專利名稱：一種紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)橙色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)橙色素的方法，屬于生物工程和色素制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紅曲色素目前已確定結(jié)構(gòu)的六種成分為橙色素(紅斑紅曲素、紅曲玉紅素)、黃色素(紅曲素、黃紅曲素)、紫色素(紅斑紅曲胺和紅曲玉紅胺)。其研究已經(jīng)較為成熟，其在食品上的應(yīng)用多是利用紅曲色素中的紅色素作為著色劑，是一種混合色素。
在紅曲色素的混合色素中，橙色素是一種最為鮮艷奪目的色素。如果用于食品或其它需要著色的產(chǎn)品，可以為其增加一種可供選擇的鮮艷色調(diào)。而且宮慧梅及L.Martinkova等都提到橙色素具有一定的抑菌性，能夠抑制革蘭氏陽性菌以及大腸桿菌，其原理被認(rèn)為可能是紅曲色素與蛋白質(zhì)類物質(zhì)結(jié)合在一起，以至于使蛋白質(zhì)變性，抑制細(xì)菌生長起到防腐等作用。因此它是紅曲中一種主要的抑菌物質(zhì)，其抑菌性與吸光度呈正相變化。另外，Carels和Shepherp認(rèn)為紅色素、黃色素都是由橙色素經(jīng)化學(xué)氧化而得來的，即橙色素是紅曲色素合成中的一個(gè)重要中間體。
橙色素是紅曲色素生物合成途徑中的一個(gè)中間成分，性質(zhì)比較活潑，易被氧化或還原而成黃色素或紅色素。作為一種橙色調(diào)的紅曲色素，目前在國內(nèi)外僅限于小樣生產(chǎn)，均未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，在食品及其它領(lǐng)域的應(yīng)用上也未得到充分的開發(fā)研究，但因其顏色較為獨(dú)特、醒目，在著色劑行業(yè)應(yīng)用前景廣闊，是值得開發(fā)的紅曲色素品種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了尋找一種高效生產(chǎn)紅曲橙色素且可以大批量生產(chǎn)的方法。主要工藝路線利用紅曲菌，通過深層通風(fēng)發(fā)酵改變培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件生產(chǎn)出以橙色調(diào)(紅斑紅曲素或紅曲玉紅素)為主的紅曲色素。
本發(fā)明技術(shù)方案采用紅曲橙色素的液態(tài)深層發(fā)酵及噴霧干燥方法。
(1)菌種以紅曲霉菌(Monascus spp.)9903為出發(fā)菌種，該菌種已在“食品與生物技術(shù)”第21卷第1期P43-47，2002年1月公開，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院提供。
(2)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基。
基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO4，1～5g/L；K2HPO4，1～5g/L；MgSO4·7H2O，0.2～0.8g/L；CaCl2，0.05～0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；ZnSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；MnSO4·H2O，0.015～0.06g/L，NaNO3，1～4g/L，pH3.0～6.0。
(3)搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40～80g/L作為碳源，硫酸銨2～6g/L作為氮源，初始pH3.0～6.0，裝液量100mL/500mL三角瓶，培養(yǎng)基經(jīng)過糊化后進(jìn)行接種，接種量孢子懸浮液4mL，30℃往復(fù)式搖床，行程10cm，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間3.5～5.5天。
(4)15L發(fā)酵罐發(fā)酵通風(fēng)量20～40L/min，培養(yǎng)溫度28～32℃，轉(zhuǎn)速200～400r/min，接種量5％，培養(yǎng)90～120小時(shí)，培養(yǎng)基同搖瓶發(fā)酵所用培養(yǎng)基，并在使用前進(jìn)行糊化，發(fā)酵罐的有效裝液量為10L，底液量為7L，在發(fā)酵過程中再流加糊化的培養(yǎng)基，發(fā)酵18小時(shí)開始流加操作，流加速度為0.03L/h。
最佳的發(fā)酵條件為搖瓶發(fā)酵和15L發(fā)酵罐發(fā)酵所用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40g/L作為碳源，硫酸銨2g/L作為氮源，初始pH6.0；搖瓶發(fā)酵時(shí)間為4.0天，15L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)間為108小時(shí)。
(5)噴霧干燥發(fā)酵液進(jìn)行高壓均質(zhì)，壓力為3kgf/cm2，或膠體磨將菌體破碎后，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計(jì)為0.02～0.06，進(jìn)風(fēng)溫度170～200℃，出口溫度70～100℃，噴頭壓力1～4kgf/cm2，流速1.5～3.0L/h，噴霧干燥得到粉末狀橙色素產(chǎn)品(I)。
或(6)將步驟(4)所得發(fā)酵液進(jìn)行精制發(fā)酵液經(jīng)超聲波破碎或高壓均質(zhì)后將細(xì)胞破碎，釋放出胞內(nèi)的色素，5000r/min、20min高速離心得菌絲體，用甲醇或乙醇進(jìn)行萃取，萃取3次至溶液無明顯橙色，過濾后合并濾液，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計(jì)為0.02～0.06，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥條件同步驟(5)，得色調(diào)高一些的粉末狀橙色素產(chǎn)品(II)。
或萃取后的合并濾液繼續(xù)進(jìn)行板層析分離，選用G-60型硅膠作為板層析介質(zhì)真空濃縮至橙色素色價(jià)為3000～4500U/mL，濃縮液用于第一次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，刮下顯橙色的譜帶Rf＝0.7941，再用甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液旋轉(zhuǎn)濃縮至橙色素色價(jià)3000～4500U/mL，濃縮液用于第二次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結(jié)晶(III)。
或萃取后的合并濾液繼續(xù)進(jìn)行柱層析分離，選用青島產(chǎn)硅膠作為柱層析介質(zhì)柱子型號(hào)為28mm×500mm，最大上樣量為色價(jià)在3000～4500U/mL的橙色素濃縮液4～8mL，流動(dòng)相為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之間，收集顯橙色的流出液，流出液旋轉(zhuǎn)濃縮至橙色素色價(jià)3000～4500U/mL，濃縮液用于板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結(jié)晶(III)。
橙色素精制工藝中用溶劑浸提，食品行業(yè)用的橙色素產(chǎn)品均用乙醇進(jìn)行浸提，化工及其它行業(yè)使用的橙色素產(chǎn)品用甲醇進(jìn)行浸提。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用一株高產(chǎn)色素的紅曲菌9903，為生產(chǎn)以橙色素為主的紅曲色素，并提高橙色素含量進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化及液態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，以期為以后橙色素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及在食品色素開發(fā)應(yīng)用上做基礎(chǔ)工作。另外，對(duì)橙色素的噴霧干燥工藝及其精制也進(jìn)行了研究，得到了較純的橙色素，希望為其開拓更為廣泛的用途，如應(yīng)用于飲料、化妝品(如口紅)等產(chǎn)品中。
紅曲高產(chǎn)橙色素的搖瓶實(shí)驗(yàn)，確定出高產(chǎn)橙色素的菌種及以無機(jī)氮源為唯一氮源的培養(yǎng)基配方；紅曲橙色素的液態(tài)深層發(fā)酵，確定出工業(yè)化生產(chǎn)紅曲橙色素的操作工藝參數(shù)；一步法噴霧干燥的紅曲橙色素產(chǎn)品的制備參數(shù)指標(biāo)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲橙色素的色價(jià)(15L罐)三罐平均穩(wěn)定達(dá)到100U/mL以上，發(fā)酵液經(jīng)噴霧干燥后所得產(chǎn)品色價(jià)為1000U/g，色調(diào)OD465nm/OD510nm大于1。
在15L的發(fā)酵罐中發(fā)酵液色價(jià)達(dá)到121.7U/mL，色調(diào)值達(dá)到1.13；經(jīng)不同精制途徑得到不同色價(jià)及色調(diào)的橙色素產(chǎn)品，直接噴霧干燥得到的橙色素產(chǎn)品(I)色價(jià)達(dá)到1030.75U/g，色調(diào)值達(dá)到1.99；經(jīng)過萃取而后噴霧干燥的橙色素產(chǎn)品(II)色價(jià)高達(dá)2000U/g以上，色調(diào)高達(dá)2.45；產(chǎn)品(III)得到了純的橙色素針狀結(jié)晶。


圖1橙色素產(chǎn)品(III)全波長掃描圖。
圖2橙色素產(chǎn)品(III)的液相色譜圖。
圖3橙色素產(chǎn)品(III)的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.培養(yǎng)基優(yōu)化碳源對(duì)產(chǎn)橙色素的影響選擇葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糯米粉、麥芽糖和糊精為碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。碳源濃度50g/L，培養(yǎng)基的其他配比見基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。在以玉米淀粉作為9903菌種發(fā)酵的碳源時(shí)，橙色素色價(jià)及菌體量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于采用其他碳源時(shí)，說明玉米淀粉很可能不僅僅對(duì)菌體的生長作貢獻(xiàn)，更重要的是對(duì)橙色素這個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成起到積極的作用，玉米淀粉的這種影響可能是玉米淀粉的成分較復(fù)雜，而所含的無機(jī)或有機(jī)成分也較多，對(duì)紅曲霉而言營養(yǎng)成分更加齊全，因而更有利于橙色素的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。由此確定，玉米淀粉為最佳產(chǎn)橙色素碳源。糯米粉中則因可能含有有機(jī)氮源，致使一部分所生成的橙色素與氨基酸結(jié)合生成紅色素。
培養(yǎng)基中不同濃度的玉米淀粉對(duì)紅曲霉9903產(chǎn)橙色素的影響，分別選取了20，40，60，80g/L五個(gè)濃度水平，另外嘗試玉米淀粉與葡萄糖的不同配比。通過考慮橙色素色價(jià)的高低及色調(diào)，最終選用濃度為40～80g/L的玉米淀粉作為培養(yǎng)基的碳源。
氮源對(duì)產(chǎn)橙色素的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同氮源對(duì)橙色素產(chǎn)量的影響因氮源種類不同而不同，色澤也有很大差異。在實(shí)驗(yàn)的8種氮源中，四種有機(jī)氮源(蛋白胨、味精、玉米漿、酵母膏)產(chǎn)橙色素色價(jià)幾乎都低于使用四種無機(jī)氮源(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉)時(shí)產(chǎn)橙色素，且顏色均顯紅色，色調(diào)(OD465nm/OD510nm)均小于1。而使用無機(jī)氮源時(shí)，硝酸銨和硝酸鈉的色價(jià)相對(duì)于硫酸銨和氯化銨又較低，且其色調(diào)小于1。使用硫酸銨時(shí)不僅色價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它氮源，而且色調(diào)也相對(duì)較高，達(dá)到1.68，因此選其作為產(chǎn)橙色素氮源。同時(shí)又進(jìn)一步確定了產(chǎn)橙色素最高時(shí)的硫酸銨濃度為2～6g/L。
使用有機(jī)氮源時(shí)，橙色素色價(jià)低，主要原因是有機(jī)氮源中含較多的其它氨基酸，這會(huì)與所生成的橙色素進(jìn)一步合成為紅色素，使橙色素減少。
硫酸銨作氮源，色價(jià)值高的原因主要是銨離子被利用后，硫酸根離子存在于發(fā)酵液中，可使發(fā)酵液保持在酸性。這種酸性可使紅曲菌處于更佳的生理狀態(tài)。
培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)橙色素的影響紅曲菌的發(fā)酵過程中，發(fā)酵液大多數(shù)時(shí)間是處于酸性范圍內(nèi)，因此在弱酸性的培養(yǎng)基初始條件下，比較易于菌體的生長，產(chǎn)橙色素色價(jià)也相對(duì)較高，隨著pH值升高，橙色素色價(jià)逐漸下降。色調(diào)則隨pH值升高而一直呈下降趨勢。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定培養(yǎng)基的初始pH為3.0～6.0。
不同取樣時(shí)間對(duì)產(chǎn)橙色素的影響在以上試驗(yàn)的基礎(chǔ)上測定紅曲菌9903產(chǎn)橙色素的生長曲線，我們可以看出在3天前橙色素產(chǎn)量隨時(shí)間增長而快速增長，在3～5.5天左右處于平穩(wěn)生產(chǎn)期，在5.5天之后就有急劇下降，由此可以看出橙色素應(yīng)屬于紅曲菌9903的一個(gè)次級(jí)代謝中間產(chǎn)物，因此我們將取樣時(shí)間取在3～5.5天之間的中間，取3.5～4.5天。
培養(yǎng)基成分的四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)選擇碳源、氮源、起始pH、發(fā)酵時(shí)間為考察因素，其余成分同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。考察指標(biāo)為465nm所測色價(jià)即橙色素色價(jià)。因素及水平的安排見表1，實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。
表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果


比較四種因素的極差R，C的極差最大，其次是B、D，A的極差最小，說明培養(yǎng)基起始pH對(duì)紅曲菌9903產(chǎn)橙色素能力影響最大，其次是添加氮源濃度及發(fā)酵時(shí)間，而添加碳源濃度在實(shí)驗(yàn)中的變化范圍內(nèi)的影響不明顯。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇最佳因素水平為A1B1C3D2，即玉米淀粉40g/L，硫酸銨2g/L，起始pH值為6.0，發(fā)酵時(shí)間為4.0天，以此作為本發(fā)明的最佳培養(yǎng)基配方。
實(shí)施例2.發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化采用實(shí)施例1正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳培養(yǎng)基配方，進(jìn)行了15L發(fā)酵罐深層培養(yǎng)操作條件的優(yōu)化。紅曲液態(tài)發(fā)酵是好氧發(fā)酵，因此溶氧水平是個(gè)重要的參數(shù)，它直接影響發(fā)酵產(chǎn)物尤其是次級(jí)代謝產(chǎn)物橙色素的產(chǎn)量。通過改變通風(fēng)量與攪拌轉(zhuǎn)速形成高、低兩種不同水平的溶氧條件，考察紅曲霉在這兩種不同的溶氧條件下產(chǎn)橙色素的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溶氧情況下，產(chǎn)橙色素的最高峰時(shí)間明顯滯后于高溶氧情況下，橙色素的最終產(chǎn)量也明顯低?？梢娙苎鯇?duì)紅曲發(fā)酵產(chǎn)橙色素的影響是較大的。在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上最終確定出紅曲霉9903液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)橙色素的最佳操作工藝條件為通風(fēng)量20～40L/min，培養(yǎng)溫度28～32℃，轉(zhuǎn)速200～400r/min，接種量5％，培養(yǎng)90～120小時(shí)。
液態(tài)分批發(fā)酵紅曲霉在15L液態(tài)發(fā)酵罐中的生長過程大致可以分為3個(gè)階段生長停滯期(0～18h)，在這個(gè)階段菌體量、橙色素色價(jià)、桔霉素含量都基本沒有增長；第二個(gè)階段(18～108h)，菌體量迅速增加，同時(shí)橙色素產(chǎn)量也伴隨著菌體生長迅速提高，而桔霉素則開始增長極緩慢(18～90h)，而后又迅速增長(90～108h)；最后一個(gè)階段(108～120h)，菌體的干重幾乎沒怎么增加，而橙色素產(chǎn)量卻有一定程度的降低，色調(diào)也隨之有些降低。
可見，在前期橙色素的產(chǎn)生與菌體生長基本同步，而桔霉素含量則沒什么太大變化，說明橙色素的生產(chǎn)與菌體的生長有一定的偶聯(lián)。但在后期，橙色素含量降低時(shí)桔霉素含量卻迅速增長，原因可能是前期桔霉素合成的有關(guān)酶基因開始啟動(dòng)，或經(jīng)過一定時(shí)間的桔霉素前體物合成并積累后，桔霉素分子的構(gòu)成單元才開始組裝成桔霉素分子，而橙色素生長則是與菌體生長相偶聯(lián)的，到菌體快速生長期時(shí)，橙色素也大量合成。另外后期橙色素的減少以及色調(diào)值的降低，原因可能是橙色素與培養(yǎng)基中的氨基酸進(jìn)行了反應(yīng)，生成了水溶性的紅色素。
液態(tài)流加發(fā)酵，流加糊化的玉米淀粉對(duì)橙色素產(chǎn)量的影響流加技術(shù)可以消除底物和產(chǎn)物抑制作用。因此我們嘗試了流加糊化的培養(yǎng)基的方法，以期可以提高橙色素產(chǎn)量。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用有效裝液量為10L的發(fā)酵罐，底液量為7L，發(fā)酵18h時(shí)開始進(jìn)行流加操作，流加速度為0.03L/h，在此操作條件下，最終橙色素產(chǎn)量比間歇發(fā)酵提高了18％，可見，利用流加發(fā)酵液可以克服初始營養(yǎng)濃度過高而引起的對(duì)菌體生長及橙色素生長的抑制，從而有效地提高橙色素生成量和原料利用率。最終發(fā)酵液的橙色素色價(jià)三罐平均穩(wěn)定達(dá)到121.7U/mL，色調(diào)值達(dá)到1.13。
實(shí)施例3.橙色素的提取和精制橙色素的直接噴霧干燥法生產(chǎn)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究確定出橙色素發(fā)酵液直接進(jìn)行噴霧干燥時(shí)的操作工藝參數(shù)條件發(fā)酵液進(jìn)行高壓均質(zhì)，壓力為3kgf/cm2，或膠體磨將菌體破碎后，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精∶發(fā)酵液以Kg/L計(jì)為0.02～0.06，進(jìn)風(fēng)溫度170～200℃，出口溫度70～100℃，噴頭壓力1～4kgf/cm2，流速80～120mL/h。在此操作條件下最終得到橙色素產(chǎn)品(I)，其色價(jià)為1030.75U/g，色調(diào)為1.99，色素得率達(dá)到66.67％。
橙色素的濃縮結(jié)晶和噴霧干燥。
不同萃取劑提取紅曲橙色素的效果比較分別量取一定體積的橙色素發(fā)酵液，進(jìn)行超聲波破碎或其它菌體破碎方法，如均質(zhì)機(jī)、膠體磨等后，5000r/min、20min高速離心得菌絲體，分別用15mL正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲苯、丙酮、甲醇、乙醇或甲酸進(jìn)行萃取。2h后進(jìn)行冷凍離心，移取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用于紫外分光光度計(jì)在300～600nm內(nèi)掃描，測其在410nm、465nm和510nm處的色價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙酸時(shí)對(duì)橙色素的提取效率最好，色價(jià)高達(dá)3240.625U/g，但是在往色素樣品中加入萃取劑時(shí)發(fā)現(xiàn)有放熱現(xiàn)象，說明乙酸有可能與色素發(fā)生了反應(yīng)，因此很難保證測得的色價(jià)就是自然的橙色素的含量。在使用正己烷或環(huán)己烷進(jìn)行萃取時(shí)，萃取相中以黃色素和橙色素為主，紅色素幾乎沒有，因此如果從考慮將色素分離的角度來看，環(huán)己烷或正己烷是比較理想的選擇，但二者對(duì)橙色素的提取率相對(duì)較低。使用乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷時(shí)，橙色素的提取率相對(duì)較高，但同時(shí)黃色素的提取率也很高，尤其是乙酸乙酯。而使用甲醇和乙醇時(shí)，不僅橙色素的提取率很高，而且黃色素的提取率極低，這樣對(duì)分離很有利，因此我們選用甲醇或乙醇作為提取橙色素的最佳萃取劑，這要看最終的橙色素產(chǎn)品的使用領(lǐng)域了，如果是用在食品行業(yè)，則選擇無毒的乙醇作為萃取劑，若是應(yīng)用于化工及其它行業(yè)則選用甲醇作為萃取劑，因?yàn)橄鄬?duì)于乙醇，甲醇對(duì)橙色素的萃取率及最終萃取的色價(jià)都很高。最終用有機(jī)溶劑萃取之后的橙色素產(chǎn)品(II)進(jìn)行噴霧干燥后，橙色素色價(jià)達(dá)2000U/g以上，色調(diào)值達(dá)2.45。
第一次板層析所用硅膠及展開劑的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用硅膠進(jìn)行板層析的效果較好，而對(duì)不同規(guī)格的硅膠進(jìn)行比較，國產(chǎn)青島的硅膠效果極好，因此我們選定了山東青島海洋化工集團(tuán)的G-60型硅膠作為本專利研究的板層析介質(zhì)。對(duì)于展開劑的選擇首先考慮的是將紅曲萃取液中的大部分色素與橙色素分離開來，在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們選擇了以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1為展開劑，對(duì)紅曲色素進(jìn)行一個(gè)初步分離，最終得到Rf＝0.7941的橙色譜帶。
第二次板層析所用展開劑的選擇由第一次板層析的結(jié)果可以看出紅曲色素是種混合色素，只在普通光照下就可以看到18種，而在紫外線下又可以看到很多普通光照下看不到的熒光物質(zhì)。橙色素與紅色素可以完全分離，但與黃色素相鄰很近，有部分重疊，需進(jìn)一步分離。因此我們進(jìn)行了第二次板層析，對(duì)于所使用的不同展開劑來說，采用環(huán)己烷∶氯仿∶異丙醇(6∶4∶3)時(shí)色素不能分開，反而對(duì)色素具有一定的分散作用。使用甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(8∶2∶1)是分離效果最好，總共分離出8條色帶，最終得Rf＝0.7458的橙色素譜帶，按精制流程最終得到了純的橙色素產(chǎn)品(III)，用于下一步的質(zhì)譜鑒定用。
柱層析分離橙色素方法的確定柱層析硅膠選用青島產(chǎn)的工業(yè)級(jí)的柱層析硅膠，柱子型號(hào)為28mm×500mm，最大上樣量為色價(jià)在3000～4500U/mL的橙色素濃縮液4～8mL，流動(dòng)相為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之間，收集顯橙色的流出液，流出液旋轉(zhuǎn)濃縮至橙色素色價(jià)3000～4500U/mL，濃縮液用于板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結(jié)晶(III)。此法與板層析方法相比，處理量大，且方法簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
橙色素產(chǎn)品(III)的質(zhì)譜鑒定將橙色素晶體用甲醇溶解，適當(dāng)稀釋后用于紫外分光光度計(jì)在300～600nm內(nèi)掃描，掃描如圖1所示，得橙色素的最大吸收波長為465nm。
我們用質(zhì)譜檢驗(yàn)的方法對(duì)所制得的橙色素進(jìn)行了定性檢測。圖2為橙色素液相色譜圖，由圖知目標(biāo)物質(zhì)可能為16.86min時(shí)出的峰，其正離子模式質(zhì)譜圖如圖3所示，由圖3可清晰看出M+Na(分子量為377.6)和M+H(分子量為355.6)的準(zhǔn)分子離子峰，確定其分子量為354D，與文獻(xiàn)上報(bào)道的紅斑紅曲素的分子量相同，其峰為單一組分。另外由圖2還可以看出，制備的橙色素產(chǎn)品中主要成分確實(shí)為紅斑紅曲素，從峰面積歸一化計(jì)，紅斑紅曲素占了樣品總量的85.93％。因此可以認(rèn)為是比較純的，可以用于其性質(zhì)等研究。
權(quán)利要求
1.一種紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)以橙色素為主的紅曲色素，并提高橙色素含量及色調(diào)OD465nm/OD510nm的方法，其特征是采用紅曲橙色素的液態(tài)深層發(fā)酵及噴霧干燥方法，(1)菌種以紅曲霉菌(Monascus spp.)9903為出發(fā)菌種，(2)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO4，1～5g/L；K2HPO4，1～5g/L；MgSO4·7H2O，0.2～0.8g/L；CaCl2，0.05～0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；ZnSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；MnSO4·H2O，0.015～0.06g/L，NaNO3，1～4g/L，pH3.0～6.0，(3)搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40～80g/L作為碳源，硫酸銨2～6g/L作為氮源，初始pH3.0～6.0，裝液量100mL/500mL三角瓶，培養(yǎng)基經(jīng)過糊化后進(jìn)行接種，接種量孢子懸浮液4mL，30℃往復(fù)式搖床，行程10cm，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間3.5～5.5天，(4)15L發(fā)酵罐發(fā)酵通風(fēng)量20～40L/min，培養(yǎng)溫度28～32℃，轉(zhuǎn)速200～400r/min，接種量5％，培養(yǎng)90～120小時(shí)，培養(yǎng)基同搖瓶發(fā)酵所用培養(yǎng)基，并在使用前進(jìn)行糊化，發(fā)酵罐的有效裝液量為10L，底液量為7L，在發(fā)酵過程中再流加糊化的培養(yǎng)基，發(fā)酵18小時(shí)開始流加操作，流加速度為0.03L/h，(5)噴霧干燥發(fā)酵液進(jìn)行高壓均質(zhì)，壓力為3kgf/cm2，或膠體磨將菌體破碎后，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計(jì)為0.02～0.06，進(jìn)風(fēng)溫度170～200℃，出口溫度70～100℃，噴頭壓力1～4kgf/cm2，流速1.5～3L/h，噴霧干燥得到粉末狀橙色素產(chǎn)品(I)，或(6)將步驟(4)所得發(fā)酵液進(jìn)行精制發(fā)酵液經(jīng)超聲波破碎或高壓均質(zhì)后將細(xì)胞破碎，釋放出胞內(nèi)的色素，5000r/min，20min高速離心得菌絲體，用甲醇或乙醇進(jìn)行萃取，萃取3次至溶液無明顯橙色，過濾后合并濾液，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計(jì)為0.02～0.06，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥條件同步驟(5)，得色調(diào)高一些的粉末狀橙色素產(chǎn)品(II)，或萃取后的合并濾液繼續(xù)進(jìn)行板層析分離，選用G-60型硅膠作為板層析介質(zhì)真空濃縮至橙色素色價(jià)為3000～4500U/mL，濃縮液用于第一次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，刮下顯橙色的譜帶Rf＝0.7941，再用甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液旋轉(zhuǎn)濃縮至橙色素色價(jià)3000～4500U/mL，濃縮液用于第二次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結(jié)晶(III)，或萃取后的合并濾液繼續(xù)進(jìn)行柱層析分離，選用青島產(chǎn)硅膠作為柱層析介質(zhì)柱子型號(hào)為28mm×500mm，最大上樣量為色價(jià)在3000～4500U/mL的橙色素濃縮液4～8mL，流動(dòng)相為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之間，收集顯橙色的流出液，流出液旋轉(zhuǎn)濃縮至橙色素色價(jià)3000～4500U/mL，濃縮液用于板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝-0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結(jié)晶(III)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是搖瓶發(fā)酵和15L發(fā)酵罐發(fā)酵所用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40g/L作為碳源，硫酸銨2g/L作為氮源，初始pH6.0；搖瓶發(fā)酵時(shí)間為4.0天，15L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)間為108小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述橙色素精制工藝中用溶劑浸提，食品行業(yè)用的橙色素產(chǎn)品用乙醇進(jìn)行浸提，化工及其它行業(yè)使用的橙色素產(chǎn)品用甲醇進(jìn)行浸提。
全文摘要
紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)橙色素的方法，屬于生物工程和色素制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以一株高產(chǎn)色素紅曲霉菌9903為出發(fā)菌株，生產(chǎn)以橙色素為主的紅曲色素，并提高橙色素含量及色調(diào)(OD
文檔編號(hào)C09B61/00GK1814783SQ20051009576
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者許贛榮, 張慧娟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)