)所得物進行密封培養(yǎng)，即得所述快速解除丙酸積累的復合菌。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1)接種時，接種量為1-20 %，培養(yǎng)條 件為于25-55°C、pH=6.0-9.0下密封培養(yǎng)。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，丙酸鈉的添加量為1500-10000mg/L〇4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)和步驟2)中所用培養(yǎng)基，按每升培 養(yǎng)基計，包括lg NH4C1，lg酵母粉，lg胰蛋白胨，0.5g半胱氨酸鹽酸鹽，50ml大量元素溶液， 10ml微量元素溶液，10ml維生素141，10mg刃天青；所述大量元素每升包括6g KH2PO4,12g NaCl，2g MgCl2 · 6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸， 1.35g FeCb · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0.1g ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0.01g H3B03,0.024g Na2Mo04 · 2H20,lg NaCl,0.12g N1CI2 · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20〇5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25-55 Γ，ρΗ*6·0-9·0。6. 權利要求1-5所述方法制備得到的復合菌。7. 權利要求6所述的復合菌在厭氧消化上的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述應用為在沼氣發(fā)酵上的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK106085926SQ201610725109
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月25日
【發(fā)明人】馬詩淳, 黃艷, 凡慧, 鄧宇, 施國中, 張敏, 王春芳, 尹小波
【申請人】農業(yè)部沼氣科學研究所