脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應(yīng)用，該脯氨酸特異性蛋白酶基因具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。將該脯氨酸特異性蛋白酶基因?qū)氲胶谇怪斜磉_(dá)，其表達(dá)量比內(nèi)源基因(SEQ ID NO.1)表達(dá)量顯著提高。本發(fā)明的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成兩段人工基因，分別構(gòu)建的表達(dá)盒導(dǎo)入到黑曲霉中進(jìn)行表達(dá)，能夠顯著提高其在黑曲霉中的表達(dá)量。
【專利說明】
脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及提高脯氨酸特異性蛋白酶在黑曲霉表達(dá)的兩段核 酸序列，具體涉及一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的脯氨酸特異性蛋白酶基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脯氨酸特異性蛋白酶是一種能特異性地水解肽鏈中脯氨酸羧基端肽鍵的蛋白酶， 屬于絲氨酸蛋白酶家族。其活性中心由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸的催化三聯(lián)體組成。由于 其獨(dú)特的水解特性，使得脯氨酸特異性蛋白酶被用于食品，釀造，烘焙等領(lǐng)域。如CN 101511211A公開了一種包含脯氨酸特異性蛋白酶的涂抹醬;CN 101490235A公開了釀造啤 酒時(shí)加入脯氨酸特異性蛋白酶以降低或消除啤酒冷渾濁的方法;W02005117595A1公開了烘 焙面包時(shí)添加脯氨酸特異性蛋白酶以改善性質(zhì)的方法。迄今為止，絕大部分的脯氨酸特異 性蛋白酶都是從絲狀真菌發(fā)現(xiàn)的，如專利CN 101294153B，CN 103602605A，CN 103589741A 分別描述了來源于黑曲霉，米曲霉和煙曲霉的脯氨酸特異性蛋白酶。但是，上述專利中描述 的表達(dá)宿主都是畢赤酵母，由于脯氨酸特異性蛋白酶主要用于食品等領(lǐng)域，而畢赤酵母在 表達(dá)蛋白時(shí)，需要以甲醇為碳源進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，具有潛在的安全隱患，因此使用畢赤酵母生 產(chǎn)食品添加劑并不是優(yōu)選的。絲狀真菌作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品（如酶）為人們熟 知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于'通常認(rèn)為安全的'（Generally Recognized As Safe， GRAS)的特征而被廣泛用于表達(dá)宿主，因此工業(yè)上更加青睞黑曲霉和米曲霉用于生產(chǎn)脯氨 酸特異性蛋白酶。如專利CN 102046784B描述了利用黑曲霉表達(dá)來源于產(chǎn)黃青霉 (Penicillium chrysogenum)的脯氨酸特異性蛋白酶。
[0003] 在工業(yè)生產(chǎn)中，追求微生物最大化表達(dá)量蛋白質(zhì)或酶的意義重大，可以顯著降低 生產(chǎn)成本，并減少能源消耗和環(huán)境污染。一般情況下，可以通過傳統(tǒng)菌種誘變方法提高微生 物表達(dá)量，也可以通過基因工程手段提高：如利用強(qiáng)啟動(dòng)子，多拷貝基因，合適的信號肽等； 其中密碼子優(yōu)化也是提高表達(dá)量一種方法，如CN 101294153B，CN 103602605A，CN 103589741A分別描述了將黑曲霉，米曲霉和煙曲霉的脯氨酸特異性蛋白酶基因經(jīng)密碼子優(yōu) 化后，可以提高在畢赤酵母的表達(dá)水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)密碼子優(yōu)化的脯氨酸特異性蛋白酶基因。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對于黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，構(gòu)建的表 達(dá)盒導(dǎo)入到黑曲霉中進(jìn)行表達(dá)，能夠顯著提高其在黑曲霉中的表達(dá)量。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 高表達(dá)的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，具有如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所 示的核苷酸序列。
[0008] 編碼野生型黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 上述黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因密碼子優(yōu)化后核酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示，他們編碼相同的氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示。
[0009] 兩段人工合成基因 （SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3)，他們編碼黑曲霉脯氨酸特異性 蛋白酶，導(dǎo)入到黑曲霉中表達(dá)，其表達(dá)量比野生型基因 （SEQ ID NO.1)表達(dá)量至少提高5%， 優(yōu)選提高10 %，優(yōu)選高20 %，更優(yōu)選高40 %。
[0010] 包含所述黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞系。
[0011] 為了構(gòu)建脯氨酸特異性蛋白酶表達(dá)盒，需要特定的啟動(dòng)子，終止子，及調(diào)控序列： 如5 ' UTR，3 ' UTR等;上述元件的選擇和連接方式可通過參考本領(lǐng)域公開技術(shù)獲得。
[0012] 啟動(dòng)子可以是黑曲霉內(nèi)源啟動(dòng)子:如黑曲霉糖化酶啟動(dòng)子，中性淀粉酶啟動(dòng)子，酸 性淀粉酶啟動(dòng)子，α_葡萄糖苷酶啟動(dòng)子等;也可以是外源啟動(dòng)子:如米曲霉中性淀粉酶啟動(dòng) 子，米根酶糖化酶啟動(dòng)子;也可以是啟動(dòng)子變體:如黑曲霉中性淀粉酶變體。變體是指在野 生型序列基礎(chǔ)上通過插入、缺失或突變等方式對野生型序列中的核酸進(jìn)行改變后的序列。
[0013] 與啟動(dòng)子3'末端連接的可以是調(diào)控序列：如合適的前導(dǎo)序列（5'UTR)，即對于宿主 細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)，如米曲霉中性淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶前導(dǎo)序 列；
[0014] 優(yōu)選的終止子選自如下酶的基因的終止子:黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、黑 曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋 白酶。
[0015] 任一段人工基因，在與啟動(dòng)子，終止子相連接后形成表達(dá)盒。通過常規(guī)方法導(dǎo)入到 黑曲霉基因組中，可以隨機(jī)插入到基因組中，也可以定點(diǎn)整合到某個(gè)或多個(gè)基因座上。可選 的基因座有g(shù)la(糖化酶），amya(中性淀粉酶），amyb(中性淀粉酶），aa(酸性淀粉酶），agda(a 葡萄糖苷酶），agdb(a葡萄糖苷酶）。
[0016] 所述表達(dá)盒優(yōu)選地可以與一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記連接，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、 轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗 性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophy to auxotrophs)等。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選 擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶）、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶）、bar(草銨膦 phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hyg(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）、niaD(硝酸還原酶）（nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷_5'_磷酸脫駿酶）（orotidine_5'-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶）和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶（anthrani late synthase)以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉（Aspergillus ]11(1111&118)或米曲霉的&111(13和115^〇
[0017] 所述表達(dá)盒優(yōu)選地可以與一個(gè)或多個(gè)反向選擇標(biāo)記（負(fù)選擇標(biāo)記)連接。用于絲狀 真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫 羧酶），hsvTK(單純皰疹病毒胸苷激酶）。
[0018] 所述的重組表達(dá)載體為將上述的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因插入表達(dá)載體 得到的。
[0019] 所述的重組菌為將上述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌如黑曲霉或米曲霉中得到的。
[0020] 上述的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因在提高脯氨酸特異性蛋白酶表達(dá)量中的 應(yīng)用。
[0021] 上述的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在提高脯氨酸特異性蛋白酶 表達(dá)量中的應(yīng)用。
[0022] -種制備脯氨酸特異性蛋白酶的方法，將上述的轉(zhuǎn)基因重組菌發(fā)酵培養(yǎng)得到脯氨 酸特異性蛋白酶。
[0023]本發(fā)明中將DNA片段導(dǎo)入到宿主菌如黑曲霉或米曲霉內(nèi)的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方 法。
[0024]本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成兩段 人工基因，分別構(gòu)建的表達(dá)盒導(dǎo)入到黑曲霉中進(jìn)行表達(dá)，能夠顯著提高其在黑曲霉中的表 達(dá)量。
【附圖說明】
[0026] 圖1 pHphtk質(zhì)粒圖譜
[0027] 圖2 pGla-PepWT質(zhì)粒圖譜
[0028] 圖3 pGla-PepOPTl質(zhì)粒圖譜
[0029] 圖4 pGla_Pep0PT2質(zhì)粒圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例lpHphtk質(zhì)粒的構(gòu)建
[0031 ]該質(zhì)粒包含以下3部分，由GenScript公司構(gòu)建完成，質(zhì)粒圖譜見圖1。
[0032] (1 )pUC57質(zhì)粒Xbal-Pcil雙酶切后得到的2305bp片段；
[0033] (2)hph基因表達(dá)盒，序列見SEQ ID N0.5;
[0034] (3)HSV-tk表達(dá)盒，序列見SEQ ID N0.6。
[0035] 實(shí)施例2 整合質(zhì)粒 pGla-PepWT, pGla-PepOPTl 和 pGla_Pep0PT2 的構(gòu)建
[0036] 將脯氨酸特異性蛋白酶表達(dá)盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以進(jìn)行表達(dá)，使用糖化 酶啟動(dòng)子和糖化酶終止子。分別構(gòu)建pGla-PepWT，pGla-P印0PT1和pGla-Pep0PT2,可以使野 生型脯氨酸特異性蛋白酶序列PepWT(SEQ ID NO. 1)和人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列 Pep0PTl(SEQIDN0·2)以及Pep0PT2(SEQIDN0·3)置換黑曲霉糖化酶基因。P印WT(SEQID N0.1)、Pep0PTl(SEQIDN0.2)和Pep0PT2(SEQIDN0.3)由南京金斯瑞生物科技公司合成。 整合質(zhì)粒構(gòu)建方法如下:將pHphtk質(zhì)粒通過vector-F與vector-R引物進(jìn)行線性化；以黑曲 霉(來自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC2462)基因組為模板，通過ΟΙα-δ ' -F 和 Gla-PepWT-5 ' -R ，Gla-PepWT-3 ' -F 和 Gla-3 ' -R 分別擴(kuò)增糖化酶基 因側(cè)翼5 ' 和3 ' 序 列，每個(gè)片段長2000bp。利用P印WT-F和PepWT-R擴(kuò)增野生型脯氨酸特異性蛋白酶序列PepWT (SEQ ID NO. 1)。將上述線性化的pHphtk載體、糖化酶基因側(cè)翼5'片段、3'片段和PepWT片段 通過GibsonAss.e.mbly?Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)進(jìn)行重組，得到整合 質(zhì)粒pGla-P印WT，經(jīng)測序確認(rèn)序列，質(zhì)粒圖譜見圖2。以黑曲霉CICC2462基因組為模板，通過 Gla-5'-F 和 Gla-Pep0PTl-5'-R，Gla-Pep0PTl-3'-F 和 Gla-3'-R 分別擴(kuò)增糖化酶基因側(cè)翼 5' 和3'序列，每個(gè)片段長2000bp。利用Pep0PTl-F和Pep0PTl-R擴(kuò)增Pep0PTl(SEQIDN0·2)。將 上述線性化的pHphtk載體、糖化酶基因側(cè)翼5'片段、3'片段和PepOPTl片段通過Gibson As$.em.bly?Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)進(jìn)行重組，得到整合質(zhì)粒pGla-卩6?0?11，經(jīng)測序確認(rèn)序列，質(zhì)粒圖譜見圖3。以黑曲霉(：1〇：2462基因組為模板，通過61 &-5'-F 和 Gla-PepOPT2-5 ' -R，Gla-PepOPT2-3 ' -F 和 Gla-3 ' -R 分別擴(kuò)增糖化酶基因側(cè)翼5 ' 和3 ' 序 列，每個(gè)片段長2000bp。利用PepOPT2-F和PepOPT2-R擴(kuò)增PepOPT2 (SEQ ID NO. 3)。將上述線 性化的pHphtk載體、糖化酶基因側(cè)翼5'片段、3'片段和PepOPT2片段通過GibsonAssembly? Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)進(jìn)行重組，得到整合質(zhì)粒pGla_PepOPT2,經(jīng) 測序確認(rèn)序列，質(zhì)粒圖譜見圖4。糖化酶基因5'端側(cè)翼2kb DNA序列見SEQ ID NO. 7,其3'端 側(cè)翼2kb DNA序列見SEQ ID N0.8。
[0037] 相關(guān)引物序列如下：
[0038]
[0040] 實(shí)施例3PepWT，Pep0PTl和Pep0PT2整合到糖化酶基因座
[00411本實(shí)施例出發(fā)菌株為AND4L，是由CICC2462菌株經(jīng)敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基 因和酸性淀粉酶基因后獲得的。黑曲霉基因敲除/敲入方法可參考專利CN 103937766A或CN 104962594A實(shí)施例中公開的技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)。本實(shí)施例中PepWT，Pep0PTl和P印0PT2整合到糖 化酶基因座中與CN 10496 2 594A實(shí)施例使用相同方法實(shí)現(xiàn)，即參照Delmas(Appl EnvironMicrobiol. 2014,80(11): 3484-7)等人描述的方法。具體地，利用環(huán)狀DNA載體，包 含有agdB5'及3'側(cè)翼序列，選擇標(biāo)記，反向選擇標(biāo)記(或稱為負(fù)向選擇標(biāo)記），以及大腸桿菌 復(fù)制序列。將環(huán)狀載體轉(zhuǎn)入到黑曲霉中，通過正向選擇獲得重組菌株，再經(jīng)過反向選擇標(biāo)記 獲得基因敲除/敲入菌株。
[0042] 采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pGla-PepWT，pGla_PepOPTl和pGla_Pep0PT2分別導(dǎo)入，具 體操作步驟如下：
[0043] 原生質(zhì)體的制備:在營養(yǎng)豐富的TZ液體培養(yǎng)基（牛肉膏粉0.8%;酵母浸膏0.2%; 蛋白胨0.5% ;NaCl 0.2% ;蔗糖3% ;pH5.8)中培養(yǎng)黑曲霉菌絲體。通過mira-cloth (Calbiochem公司）從培養(yǎng)液中過濾菌絲體并用0.7M NaCl(pH5.8)洗滌，菌絲體濾干后轉(zhuǎn)移 至含纖維素酶1 % (Sigma)、蝸牛酶1 % (Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2%的酶解液(pH5.8)中， 30°C，65rpm酶解3h。然后將含有原生質(zhì)體的酶解液置于冰上并用四層擦鏡紙過濾，得到的 濾液經(jīng)3000印111， 8〇代&4°(：離心101^11后，棄上清；附著在管壁上的原生質(zhì)體用31'(：溶液（11 D-Sorbitol、50mM CaCl2、10mM Tris，pH7.5)洗滌一次，最后把原生質(zhì)體重懸于適量的STC 溶液中。
[0044] 分別將環(huán)狀 pGla-PepWT，pGla-PepOPTl 和 pGla-Pep0PT2 質(zhì)粒 10μ1 (濃度為：100ng/ μL)加入到1〇〇μ1原生質(zhì)體懸浮液中混勻后室溫放置25min;然后分3次共加入900μ1 PEG溶 液，混勾后室溫放置25min; 3000rpm，常溫離心10min，棄上清，原生質(zhì)體附著于管壁上，將其 重懸于lml STC溶液中。把該懸浮液與預(yù)先降溫至45°C左右的TB3培養(yǎng)基(酵母浸膏0.3%、 酸水解酪蛋白0.3%、蔗糖20%、瓊脂0.7%)混合并鋪平板;待平板凝固后放入34 °C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng);24h后在平板上再鋪一層含300ngAU潮霉素(Hygromycin)的TB3固體培養(yǎng)基(瓊脂 1%，其余成分同上），繼續(xù)將平板置于34 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5天后，長出上層培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化 子稱為整合轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取幾個(gè)整合轉(zhuǎn)化子分別傳代于含300ngAU潮霉素的TB3固體培 養(yǎng)基上，34°C恒溫培養(yǎng)3天后，收集菌絲體用液氮冷凍后研磨粉碎，然后用真菌基因組提取 試劑盒(杭州博日科技有限公司）提取整合轉(zhuǎn)化子基因組DNA，最后對整合轉(zhuǎn)化子基因組DNA 進(jìn)行 PCR 鑒定，鑒定引物為 Pep_5test_F 與 物經(jīng)測序后確認(rèn)整合到糖化酶基因座。
[0045] 相關(guān)引物序列如下：
[0046]
[0047] 將確認(rèn)的陽性轉(zhuǎn)化子挑取適量碎菌絲放于含lml無菌水的離心管中，渦旋振蕩使 之形成菌絲懸液，取1〇〇μ1涂布于含1〇μΜ 5-F2dU(5_氟-2-脫氧尿嘧啶核苷，廠家:Sigma)的 TB3固體平板上，34°C恒溫培養(yǎng)4-5天，即有敲除轉(zhuǎn)化子長出。轉(zhuǎn)化子在10μΜ 5-F2dU平板上 傳兩代（防止轉(zhuǎn)化子不純）后，在300ngAU潮霉素平板上應(yīng)不能生長;然后對敲除轉(zhuǎn)化子基 因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，引物序列及基因組提取方法同上。使用Pep-5test-F和Pep-3test-R 進(jìn)行PCR鑒定，陽性轉(zhuǎn)化子產(chǎn)物應(yīng)為5.8kb，而陰性轉(zhuǎn)化子為6.3kb。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR產(chǎn)物測 序后確認(rèn)，從而得到AND4L-P印WT，AND4L-P印0PT1和AND4L-P印0PT2菌株。
[0048] 實(shí)施例 4AND4L-PepWT，AND4L-PepOPTl 和 AND4L-Pep0PT2 菌株搖瓶發(fā)酵
[0049] 將實(shí)施例3中獲得的AND4L-PepWT，AND4L-PepOPTl和AND4L-Pep0PT2菌株分別接種 至含50ml YPM培養(yǎng)基(2g/L酵母提取物，2g/L蛋白胨，2 %的麥芽糖）的搖瓶中，34°C，220rpm 培養(yǎng)六天，取上清進(jìn)行活力測定。稱取〇.〇171g Z-Gly-Pr〇-pNA(N-卞氧羰基-甘氨酸-脯氨 酸-硝基苯胺，百靈威生物科技有限公司），加入4ml二惡烷溶解，加入6mlPH4.0檸檬酸-磷酸 氫二鈉緩沖溶液溶解，使得Z-Gly-Pro-pNA濃度為4mM，在lml 100mM梓檬酸-磷酸氫二鈉 (pH 5.0)中，加入0.25ml上述底物，在37°C預(yù)熱3min，加入0. lml酶液，立即計(jì)時(shí)反應(yīng)lOmin后，立 即加入碳酸鈉溶液3ml，在410nm下測定樣品吸光度，即可計(jì)算酶活力?；盍Χx為ρΗ5·0 37 °〇條件下每分鐘從Z-Gly-Pro-pNA釋放ΙμΜ pNA所用的酶量為一個(gè)酶活力單位，以U表示。搖 瓶相對活力如表1所示，AND4L-PepOPTl和AND4L-PepOPT2菌種都表現(xiàn)出較高活力。
[0050] 表 1 AND4L-PepWT，AND4L-PepOPT 1 和 AND4L-Pep0PT2菌株活力對比
[0051]
[0052] 本發(fā)明通過對黑曲霉特異性蛋白酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得兩條人工合成 序列，組成的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入到黑曲霉中，都表現(xiàn)出了更高的發(fā)酵活力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高表達(dá)的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因，具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列。2. 包含權(quán)利要求1所述黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組 菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于為將權(quán)利要求1所述的黑曲霉脯氨 酸特異性蛋白酶基因插入表達(dá)載體得到的。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組菌，其特征在于為將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中 得到的。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述的宿主菌選自黑曲霉或米曲霉。6. 權(quán)利要求1中所述的黑曲霉脯氨酸特異性蛋白酶基因在提高脯氨酸特異性蛋白酶表 達(dá)量中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在提高脯氨酸特異 性蛋白酶表達(dá)量中的應(yīng)用。8. -種制備脯氨酸特異性蛋白酶的方法，其特征在于將權(quán)利要求2中所述的重組菌發(fā) 酵培養(yǎng)得到脯氨酸特異性蛋白酶。
【文檔編號】C12R1/685GK106086049SQ201610628459
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月3日 公開號201610628459.5, CN 106086049 A, CN 106086049A, CN 201610628459, CN-A-106086049, CN106086049 A, CN106086049A, CN201610628459, CN201610628459.5
【發(fā)明人】白挨璽, 張垠, 卞芙蓉, 王彩梅, 孫艷, 徐紅
【申請人】南京百斯杰生物工程有限公司