攜帶muc1腫瘤抗原表位pdtrp的嵌合型病毒樣顆粒及在胰腺癌中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體是一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒及其在胰腺癌中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒的制備，并成功誘導(dǎo)持久的體液及細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，易于推廣。
【專利說明】
攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒及在胰腺 癌中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位 PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒及在胰腺癌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是消化系高度惡性腫瘤，預(yù)后差。積極尋找治療胰腺癌的有效方法成為國 際熱點(diǎn)問題。MUC1是Mucins粘蛋白家族成員，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及其來源的腫瘤細(xì) 胞表面，由多肽核心和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。其核心肽胞外段含有許多2 0個(gè)氨基酸 (SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT)的串聯(lián)重復(fù)序列（variable numbers of tandem repeat， VNTRs)。糖鏈占 MUC1蛋白重量的50%以上，多以0-型糖苷鍵與肽骨架連接。正常組織如乳 腺、前列腺、卵巢、胰腺等，MUC1分布于腺管上皮細(xì)胞分泌極，與免疫細(xì)胞相對(duì)隔離，糖基化 豐富；而在腫瘤組織，其廣泛分布并異常豐富地表達(dá)于細(xì)胞表面，糖基化不完全，因此暴露 出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)。MUC1核心肽的TOTRP表位既能被多種 MUC1抗體識(shí)別，也可被CTL(cytotoxic lymphocyte)細(xì)胞識(shí)別和殺傷，且不受MHC限制。因此 MUC1 是較理想的抗腫瘤革E1 分子（Taylo Papadimitriou J，Burchell J,Miles DW，et al .MUC1 and cancer .Biochim Biophys Acta，1999，1455: 3012313)。由于PDTRP是一小分 子量短肽，不能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，因此尋找一個(gè)合適的基因載體，使抗原表位能夠有效 的表達(dá)和被遞呈亦是基因免疫誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。
[0003] 乙肝病毒核心蛋白（HBc)可自我組裝形成亞病毒顆粒，成為能高表達(dá)外源表位的 載體。插入各種不同外源表位的HBc融合蛋白仍可保持其原有特性，形成嵌合體病毒樣顆粒 (virus-like particles，VLP)并刺激產(chǎn)生針對(duì)外源表位的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)(Yang R.， Murillo F.M.,Lin K.Y,et al.Human papillomavirus type-16 virus-like particles activate complementary defense responses in key dendritic cell subpopulations.J Immunol.2004.173,2624-2631.)
[0004] 目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道用生物工程方法制備攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病 毒樣顆粒疫苗，也尚無文獻(xiàn)報(bào)道將該疫苗用于預(yù)防或治療胰腺癌的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒， 本發(fā)明的另一目的在于提供該攜帶MUC1腫瘤抗原表位TOTRP的嵌合型病毒樣顆粒在防治胰 腺癌中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，MUC1腫瘤表位TOTRP cDNA可以與HBc-VLP的cDNA重組并在大 腸菌中表達(dá)出攜帶roTRP的嵌合體VLP疫苗。
[0007] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：將MUC1腫瘤表位PDTRP cDNA與HBc-VLP的cDNA重組并 在大腸菌中表達(dá)出攜帶roTRP的嵌合體VLP，研究本發(fā)明構(gòu)建的VLP疫苗在治療胰腺癌中的 作用。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位roTRP的重組基因，所述重組 基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0009] 所述的重組基因是將PDTRP對(duì)應(yīng)的基因序列插入到截?cái)嗟腍Bc的第72個(gè)氨基酸的 第2和第3個(gè)堿基之間。
[0010] 本發(fā)明的第二方面，提供一種重組載體，所述的重組載體包含上述攜帶MUC1腫瘤 抗原表位H)TRP的重組基因，所述的載體為PET28a載體。
[0011] 本發(fā)明的第三方面，提供一種重組菌，所述的重組菌中包含上述重組載體，所述的 菌為大腸桿菌。
[0012]本發(fā)明的第四方面，提供一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒， 所述的嵌合型病毒樣顆粒由上述重組菌表達(dá)。
[0013]所述的攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒是通過以下方法制備得 到的：
[0014] A、目的基因獲取(利用基因合成）：根據(jù)GeneBank網(wǎng)站上公布的HBV的基因序列，查 找HBc第1個(gè)氨基酸至第144氨基酸對(duì)應(yīng)的基因序列（SEQ ID N0:1)，同時(shí)查找MUC1序列獲取 核心肽PDTRP編碼的cDNA序列（SEQ ID N0:2);
[0015] B、將roTRP對(duì)應(yīng)的基因序列插入到截?cái)嗟腍Bc的第72和第73三個(gè)氨基酸之間，基因 序列如SEQ ID N0:3所示;其中第216-230位為TOTRP對(duì)應(yīng)的基因序列；
[0016] C、基因合成完畢后將合成好的序列直接連接到PET28a載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，開始 進(jìn)行后續(xù)的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；
[0017] D、蛋白誘導(dǎo)表達(dá):將構(gòu)建好的嵌合型載體PET28a-HBcP轉(zhuǎn)化到BL21感受細(xì)胞，搖菌 后菌體誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，在確定誘導(dǎo)蛋白后，將重組蛋白大量純化。
[0018] 本發(fā)明的第五方面，提供上述重組基因、重組載體、重組菌或攜帶MUC1腫瘤抗原表 位roTRP的嵌合型病毒樣顆粒在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的第六方面，提供一種疫苗，所述的疫苗的活性成分為上述攜帶MUC1腫瘤 抗原表位roTRP的嵌合型病毒樣顆粒。
[0020] 本發(fā)明提供了一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒的制備，并 成功誘導(dǎo)持久的體液及細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，易于推廣。
【附圖說明】
[0021] 圖1.質(zhì)粒圖譜；
[0022]圖2.酶切驗(yàn)證結(jié)果；
[0023] 圖3 .蛋白的體外誘導(dǎo)檢測(cè)結(jié)果：注：1:蛋白m; 2 : Oh對(duì)照；3: 2h(0.3mMIPTG); 4: 4h (0.3mMIPTG)；5：2h(0.5mMIPTG)；6：4h(0.5mMIPTG)；
[0024] 圖4.WB檢測(cè)重組的HBc蛋白；
[0025] 圖5.SDS-PAGE 鑒定嵌合體 HBc-VLP;
[0026] 圖6上1^13六結(jié)果顯示嵌合型邢(3，1^疫苗產(chǎn)生的11^12及正對(duì)農(nóng)度增加；
[0027] 圖7.不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤形成情況，A.注射攜帶MUC1的胰腺癌嵌合型疫苗，B. 注射不攜帶MUC1的胰腺癌疫苗。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0031] 表 1
[0032]
[0033]
[0034] 1、嵌合型HBc-VLP基因合成
[0035] a、基因合成的相關(guān)信息:基因名稱:HBcP基因長度:459bp，克隆載體:pET28a，克隆 位點(diǎn):Ndel/Xhol，克隆載體抗性:Kan，結(jié)構(gòu)圖（圖1)。
[0036] b、亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的 特點(diǎn)。該方法是在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是沿待合成引物的3'端向5 '端合成，相鄰的核苷酸通過3 ' -5 '磷酸二酯鍵連接。
[0037] c、載體構(gòu)建:將合成目的基因片段和載體分別用限制性內(nèi)切酶Xhol和Nde頂每切
[0038]酶切體系： 片段（載體） 35μ1 Xho 丨 5μ1 Ndel 5μ1
[0039] 10*Η 10μ1 BSA ΙΟμΙ Λ：崗水 35μ1
[ο040] 37?水濟(jì) 2h 30min、-.
[0041 ] d、連接：
[0042] 連接體系： 片段（合成基因） 5μ1 載體（Pet-28) 3μ1
[0043] Τ4 連接酶 ΙμL 跡接 buffer ΙμL 16°C過夜連接。
[0044] e、轉(zhuǎn)化:從-70 °C冰箱中取200uL感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置 于冰上，加入質(zhì)粒，輕輕搖勻，冰上放置30min.管中加入lmLLB，混勻后37 °C培養(yǎng)lh，使細(xì)菌 恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素基因（氨芐青霉素），將上述菌液搖勻后取 1 OOuL涂布于平板，37 °C培養(yǎng)16-24h。
[0045] f、測(cè)序獲得重組載體的全序列：（反向互補(bǔ)）（SEQ ID N0:4)。
[0046] h、酶切驗(yàn)證（圖2)。
[0047] 基因合成完畢后將合成好的序列直接連接到PET28a載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。
[0048] 結(jié)合圖1和圖2,嵌合型HBc-VLP基因合成的結(jié)果顯示，合成好的許褳已經(jīng)連接到 PET28a載體上，經(jīng)過酶切和測(cè)序后驗(yàn)證成功。
[0049] 2、蛋白的體外誘導(dǎo)
[0050] 2.1構(gòu)建好的嵌合型載體PET28a-HBcP轉(zhuǎn)化BL21感受細(xì)胞
[0051 ] 轉(zhuǎn)化步驟如下：
[0052] a、取一管制備好的感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍5-10min，用無菌槍頭在超凈臺(tái)內(nèi)將 連接產(chǎn)物全部吸取加入到感受態(tài)細(xì)胞中，用手指彈勻，插入冰上30min;
[0053] b、取樣品插入漂浮板上，于42°C恒溫水浴鍋熱激1.5min，快速放回冰上3-4min;
[0054] c、取400yL無抗生素的液體LB培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)內(nèi)加入到EP管中，置于37 °C恒溫?fù)u 床，100轉(zhuǎn)，預(yù)表達(dá)50min左右；
[0055] d、超凈臺(tái)內(nèi)取200yL預(yù)表達(dá)的菌液涂布在含Kan抗生素的固體LB平板上，在37 °C恒 溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)12-15h;
[0056] 2.2蛋白表達(dá)
[0057] a、挑陽性菌接種到5mL的LB加 Amp的液體培養(yǎng)基中，37°C活化菌液；
[0058] b、次日，按照100mL的LB加 Amp轉(zhuǎn)接lmL的菌進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37 °C搖菌2h(0D值為0.4左 右)；
[0059] c、超凈臺(tái)內(nèi)取一管菌液作為Oh的對(duì)照，同時(shí)加 IPTG，使其終濃度為0.5mM;
[0060] d、把菌液再放入37°C搖床，每隔兩小時(shí)取1管菌液，連續(xù)取三次，并做好標(biāo)記；
[00611 e、將零小時(shí)的和所取的誘導(dǎo)菌，高速離心30s，去上清，存放_(tái)20°C。
[0062] 2.3跑變性膠檢測(cè)誘導(dǎo)的蛋白（圖3，4)
[0063] a、取零小時(shí)的和誘導(dǎo)的菌，加1 X SDS上樣緩沖液1 OOyL(用2 X的現(xiàn)配現(xiàn)用，并加適 量的DTT防止S-S鍵的形成），震蕩，使菌懸浮，在沸水浴中煮5min，高速離心3min，即為制備 好的樣品；
[0064] b、取配套的蛋白膠板，洗凈吹干，用對(duì)應(yīng)的制膠器將膠板架好；
[0065] c、配制10%的變性膠。根據(jù)說明書，先配5mL的下層膠加入膠板（膠面距離頂端 1.5-2cm用于加上層膠），再加 lmL的去離子水使膠面壓平，待下層膠凝好時(shí)，倒掉上面的水， 并用吸水紙吸干凈，配制2mL的上層膠加入膠板，并插入對(duì)應(yīng)的梳子，15min左右，上層膠就 凝好。
[0066] d、垂直拔掉梳子，將制備好的膠放入蛋白電泳槽內(nèi)，加入適量的蛋白電泳液，取20 μL樣品的上清進(jìn)行點(diǎn)樣；
[0067] e、先用60V電壓跑，等溴酚藍(lán)跑到上層膠和下層膠的交界處時(shí)，換用80V電壓跑，直 到溴酚藍(lán)跑到膠板底部邊緣處即可拆膠。
[0068] f、用考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色液染色3_4h(過夜染色也可以），再用脫色液脫色，直 至條帶清晰(期間要更換2-3遍脫色液）。
[0069] g、觀察結(jié)果并拍照。
[0070] 結(jié)合圖3和圖4,表達(dá)后的蛋白大小為我們所需的目的蛋白。
[0071] 3、重組蛋白的大量純化
[0072] a、取誘導(dǎo)好的菌液200mL，12000rpm，4°C，離心5min;
[0073] 13、棄上清，加131^€61'重懸（10〇1111^菌加81111^柱131^€61')，并加溶解酶至終濃度為111^/ mL，置于冰上30分鐘，讓細(xì)胞壁溶解充分；
[0074] c、用高壓破碎儀破碎細(xì)胞3-4遍，12000rpm，4°C，離心15min;
[0075] d、取上清于新的管中，加樹脂進(jìn)行蛋白結(jié)合反應(yīng)。
[0076] e、用漂洗buffer漂洗結(jié)合的蛋白3-4次；
[0077] f、用洗脫buffer洗脫結(jié)合的目的蛋白。
[0078] 4、蛋白定量
[0079] 用BCA蛋白定量試劑盒定量所純化的蛋白。
[0080] a、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑：
[0081] 表 2
[0082]
[0083] b、根據(jù)樣品數(shù)量，將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液，充分 混勻；
[0084] c、各孔加入160μ1 BCA工作液；
[0085] d、把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37°C放置30分鐘，然后在562nm下測(cè)定吸光 度。以吸光值為橫坐標(biāo)，蛋白濃度(yg/μL)為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0086] e、在酶標(biāo)板中加入2μ1待測(cè)蛋白和18μ1 roS(稀釋10倍），加入160μ1 BCA工作液， 把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩3〇SeC，37°C放置30分鐘，然后在562nm下測(cè)定吸光度。
[0087] f、根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白濃度(yg/yl)，乘以 樣品稀釋倍數(shù)(10)即為樣品實(shí)際濃度(單位:yg/yl)。
[0088] g、用復(fù)性緩沖液稀釋所純化的蛋白至2mg/ml。
[0089] h、復(fù)性蛋白溶液用雙蒸水進(jìn)行透析去除尿素，透析時(shí)每隔4小時(shí)換一次雙蒸水，共 三次。
[0090] i、將復(fù)性的蛋白用BCA試劑盒定量。
[0091] 5、制備的嵌合體HBc-VLP的鑒定（圖5)
[0092] a、PAGE膠的制備
[0093] b、上樣及電泳
[0094] c、轉(zhuǎn)膜
[0095] d、膜上蛋白的檢測(cè)
[0096] e、膜的封閉及抗體孵育
[0097] f、顯色:按照DAB顯色試劑盒的使用說明書配制顯色試劑盒，進(jìn)行顯色反應(yīng)。
[0098] 結(jié)合圖5,嵌合體HBc-VLP的鑒定結(jié)果是嵌合體HBc-VLP能夠獲得純化的蛋白。
[0099] 6、ELISA檢測(cè)TOTRP多肽免疫小鼠后炎性因子的表達(dá)
[0100] a.取免疫后小鼠的血清，離心后備用。
[0101] b.將準(zhǔn)備好的試劑盒提取20min從冰箱中取出，平衡至室溫；
[0102] c.分別設(shè)好空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕?biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液100yL，余 孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品l〇〇yL，注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量 不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37 °C孵育90分鐘。
[0103] d.棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液100yL (在使用前 15分鐘內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37°C溫育1小時(shí)。
[0104] e.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μLν每孔，甩干并在吸 水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0105] f.每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前15分鐘內(nèi)配制）100yL，加上覆膜，37°C溫育30分 鐘。
[0106] g.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
[0107] h.每孔加底物溶液(TMB)90yL，酶標(biāo)板加上覆膜37°C避光孵育15分鐘左右。
[0108] i.每孔加終止液50yL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與 底物溶液的加入順序相同。
[0109] j .立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測(cè)量各孔的光密度(0D值）。
[0110] 結(jié)合圖6,炎性因子的檢測(cè)結(jié)果是免疫后，可以分別提高小鼠體內(nèi)血清中IL-12和 IFN- γ的表達(dá)量
[0111] 7. CCK-8驗(yàn)證roTRP誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用
[0112] a.斷頸處死小鼠后，分離小鼠的淋巴細(xì)胞。
[0113] b.用1ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋200倍計(jì)數(shù)。
[0114] c.按適當(dāng)密度種至培養(yǎng)皿中，37度，5 % C02培養(yǎng)。
[0115] d.體外TOTRP抗原多次刺激，3天后用CCK8的法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的特異性增殖。
[0116] 結(jié)合表3, CCK8的方法驗(yàn)證TOTRP的結(jié)果是PDTRP能夠誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答作 用。
[0117] 表3 CCK8的方法驗(yàn)證roTRP誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答作用
[0118]
[0119]實(shí)施例2
[0120] PDTRP多肽能夠在胰腺癌細(xì)胞成瘤后保護(hù)BALB/c小鼠
[0121] 帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP基因的胰腺癌嵌合型HBc-VLP疫苗和不含MUC1腫瘤抗 原表位TOTRP的HBc-VLP對(duì)照分別于第0周和第四周體內(nèi)免疫，在末次免疫后第2周，皮下接 種PANC1-PDTRP腫瘤細(xì)胞，觀察不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤形成情況。
[0122] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0123] 見圖7,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：與陰性對(duì)照相比，注射攜帶MUC1的嵌合型疫苗對(duì)瘤細(xì)胞 的致瘤起到抑制作用。
[0124] 以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的重組基因，其特征在于，所述重組基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO:3所示。2. -種重組載體，其特征在于，所述的重組載體包含權(quán)利要求1所述的重組基因，所述 的載體為PET28a載體。3. -種重組菌，其特征在于，所述的重組菌中包含權(quán)利要求2所述的重組載體，所述的 菌為大腸桿菌。4. 一種攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒，所述的嵌合型病毒樣顆粒 由權(quán)利要求3所述的重組菌表達(dá)。5. 如權(quán)利要求1所述的重組基因在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求2所述的重組載體在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求3所述的重組菌在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求4所述的攜帶MUC1腫瘤抗原表位PDTRP的嵌合型病毒樣顆粒在制備治療 胰腺癌藥物中的應(yīng)用。9. 一種疫苗，所述的疫苗的活性成分為權(quán)利要求4所述的攜帶MUC1腫瘤抗原表位TOTRP 的嵌合型病毒樣顆粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK106086050SQ201610485376
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】孫暢, 李兆申
【申請(qǐng)人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)