食品級納豆激酶表達菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食品級納豆激酶表達菌，該重組菌是經過改造使得基因組中含有至少一個拷貝納豆激酶基因的地衣芽胞桿菌。優(yōu)選地，該表達菌基因組中負調控因子基因hrcA失活。本發(fā)明的生產菌株符合食品級表達系統(tǒng)的要求，納豆激酶基因多個拷貝無痕整合到地衣芽胞桿菌基因組中表達，表達量比現(xiàn)有技術顯著提高顯著，通過失活負調控基因hrcA，酶活力和表達量進一步提高，酶活力達到1350FU/mL，蛋白含量達1.45g/L。本發(fā)明中重組菌制備的納豆激酶，純度較高，可以加工成保健品或作為療腦梗塞藥物的有效成分。
【專利說明】
食品級納豆激酶表達菌
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物基因工程技術領域，具體涉及一種安全級別為食品級的納豆激 酶表達菌，其中表達菌是一種重組的地衣芽胞桿菌。
【背景技術】
[0002] 日本學者Hiroyuki Sumi于1987年首次在日本傳統(tǒng)食品納豆中發(fā)現(xiàn)并且提取出具 有溶解血栓功能的活性物質--納豆激酶(Nattokinase，NK) (Cellular and Molecular Life Sciences，1987,43(10) :1110-1111 ·)。納豆激酶是由納豆芽胞桿菌（Baci 1 lus subti 1 is var. natto)產生的一種具有強烈溶栓功能的蛋白酶，是一種枯草桿菌蛋白酶。該 酶不僅易于提取純化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，藥效時間長，而且安全性好，無任 何毒副作用;較目前已開發(fā)研制的一些溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑 等具有獨特的優(yōu)越性，可直接將纖維蛋白尤其是交聯(lián)形式的纖維蛋白水解成小肽和氨基 酸，有望成為一種新型溶栓藥物。
[0003] 納豆激酶來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，生產工藝簡單，無副作用，安全性高，完全符合治 療血栓病的藥品或食品基料的要求，因此有著很好的應用前景和廣闊的市場。目前全世界 患有各種血栓性疾病的患者超過1500萬，每年約有300萬患者死亡，并且這種狀況向低齡化 發(fā)展。所需的溶栓劑的潛在市場約20億美元。
[0004] 目前，納豆激酶的溶栓功效已經得到各方的認可。各國已開始積極開發(fā)納豆激酶 產品。日本、韓國、朝鮮等國家已研制出多種以納豆激酶為主要成分的產品。日本是納豆激 酶產品的最大生產國，已有10余家大公司生產出多種以納豆激酶為主要成分的產品上市。 近年來納豆激酶作為功能性食品、食品添加劑和普通食品的發(fā)展也非常迅速，每年以17% ~20%的增長率逐年增加。在我國，已有多家廠商生產納豆激酶膠囊制品，但由于生產菌株 產量過低致使市售納豆激酶保健品與日本進口產品相比，活力單位相差很大。因此有必要 對納豆激酶生產菌株進行改造，以大幅增加菌株產量，提高最終產品品質。
[0005] 目前國內納豆激酶研發(fā)和生產相關的文獻和專利也逐年增加，從菌種選育、發(fā)酵 生產、工藝優(yōu)化、產品加工工藝等都有涉及。納豆激酶的生產采用納豆芽胞桿菌固態(tài)發(fā)酵開 發(fā)保健食品的研究較多（如專利文獻CN201410009197)，受選育的生產菌株產酶能力和發(fā)酵 水平的限制，野生菌株發(fā)酵生產的納豆激酶的產量和活力偏低，與進口產品還存在較大差 距。
[0006] 近年來，從分子水平研究納豆激酶成為很多研究人員的一個主攻方向，很多研究 者在納豆激酶基因克隆表達方面，已經從不同菌株(枯草桿菌、納豆桿菌、解淀粉芽胞桿菌） 中克隆了納豆激酶成熟肽基因，包括前導肽和成熟肽的納豆激酶原基因。與傳統(tǒng)育種相比， 依靠基因工程手段，用模式宿主如大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、釀酒酵母以及畢赤酵母等來生 產重組納豆激酶是提高納豆激酶產量的捷徑。目前為止，利用上述幾種表達系統(tǒng)表達的重 組納豆激酶的產酶量和活力整體都還偏低，無法滿足產業(yè)化的需求，仍需要對于生產菌株 做進一步的優(yōu)化和提升，且還存在各種問題。
[0007] 當前的表達系統(tǒng)多以大腸桿菌表達系統(tǒng)為主，高表達載體常使表達產物以包涵體 的形式存在，該包涵體可以保護蛋白免受水解，但是溶栓活性較低，故常需體外誘導表現(xiàn)酶 活。另外，表達的蛋白背景雜蛋白很多，表達量一般不高。而且，大腸桿菌不是食品安全級的 GRAS(Generally Recognized as Safe)菌株，分泌能力差，有內毒素污染的風險，表達的重 組納豆激酶用于保健食品和藥品的生產可能存在食品安全性的問題。
[0008] 枯草芽胞桿菌表達納豆激酶的活力不高，且分泌的多種胞內胞外蛋白酶可能會部 分降解目的產物。釀酒酵母和枯草芽胞桿菌雖然都是GRAS菌株，但同樣存在分泌表達量低 的問題，且發(fā)酵周期較長。畢赤酵母表達的重組納豆激酶同樣存在發(fā)酵周期長、活力低等問 題。采用以上四種重組表達系統(tǒng)進行表達時，重組菌株中都轉入了帶有外源抗性基因的重 組質粒（如專利文獻 CN201410109952，CN201410068833，CN201310562366)，甚至有些出發(fā)菌 株都含有外源抗性基因，如枯草芽胞桿菌WB600(如專利文獻CN201410068833)。帶游離質粒 的重組菌株，在生產過程中容易發(fā)生質粒丟失，造成菌株產酶退化，尤其是芽胞桿菌中的游 離質粒，傳代過程中比較容易丟失。這些含有抗性基因重組生產菌株不符合食品級表達系 統(tǒng)的要求，用于保健食品和藥品的生產可能存在食品安全性的問題和潛在的副作用。地衣 芽胞桿菌被認為是GRAS菌株，且能分泌大量的胞外蛋白，分泌水平是枯草芽胞桿菌的2倍以 上。盡管地衣芽胞桿菌中表達納豆激酶也有文獻報道（J Ind Microbiol Bioethanol， 2015,42(2) :287-95)，但采用的還是游離質粒表達，同樣存在上述問題。
[0009] 另外，目前國內外的公司絕大部分還是通過納豆或其它豆類的固體或半固體發(fā)酵 來生產納豆激酶制品，發(fā)酵提取物均為混合物，大部分產品當中混有嘌呤、維生素 K2等具有 副作用的多功能因子，有苦氨味，預防和治療血栓疾病的效果受到很大的影響。
[0010] 食品級基因表達系統(tǒng)必須具備如下基本條件：（1)表達宿主必須是安全的、特性清 楚而穩(wěn)定的食品級微生物，如乳酸球菌、乳酸桿菌、芽胞桿菌等在食品工業(yè)中有著悠久應用 歷史且被認為是GRAS的微生物；宿主菌經過遺傳改造后，在食品中和人的腸道中都必須足 夠穩(wěn)定。（2)對于誘導型表達系統(tǒng)來說，誘導物必須是食品級的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、 Nisin等可被人食用的物質。（3)關于載體方面必須滿足以下幾個標準:載體必須是食品級 的，與宿主菌一樣具有安全性;能與食品共存，無抗生素抗性標記;不能使用有害化合物(如 重金屬)作為載體系統(tǒng)的選擇壓力，即使載體系統(tǒng)對此化合物有抗性，可在工業(yè)范圍或食品 生產中應用。
[0011]到目前為止，還未見有采用食品級基因表達系統(tǒng)生產重組納豆芽胞桿菌的報道。

【發(fā)明內容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術中的上述問題，提供一種符合食品級表達系統(tǒng)的 地衣芽胞桿菌重組菌。
[0013] 本發(fā)明提供的食品級納豆激酶表達菌，是經過改造使得基因組中含有至少一個拷 貝納豆激酶基因的地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis);納豆激酶基因前具有啟動 子，納豆激酶基因后具有終止子。
[0014] 納豆激酶蛋白序列和納豆激酶基因序列均為已知，蛋白序列可以參照SEQ ID NO. 1所示序列，基因序列可以根據(jù)公開的文獻例如NCBI上公布的Bacillus subtil is subsp · nattoBEST195菌株的基因組DNA序列（Accession Number AP011541)中納豆激酶 aprN的序列進行引物設計，擴增獲得。所述的納豆激酶基因優(yōu)選的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 納豆激酶基因的插入導致地衣芽胞桿菌自身的多個胞外蛋白酶基因失活，改善地 衣芽胞桿菌的分泌水平。
[0016] 優(yōu)選的納豆激酶基因拷貝數(shù)是2個、3個或4個，更優(yōu)選的是3個拷貝。一般情況下， 產量是隨著拷貝數(shù)增加而增加的，但是隨著基因組中同一基因拷貝數(shù)增加，基因組的不穩(wěn) 定性的概率會增加，從而導致產量的下降，因為超過3個拷貝，正向重復序列和反向重復序 列至少有2對，分子內的同源重組會導致基因組的不穩(wěn)定;另外，隨著拷貝數(shù)的增加，無痕敲 入的難度會逐漸增加，在3拷貝基礎上整合第4個拷貝的難度也會較大，因為敲入載體與基 因組發(fā)生單交換的位點增加到5個。綜合穩(wěn)定性和操作簡易性等原因，選擇3個拷貝是最佳 的。
[0017] 優(yōu)選地，上述食品級納豆激酶表達菌，該表達菌基因組中負調控因子基因 hrcA失 活。負調控因子基因 hrcA失活可以進一步改善分泌水平，增加納豆激酶的分泌量。
[0018] 優(yōu)選地，以上任一所述的食品級納豆激酶表達菌，所述納豆激酶基因的啟動子為： 納豆激酶基因原始啟動子，或來自地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶基因（apr)的啟動子(Papr);優(yōu) 選納豆激酶基因原始啟動子(PaprN);所述納豆激酶基因的終止子為納豆激酶基因原始終 止子。
[0019] 優(yōu)選地，納豆激酶基因原始啟動子序列如SEQ ID N0.4所示，地衣芽胞桿菌堿性蛋 白酶基因（apr)的啟動子(Papr)序列如SEQ ID N0.3所示。納豆激酶基因的終止子序列如 SEQIDN0.5**。
[0020] 以上任一所述的食品級納豆激酶表達菌，該表達菌的原始菌株為CICC 10182、 CICC 10266、ATCC53926或ATCC 21415。其中優(yōu)選CICC 10266和ATCC 21415,更優(yōu)選用CICC 10266作為本發(fā)明的地衣芽胞桿菌原始菌株。
[0021] 其中CICC 10182全稱B.licheniformis CICC 10182,購自中國工業(yè)微生物菌種保 藏管理中心（CICC) ;CICC 10266全稱B.licheniformis CICC 10266,購自中國工業(yè)微生物 菌種保藏管理中心（CICC) ;ATCC 53926全稱Bacillus licheniformis ATCC 53926,購自美 國模式培養(yǎng)物集存庫;ATCC 21415全稱Bacillus licheniformis ATCC 21415,購自美國模 式培養(yǎng)物集存庫。
[0022] 上述地衣芽胞桿菌所有基因片段的擴增，均可以參照NCBI中B.licheniformis ATCC14580的基因組序列序列(Accession NumberAE017333)設計引物進行擴增獲得。
[0023 ] 優(yōu)選地，上述任一食品級納豆激酶表達菌，所述納豆激酶基因替換了地衣芽胞桿 菌基因組中的至少一個胞外蛋白酶基因，所述胞外蛋白酶基因包括apr、mpr、bpr2、vpr、epr 和 bprl。更優(yōu)選 apr，bpr2 和 mpr。
[0024] apr，bpr2和mpr這三個基因表達的蛋白酶在胞外的分泌量較大，在這三個位點替 換納豆激酶基因，使得最終胞外蛋白酶的量最少，納豆激酶被蛋白酶降解的風險最小。
[0025] 本發(fā)明的另一目的是提供一種溫敏型敲入載體，用于改造地衣芽胞桿菌以獲得以 上任一所述的食品級納豆激酶表達菌，該載體是將PWEBK15質粒復制子替換成溫敏型復制 子，插入或不插入熒光蛋白基因，以及插入納豆激酶蛋白基因構建而成的；其中納豆激酶蛋 白基因上游連接地衣芽胞桿菌基因組中胞外蛋白酶基因的上游序列，納豆激酶蛋白基因下 游連接地衣芽胞桿菌基因組中該胞外蛋白酶基因的下游序列。所述單一抗生素抗性基因優(yōu) 選卡拉霉素抗性基因 Kan。
[0026] 溫敏型復制子是特指在芽胞桿菌中具有溫敏特性的復制子片段，該片段包括芽胞 桿菌中復制起點和復制起始蛋白的完整CDS序列。
[0027] 口'^81(15質粒是中國專利公開號0附042326754(【公開日】2014.12.24)公開的含有單 一抗生素抗性基因的大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭表達載體。
[0028] 上述溫敏型敲入載體中，優(yōu)選插入熒光蛋白基因，該基因插入后，載體有雙篩選標 記，轉化后篩選的時候，挑取的單克隆的陽性率更高，抗性平板上有熒光的克隆子的陽性率 是100%;而只有單一抗性篩選，陽性率不是100%，如果長的雜菌恰好又能在抗性板子上 長，且形態(tài)和我們的芽孢桿菌類似，陽性率就會下降。另外，雙篩選標記的敲入載體在與芽 胞桿菌的基因組發(fā)生雙交換的時候，除了抗性會丟失，菌體在紫外下也沒有熒光，這樣篩選 到發(fā)生雙交換克隆子的概率會增加。第三，也可以判斷最終的敲入菌株還有沒有游離的質 粒存在，若有就會有熒光;若沒有就沒有熒光;最終無痕敲除的菌株中無論是抗性基因還是 熒光蛋白基因都會從基因組中消除掉，不會對最終生產造成任何影響。
[0029] 優(yōu)選地，上述溫敏型敲入載體，所述胞外蛋白酶基因為apr、mpr、bpr2、vpr、epr或 bprl 〇 更優(yōu)選 apr，bpr2 和 mpr〇
[0030] apr，bpr2和mpr這三個基因表達的蛋白酶在胞外的分泌量較大，在這三個位點替 換納豆激酶基因，使得最終胞外蛋白酶的量最少，納豆激酶被蛋白酶降解的風險最小。
[0031] 本發(fā)明還提供以上任一所述的溫敏型敲入載體的制備方法，包括以下步驟：
[0032] (1)人工合成或PCR擴增獲得溫敏型復制子片段，通過無縫克隆方式插入到 pWEBK 15質粒，替換pWEBK 15質粒中的復制子序列，得到pKan 1941s質粒；
[0033] (2)人工合成或PCR擴增獲得熒光蛋白基因，通過無縫克隆方式插入到pKanl94ts 質粒，得到pKGFP194ts質粒；
[0034] (3)將上游連接地衣芽孢桿菌基因組中胞外蛋白酶基因的上游序列、下游連接地 衣芽孢桿菌基因組中該胞外蛋白酶基因的下游序列的納豆激酶蛋白基因，通過無縫克隆的 方式插入到pKGFP194ts質粒中。
[0035] 本發(fā)明還提供以上任一所述的食品級納豆激酶表達菌的制備方法，包括以下步 驟：
[0036] (1)使用本發(fā)明的溫敏型敲入載體，通過無縫克隆的方式導入到地衣芽孢桿菌； [0037] (2)步驟（1)導入載體后的地衣芽孢桿菌在42~44°C的高溫環(huán)境下培養(yǎng)，通過PCR 的方法驗證同源單交換和同源雙交換的菌株，成功實現(xiàn)無痕敲入的菌株即是納豆激酶基因 單拷貝整合到地衣芽胞桿菌基因組中的重組菌，該重組菌即為食品級納豆激酶單拷貝表達 菌；
[0038]當需要納豆激酶基因兩拷貝的食品級納豆激酶表達菌時，在步驟(2)獲得的食品 級納豆激酶單拷貝表達菌作為宿主進行第二輪導入溫敏型敲入載體，獲得食品級納豆激酶 兩拷貝表達菌；當需要納豆激酶基因三拷貝的食品級納豆激酶表達菌時，則以食品級納豆 激酶兩拷貝表達菌作為宿主進行第三輪導入；以此類推，獲得所需納豆激酶拷貝數(shù)的食品 級納豆激酶多拷貝表達菌；要求每一輪導入的溫敏型敲入載體之間，其含有的胞外蛋白酶 基因的上下游序列應該不同；
[0039] 當所述食品級納豆激酶表達菌中基因組負調控因子基因 hrcA失活時，還包括步驟 (3):敲除負調控因子基因 hrcA，具體是將含有hrcA基因的上下游序列的質粒pKGFP194-hrcAFR導入到步驟(2)最終獲得的食品級納豆激酶單拷貝表達菌或食品級納豆激酶多拷貝 表達菌；
[0040] 所述質粒pKGFP194-hrcAFR的構建方法為:將hrcA基因的上下游序列，通過無縫克 隆的方式插入到pKGFP194ts質粒中；
[00411 pKGFP194ts質粒的制備方法為:人工合成或PCR擴增獲得溫敏型復制子片段，通過 無縫克隆方式插入到PWEBK15質粒，替換pWEBK15質粒中的復制子序列，得到pKanl94ts質 粒；人工合成或PCR擴增獲得熒光蛋白基因，通過無縫克隆方式將熒光蛋白基因插入到 pKanl94ts質粒，得到 pKGFP194ts質粒。
[0042] 本發(fā)明還提供一種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)納豆激酶表達菌，其成分包括:麥芽 糖30g/L、大豆蛋白胨 14g/L、酵母浸出粉3g/L、KH2P〇4 2g/L、K2HP〇4 5g/L、MgS〇4 0.5g/L和 CaCl2 0.2g/L。該液體發(fā)酵培養(yǎng)基特別適合于培養(yǎng)本發(fā)明的食品級納豆激酶表達菌。
[0043] 本發(fā)明還提供以上任一所述的食品級納豆激酶表達菌分泌的納豆激酶在制備保 健品或制備治療腦梗塞藥物中的應用。
[0044] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0045] 本發(fā)明首次實現(xiàn)了食品級表達系統(tǒng)生產重組納豆芽胞桿菌，生產菌株符合食品級 表達系統(tǒng)的要求，納豆激酶基因多個拷貝無痕整合到在地衣芽胞桿菌基因組中表達，表達 量比現(xiàn)有技術顯著提高顯著，通過失活負調控基因 hrcA，酶活力和表達量進一步提高，酶活 力達到1350FU/mL，蛋白含量達1.45g/L。本發(fā)明中重組菌制備的納豆激酶，純度較高，可以 加工成保健品或作為療腦梗塞藥物的有效成分。
【附圖說明】
[0046] 圖1質粒pKGFP194ts的圖譜；
[0047]圖2納豆激酶基因 aprN在地衣芽胞桿菌某一基因（X基因）位點的敲入載體構建示 意圖；
[0048]圖3重組地衣芽胞桿菌表達納豆激酶發(fā)酵液上清的SDS-PAGE分析;M:蛋白Marker， 1-3:納豆芽胞桿菌CICC20132，三個aprN拷貝的地衣芽胞桿菌CICC10266 (apr: : aprN yh謂 mpr::aprNAbprlbpr2::aprN^PCICC10266(ap;r::aprNyhfNmp;r::aprNAbp;rlbpr2:: aprN hrcA)，每個樣品取10yL發(fā)酵液上清上樣。
【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的 理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0050] 本發(fā)明中用到的菌株Bacillus natto CICC20132(納豆芽胞桿菌CICC20132)、 B.licheniformis CICC 10182和B.licheniformis CICC 10266(地衣芽胞桿菌CICC10266) 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICChBacillus licheniformis ATCC53926和 Bacillus licheniformis ATCC 21415購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。
[00511 本發(fā)明所用到的原始質粒pE 194和pMUT IN-GFP +質粒購買來源為美國BGSC (Bacillus Genetic Stock center)；
[0052] pET-28a( + )、pUC57、pWB980均購自杭州寶賽生物科技有限公司，枯草芽胞桿菌 BS168購自MoBiTec公司，大腸桿菌DH5a購自湖北晶茂生物技術有限公司。
[0053] PWEBK15載體質粒參照專利CN201410430501文獻構建；本發(fā)明中用到的所有的 Phusion DNA聚合酶和限制性內切酶等分子生物學試劑購自Thermofisher公司；無縫克隆 試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；其它常用生化試劑均是市售分析純。
[0054] PCR產物回收和膠回收DNA的方法均采用omega公司的試劑盒的方法。Bradf or d蛋 白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。下述實施例中的實驗材料，如無特殊說 明，均可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑購得。下述實施例中所采用的方法，如無特殊說明，均為常 規(guī)方法。
[0055] 本發(fā)明中所有引物見表1。
[0056] 表1擴增引物與測序引物
[0057]
[0058]
[0059]
[0060] 實例1溫敏型質粒pKGFP194ts的構建
[0061 ]以PE194質粒為模版，以引物F1和R1擴增載體溫敏型復制子194ts片段。
[0062] PCR體系為：10 XPCR Buffer 5yL，2mM dNTP 5yL，25mM MgS〇45yL，10yM primer F/R各 1.5yL，模版DNA 0.5yL，K0D-Plus-Neo lyL，dH2〇 32.5yL〇
[0063] PCR反應條件如下：94°C，；30個循環(huán)（98°C10s，58°C30s，68°C1.5min);68°C5min，4 °C保溫;后續(xù)實驗中PCR體系和反應條件均參照以上條件配置和設定，退火溫度和延伸時間 根據(jù)實際情況而調整，其它參數(shù)不變。
[0064] 參考CN201410430501專利文獻中的方法構建pWEBK15質粒。
[0065] pWEBK15質粒構建方法如下：
[0066] 提取pET-28a( + )載體質粒和pUC57質粒。以pET-28a( + )質粒DNA為模版，以引物P1 (5'-CGAGATATCATGAGCCATATTCAACGGGA-3'WPP2(5'-CCCACATGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGA-3'）擴增pET-28a( + )載體上的Kan基因片段。EcoRV和Pci I雙酶切Kan基因片段和pUC57質 粒，PCR產物回收產物，連接，轉化大腸桿菌DH5a，測序正確的中間載體命名為pUCKan;
[0067] 提取pUCKan質粒，EcoR I和EcoRV雙酶切pUCKan質粒后回收大片段；以枯草芽胞桿 菌BS168基因組DNA為模版，以引物P3 (5 ' -CCGGAATTCACACAGGGATAAAATCGGCG-3 '）和P4 (5 ' -CGAGATATCTATGCGCTGCATCTCC TCAC-3 '）擴增pEBl 啟動子;EcoRI和EcoRV雙酶切pEBl，用PCR 產物回收試劑盒回收酶切后的DNA片段，分別再與雙酶切后的pUCKan質粒片段連接，轉化大 腸桿菌DH5a，涂布到含有50yg/mL卡拉霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選，最終測序成功的中 間載體命名為pUCKanEBl;
[0068] 提取pUCKanEBl質粒DNA，以其為模版，以磷酸化處理的引物P5(5'-ACCTGACGTCTA AGAAACCA-3 '）和P6(5 '-GTGAGTTTTCGTTCCACT GA-3 '）進行擴增，擴增產物經膠回收試劑盒 純化后，采用平末端連接的條件，在22°C連接2h，轉化大腸桿菌DH5a，涂布到含有50yg/mL卡 拉霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選，最終測序成功的中間載體命名為pKanEB8;
[0069] 以pWB980質粒DNA為模版，以P7(5 ' -CCGGAATTCGAGCTCAGCA TTAT-3 '）和P8(5 ' -CTGGACGTCAGCATCTAATCTTCAACAAAC-3 '）為引物擴增基因片段psr。提取pKanEB8質粒DNA，用 EcoRI和Aat II雙酶切psr和pKanEB8質粒，回收大片段，連接，轉化大腸桿菌DH5a，涂布到含 有50yg/mL卡拉霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選，最終測序成功的載體命名為pWEBK15。
[0070] 以PWEBK15質粒為模版，用引物F2和R2進行全質粒PCR擴增，擴增產物37°C經Dpnl 酶過夜消化后回收，采用無縫克隆試劑盒的操作說明對載體片段和溫敏型復制子194ts片 段進行連接，轉化大腸桿菌JM110,涂布在50μg/ml卡拉霉素抗性LB平板(酵母提取物5g/L， 蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L)上，置30°C培養(yǎng)20h后篩選克隆子，用引物F3和R3進 行PCR驗證和測序驗證，測序成功的載體命名pKanl94ts質粒。
[0071] 以pMUTIN-GFP+質粒為模版，用引物F4和R4擴增Cycle 3GFP基因；以pKanl94ts為 模版，用引物F5和R5擴增載體片段，基因和載體的擴增產物37°C經Dpnl酶過夜消化后回收， 采用無縫克隆試劑盒按照操作說明對載體片段和基因片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5a， 涂布在50μg/ml卡拉霉素抗性平板上篩選克隆子，挑取紫外光下有綠色熒光的克隆子，用引 物F2和R3進行PCR驗證和測序驗證，測序成功的載體命名pKGFP194ts(圖1)。
[0072]實例2溫敏型敲除(入)質粒的構建
[0073]采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)提芽胞桿菌的基因組DNA作為基因擴增的模 板(微生物學報，2006，46 (1): 7-12 ·)。
[0074] 以地衣芽胞桿菌CICC10266基因組DNA為模版，以apr-UF/R為引物擴增apr基因的 上游同源臂apr-U，以apr-DF/R為引物擴增apr基因的下游同源臂apr-D。
[0075] 以納豆芽胞桿菌CICC20132基因組DNA為模版，以aprN-F2/R2為引物擴增納豆激酶 基因 aprN基因片段1;以apr-U片段，apr-D片段和aprN片段1的混合物為模版，以apr-UF/ apr-DR為引物擴增三片段的重疊片段aprUD-aprN;aprN基因在地衣芽胞桿菌某一基因（X基 因）位點的敲入載體構建示意圖如圖2所示。
[0076]以pKGFP194ts質粒為模版，以引物F4和R1擴增載體片段，載體片段的擴增產物37 °CSDpn頂每過夜消化后回收，采用無縫克隆試劑盒按照操作說明對載體片段和重疊片段 aprUD-aprN進行連接，轉化大腸桿菌JM110，涂布在50μg/ml卡拉霉素抗性平板上篩選陽線 克隆子，用引物apr-UF和apr-DR進行測序驗證，測序成功的載體命名為pKGFP194-aprUD-aprN〇
[0077] 采用上述同樣的方法，用引物對mpr-UF/R和mpr-DF/R分別擴增mpr基因的上下游 同源臂mpr-U和mpr-D;用引物aprN-F3/R3擴增aprN基因片段2;以mpr-U片段，mpr-D片段和 aprN基因片段2的混合物為模版，以mpr-UF/mpr-DR為引物擴增重疊片段mprUD-aprN;采用 上述無縫克隆方法將重疊片段mprUD-aprN克隆到pKGFP194ts載體中，用引物mpr-UF和mpr-DR進行測序驗證，測序成功的載體命名為pKGFP194-mprUD-aprN。
[0078] 采用上述同樣的方法，用引物對bpr-UF/R和bpr-DF/R分別擴增bpr基因的上下游 同源臂bpr-U和bpr-D;用引物aprN-F4/R4擴增aprN基因片段3;以bpr-U片段，bpr-D片段和 aprN片段3的混合物為模版，以bpr-UF/bpr-DR為引物擴增重疊片段bprUD-aprN;采用上述 無縫克隆方法將重疊片段bprUD-aprN克隆到pKGFP194ts載體中，用引物bpr-UF和bpr-DR進 行測序驗證，測序成功的載體命名為pKGFP194-bprUD-aprN。
[0079]實例3納豆激酶基因無痕敲入地衣芽胞桿菌 [0080] (1)納豆激酶基因單拷貝菌株構建
[0081 ] 提取質粒pKGFP194-aprUD-aprN，將其電轉化到地衣芽胞桿菌CICC10266菌株中， 感受態(tài)細胞制備和電轉化方法參照以下文獻:J Microbiol Meth. 1999,34(3): 183-191。
[0082] 轉化的細胞涂布到20μg/ml卡拉霉素的LB固體抗性平板上30°C培養(yǎng)16h，PCR驗證 陽線克隆子，將陽線克隆子接種到LB液體培養(yǎng)基中于44°C培養(yǎng)，每8-12h轉接0.2mL菌液到 20mL新鮮LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，從傳代第2次開始取樣，在抗性平板上劃線，利用敲除基因 上下游同源臂的外側引物apr-UF2和apr-DR2和待敲除基因敲除載體中的引物對單菌落進 行菌落PCR擴增，驗證單交換菌株;將發(fā)生單交換的菌株接種到20mL新鮮LB培養(yǎng)基中于42°C 傳代培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)，從傳代第2次開始取樣，將菌液稀釋10-6涂布無抗性LB平板置于37 °C培 養(yǎng)8-10h，將無抗平板上的單菌落進行標記，用無菌牙簽挑取到抗性平板上37°C培養(yǎng)8-10h， 將抗性平板上不長的克隆子挑取出來做菌落PCR驗證和測序驗證，正確的克隆子即是納豆 激酶基因無痕敲入的菌株，命名為CICC10266(apr: :aprN yhfN)。
[0083] (2)納豆激酶基因雙拷貝菌株構建
[0084] 提取質粒pKGFP194-mprUD-aprN，將其電轉化到地衣芽胞桿菌CICC10266(apr:: aprN yhfN)菌株中，按照上述（1)方法進行單交換和雙交換篩選，利用敲除基因上下游同源 臂的外側引物mpr-UF2和mpr-DR2和待敲除基因敲除載體中的引物對單菌落進行菌落PCR擴 增，驗證單交換菌株。
[0085] 對mpr位點成功敲入aprN基因的菌株再用引物apr-UF和apr-DR驗證apr位點的 aprN基因是否完整，apr基因位點aprN基因完整的克隆子即是aprN基因雙拷貝無痕敲入的 菌株，命名為CICC10266(apr: :aprNyhfNmpr: :aprN)。
[0086] (3)納豆激酶基因三拷貝菌株構建
[0087] 提取質粒pKGFP194-bprUD-aprN，將其電轉化到地衣芽胞桿菌CICC10266(apr:: aprN yhfN mpr: :aprN)菌株中，按照上述方法進行單交換和雙交換篩選。利用敲除基因上 下游同源臂的外側引物bpr-UF2和bpr-DR2和待敲除基因敲除載體中的引物對單菌落進行 菌落PCR擴增，驗證單交換菌株。
[0088] 對bpr位點成功敲入aprN基因的菌株，再用引物對apr-UF/R和mpr-UF/R分別驗證 apr和mpr基因位點的aprN基因是否完整，apr和mpr基因位點aprN基因完整的克隆子即是 aprN基因三拷貝無痕敲入的菌株，命名為CICC10266(apr::aprN yhfN mpr::aprNAbprl bpr2::aprN)〇
[0089]實例4三個納豆激酶基因拷貝的地衣芽胞桿菌中hr cA基因的敲除
[0090] 以地衣芽胞桿菌CICC10266基因組DNA為模版，以hrcA-UF/R為引物擴增hrcA基因 的上游同源臂hrcA-U，以hrcA-DF/R為引物擴增hrcA基因的下游同源臂hrcA_D。
[0091 ] 以hrcA-U片段和hrcA-D片段的混合物為模版，以hrcA-UF/hrcA-DR為引物擴增重 疊片段hrcAUD;采用上述無縫克隆方法將重疊片段hrcAUD克隆到pKGFP194ts載體中，用引 物hr cA-UF和hr cA-DR進行測序驗證，測序成功的載體命名為pKGFP 194-hr cAUD。
[0092] 提取質粒pKGFP194-hrcAUD，將其電轉化到含有3個aprN基因拷貝的地衣芽胞桿菌 CICC10266(apr::aprN yhfN mpr::aprNAbprl bpr2::aprN)中，按照上述方法進行單交換 和雙交換篩選。利用敲除基因上下游同源臂的外側引物hrcA-UF2和hrcA-DR2和待敲除基因 敲除載體中的引物對單菌落進行菌落PCR驗證，篩選單交換和雙交換菌株，hrcA基因成功敲 除的菌株命名為CICC10266(apr::aprN yhfN mpr::aprNAbprl bpr2::aprN hrcA)〇
[0093] 實例5納豆激酶液體發(fā)酵
[0094] 以野生納豆芽胞桿菌為對照菌株，挑取不同納豆芽胞桿菌拷貝數(shù)的地衣芽胞桿菌 的單菌落接種于5mL的LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。再以4%的接種量轉接到 50mL新鮮的液體發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽糖30g/L，大豆蛋白胨14g/L，酵母浸出粉3g/L，KH 2P〇4 2g/ L，K2HP〇4 5g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L;pH7.0)中，37°C，200r/min，發(fā)酵30h結束，測 定不同菌株發(fā)酵液上清產納豆激酶的活力和總蛋白含量(結果參見表2)?？偟鞍缀康臏y 定采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書的方法操作。納豆激酶活性參照日本納豆激酶 協(xié)會建立的方法(http: // jnattokinase · org/jnka_nk_english .html) 〇對部分樣品進行 SDS-PAGE分析，分析結果見圖3。
[0095]表2不同菌株產納豆激酶的活力和總蛋白含量
[0096]
[0097] 所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不 限于此。本技術領域的技術人員在本發(fā)明基礎上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保 護范圍之內。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準。
【主權項】
1. 食品級納豆激酶表達菌，其特征在于，是經過改造使得基因組中含有至少一個拷貝 納?激酶基因的地衣芽胞桿菌;納?激酶基因如具有啟動子，納?激酶基因后具有終止子。2. 根據(jù)權利要求1所述的食品級納豆激酶表達菌，其特征在于，該表達菌基因組中負調 控因子基因 hrcA失活。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的食品級納豆激酶表達菌，其特征在于，所述納豆激酶基因 的啟動子為:納豆激酶基因原始啟動子，或來自地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶基因的啟動子;優(yōu) 選納豆激酶基因原始啟動子;所述納豆激酶基因的終止子為納豆激酶基因原始終止子。4. 根據(jù)權利要求1~3任一所述的食品級納豆激酶表達菌，其特征在于，該表達菌的原 始菌株為CICC 10182、CICC 10266、ATCC53926或ATCC 21415。5. 根據(jù)權利要求1~3任一所述的食品級納豆激酶表達菌，其特征在于，所述納豆激酶 基因替換了地衣芽胞桿菌基因組中的至少一個胞外蛋白酶基因，所述胞外蛋白酶基因包括 apr、mpr、bpr2、vpr、epr^Pbprl〇6. -種溫敏型敲入載體，用于改造地衣芽胞桿菌以獲得權利要求1~5任一所述的食品 級納豆激酶表達菌，其特征在于，該載體是將PWEBK15質粒復制子替換成溫敏型復制子，插 入或不插入熒光蛋白基因，以及插入納豆激酶蛋白基因構建而成的；其中納豆激酶蛋白基 因上游連接地衣芽胞桿菌基因組中胞外蛋白酶基因的上游序列，納豆激酶蛋白基因下游連 接地衣芽胞桿菌基因組中該胞外蛋白酶基因的下游序列。7. 根據(jù)權利要求6所述的溫敏型敲入載體，其特征在于，所述胞外蛋白酶基因為apr、 mpr、bpr2、vpr、epri^bprl〇8. 權利要求6或7所述的溫敏型敲入載體的制備方法，所述溫敏型敲入載體基因組中插 入熒光蛋白基因，其特征在于，包括以下步驟： (1) 人工合成或PCR擴增獲得溫敏型復制子片段，通過無縫克隆方式插入到pWEBK15質 粒，替換pWEBK 15質粒中的復制子序列，得到pKan 1941s質粒； (2) 人工合成或PCR擴增獲得熒光蛋白基因，通過無縫克隆方式插入到pKanl94ts質粒， 得到pKGFP194ts質粒； (3) 將上游連接地衣芽胞桿菌基因組中胞外蛋白酶基因的上游序列、下游連接地衣芽 胞桿菌基因組中該胞外蛋白酶基因的下游序列的納豆激酶蛋白基因，通過無縫克隆的方式 插入到pKGFP194ts質粒中。9. 權利要求1~5任一所述的食品級納豆激酶表達菌的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 使用權利要求6或7所述的溫敏型敲入載體，通過無縫克隆的方式導入到地衣芽胞 桿菌； (2) 步驟（1)導入載體后的地衣芽胞桿菌在42~44°C的高溫環(huán)境下培養(yǎng)，通過PCR的方 法驗證同源單交換和同源雙交換的菌株，成功實現(xiàn)無痕敲入的菌株即是納豆激酶基因單拷 貝整合到地衣芽胞桿菌基因組中的重組菌，該重組菌即為食品級納豆激酶單拷貝表達菌； 當需要納豆激酶基因雙拷貝的食品級納豆激酶表達菌時，在步驟(2)獲得的食品級納 豆激酶單拷貝表達菌作為宿主進行第二輪導入溫敏型敲入載體，獲得食品級納豆激酶兩拷 貝表達菌；當需要納豆激酶基因三拷貝的食品級納豆激酶表達菌時，則以食品級納豆激酶 兩拷貝表達菌作為宿主進行第三輪導入；以此類推，獲得所需納豆激酶拷貝數(shù)的食品級納 豆激酶多拷貝表達菌;要求每一輪導入的溫敏型敲入載體之間，其含有的胞外蛋白酶基因 的上下游序列應該不同； 當所述食品級納豆激酶表達菌中基因組負調控因子基因 hrcA失活時，還包括步驟(3): 敲除負調控因子基因 hrcA，具體是將含有hrcA基因的上下游序列的質粒pKGFP194-hrcAFR 導入到步驟（2)最終獲得的食品級納豆激酶單拷貝表達菌或食品級納豆激酶多拷貝表達 菌； 所述質粒pKGFP194-hrcAFR的構建方法為:將hrcA基因的上下游序列，通過無縫克隆的 方式插入到pKGFP194ts質粒中； pKGFP194ts質粒的制備方法為:人工合成或PCR擴增獲得溫敏型復制子片段，通過無縫 克隆方式插入到PWEBK15質粒，替換pWEBK15質粒中的復制子序列，得到pKanl94ts質粒;人 工合成或PCR擴增獲得熒光蛋白基因，通過無縫克隆方式將熒光蛋白基因插入到pKanl94ts 質粒，得到pKGFP194ts質粒。10. -種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)納豆激酶表達菌，其特征在于，成分包括：麥芽糖 30g/L、大豆蛋白胨 14g/L、酵母浸出粉3g/L、KH2P〇4 2g/L、K2HP〇4 5g/L、MgS〇4 0.5g/L和 CaCl2 0.2g/L。11. 權利要求1~3任一所述的食品級納豆激酶表達菌分泌的納豆激酶在制備保健品或 制備治療腦梗塞藥物中的應用。
【文檔編號】A23L29/00GK106085934SQ201610410811
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日 公開號201610410811.8, CN 106085934 A, CN 106085934A, CN 201610410811, CN-A-106085934, CN106085934 A, CN106085934A, CN201610410811, CN201610410811.8
【發(fā)明人】汪小鋒, 汪衛(wèi), 葉聰, 張濛, 劉艷紅, 馬飛
【申請人】武漢康復得生物科技股份有限公司