一種復合微生物肥及其制備
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復合微生物肥，重量份數(shù)組成為：植物乳桿菌混合菌劑15?30份，曲霉混合培養(yǎng)物10?16份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1?3份，枯草芽孢桿菌菌粉5?10份，聚谷氨酸0.5?1份。肥料顆粒表面的聚谷氨酸可以在實際使用過程中吸納水分形成水凝膠，為顆粒內(nèi)部肥料的迅速生長繁殖提供水分環(huán)境，同時也可以達到緩慢釋放生物菌肥力的效果。CGMCC No.940520140702CGMCC NO.1176320151130
【專利說明】
一種復合微生物肥及其制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生態(tài)肥，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物肥料是活體肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活動來 完成。只有當這些有益微生物的生命活動來完成。只有當這些有益微生物處于旺盛的繁殖 和新陳代謝的情況下，物質(zhì)轉(zhuǎn)化和有益代謝產(chǎn)物才能不斷形成。因此，微生物肥料中有益微 生物的種類、生命活動是否旺盛是其有效性的基礎，而不像其它肥料是以氮、磷、鉀等主要 元素的形式和多少為基礎。正因為微生物肥料是活制劑，所以其肥效與活菌數(shù)量、強度及周 圍環(huán)境條件密切相關(guān)，包括溫度、水分、酸堿度、營養(yǎng)條件及原生活在土壤中土著微生物排 斥作用都有一定影響。
[0003] 發(fā)明名稱為微生態(tài)海藻酸有機肥料增效劑制備方法，申請?zhí)枺?01110221042.4，發(fā) 明提供一種微生態(tài)海藻酸有機肥料增效劑，包括海藻酸2-60%、甘露醇0.1-5%、粗蛋白1-20 %以及復合芽孢桿菌，其中復合芽孢桿菌活性成分包括:地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、 短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、多食鞘芽孢桿菌和膠凍樣芽胞桿菌，活菌總數(shù)〇. 1-50億/ml;該 增效劑的制備方法以海藻為原料，利用高活性解聚酶裂解，再接入復合菌種進行升溫加氧 發(fā)酵，所得到的增效劑完全保留海藻中的天然活性有效成分，如海藻酸(海藻多糖）、粗蛋白 以及氮、磷、鈣、碘、鉀、鎂、錳、硒等微量元素。
[0004] 名稱為一種微生物肥料的制備方法申請，申請?zhí)枺?01310743759.4,發(fā)明公開了一 種微生物肥料的制備方法，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域，所述微生物肥料的生產(chǎn)方法，是將黑曲 霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌按比例混合為微生物肥料。本發(fā) 明的肥料通過復合微生物發(fā)酵的方法制成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長 提供有益條件。解磷巨大芽孢桿菌能分解土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷;本發(fā) 明使用的黑曲霉具有產(chǎn)高活力纖維素酶的特性，纖維素酶有利于土壤有機質(zhì)的分解，腐殖 質(zhì)的形成和碳素營養(yǎng)的釋放。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50-100克，是目前國內(nèi)外 使用量較少的微生物肥料之一。
[0005] -種復合飼料添加劑產(chǎn)品，申請?zhí)枮?01210182772.2,該專利公開了一種復合飼 料添加劑產(chǎn)品，組成如下：低聚果糖10-15%，大豆多肽10-20%，黃芪萃取物10-25%，枯草 芽孢桿菌凍干菌粉，靈芝菌固體發(fā)酵培養(yǎng)物;枯草芽孢桿菌(Baci 1 lus subti 1 is)為CGMCC 6012,上述比例為質(zhì)量百分比;本發(fā)明產(chǎn)品可以有效降低抗生素類藥物在飼養(yǎng)動物中的使 用量，提高動物肉制品的安全性，提高動物的飼料利用效率，增強動物的免疫力，提高飼養(yǎng) 效益。
[0006] 一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，申請?zhí)枺?01310566374.5，本發(fā)明公開了 一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Li-2013-02 于 2013年 7 月 15 日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心 (CGMCC) ， 保藏 號為CGMCCNo. 7926。該菌株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2010經(jīng)紫外線-氯化鋰- 硫酸二乙酯復合誘變篩選獲得，該菌株具有強耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點，應用前景 非常廣闊。一株高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉.申請?zhí)枺?01310571925.7.本發(fā)明公開了一株高產(chǎn) 纖維素酶的黑曲霉，本發(fā)明屬于黑曲霉領(lǐng)域，特別涉及高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株。本發(fā)明 所提供的黑曲霉(六8口6坪；[11118111861')，該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 7927。發(fā)酵罐實驗跟蹤的各項性能指標表明，該菌株 代謝正常，產(chǎn)纖維素酶能力強，是一株優(yōu)良的纖維素酶高產(chǎn)菌株。
[0007] 由于我國長期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然 存在整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量與應用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問題。在農(nóng)業(yè)可持續(xù) 發(fā)展已成為人類共識的今天，這些問題成了微生物肥行業(yè)函待打通的"瓶頸"。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種復合微生物肥.
[0009] 復合微生物肥重量份數(shù)組成為：植物乳桿菌混合菌劑15-30份，曲霉混合培養(yǎng)物 10-16份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1-3份，枯草芽孢桿菌菌粉5-10份，聚谷氨酸0.5-1份。
[0010] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成· [0011]植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC9405 3-8份，植物乳桿菌 CGMCC11763 2-4份。
[0012 ]曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0013]曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物1 -3份，黑曲霉培養(yǎng)物6-8份。 [0014]所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0015] 所述復合微生物肥的制備方法如下：
[0016] 將植物乳桿菌混合菌劑15-30份，曲霉混合培養(yǎng)物10-16份，解磷巨大芽抱桿菌菌 劑1-3份，枯草芽孢桿菌菌粉5-10份，按照比例混合均勻，采用肥料造粒機造粒，粒徑在0.5-2_之間，隨后將上述肥料顆粒與聚谷氨酸進行混合，使聚谷氨酸黏附在肥料顆粒表面。
[0017] 所述枯草芽孢桿菌菌粉制備:發(fā)酵法培養(yǎng)的發(fā)酵液離心分離，采用常規(guī)冷凍干燥 法獲得的菌粉。
[0018] 植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉(zhuǎn) 接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加 載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為〇. 5-0.6:1，載體 組成為:CaC03 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0019]泡盛曲霉培養(yǎng)物制備：菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料 中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0020] 黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，采用常見固體發(fā)酵培養(yǎng)方法制備:孢子液接種到固 態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，干燥，粉碎干燥物。黑曲霉(Aspergi 1 lus niger)Li-2013-03保藏號為CGMCC N0.7927。
[0021] 本發(fā)明中植物乳桿菌CGMCC 9405菌株特點如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿 狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致 密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0022] 理化特征為:過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實驗( + )，運動性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (-)，亞硝酸鹽還原(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，產(chǎn)硫化氫氣體(-)，pH4.OMRS培養(yǎng)基中生長(+ )。
[0023]本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進行選育：
[0024]原始出發(fā)菌種-試管活化-硫酸二乙酯(DES)誘變-亞硝基胍(NTG)誘變-等離 子體誘變-平板初篩-搖瓶復篩-傳代穩(wěn)定性試驗。
[0025]本發(fā)明所采用的出發(fā)菌株在MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，其乳酸的生產(chǎn)速率為1.5g/L/d， 當培養(yǎng)基pH為3.5時幾乎停止生長，對亞硝酸鈉的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發(fā)菌株 為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場的青儲飼料，采集時間2013年9月15日。
[0026]為了提高其乳酸生產(chǎn)速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG 技術(shù)對該菌種進行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸鈣平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā) 酵，生物傳感器分析儀對高產(chǎn)菌進行復篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗， 評價其遺傳穩(wěn)定性。
[0027]植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：經(jīng)過連續(xù)傳代十次，各項性能指標都 比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒有回復，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌 株。
[0028] 經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn):該誘變菌株的乳酸生產(chǎn)速率可以達到35g/L/d，該菌株經(jīng)過71小時發(fā) 酵后乳酸濃度達到95g/L;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力 達到9.8mg/h/kg(自然發(fā)酵過程亞硝酸鹽積累的速率大約為1. lmg/h/kg)，能夠耐1%膽鹽。 [0029]因此采用該菌種生產(chǎn)泡菜，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kg以下，遠低于 國家標準GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0030]植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) tlj-2014，該菌株已于2014 年7月2 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101)，保藏號為CGMCC N0.9405。
[0031] 1. DES誘變選育
[0032] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 月旨，葡萄糖20g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生 長前期。
[0033] 2)取5mL菌液，5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0034] 3)用pH7.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0035] 4)取32mL ρΗ7·0的磷酸鉀緩沖液、8mL菌懸液、0.4mL DES在預先放入轉(zhuǎn)子的150mL 三角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1 % (v/v)。
[0036] 5)在37°C搖床中150rpm反應30min，取lmL混合液，加入0 · 5mL 25 %Na2S2〇3溶液中 止反應。
[0037] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡 萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng) 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0038] 7)在37 °C培養(yǎng)2~3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培 養(yǎng)基上生長并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌L1。 [0039] 2.亞硝基胍誘變
[0040] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌L1 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 月旨)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于 對數(shù)生長前期。
[0041 ] 2)取5mL菌液5000rpm離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌2次。
[0042] 3)用pH6.0磷酸緩沖液稀釋成107個/mL菌懸液。
[0043] 4)取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0044] 5)在37 °C下200rpm振蕩反應30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水 洗滌數(shù)次，中止反應。
[0045] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸鈣篩選培養(yǎng)基(含100g/L葡 萄糖的碳酸鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉(zhuǎn)印到pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鈉篩選培養(yǎng) 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0046] 7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鈉篩選培養(yǎng)基上 生長并且在碳酸鈣篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取100支符合以上條件的菌落。
[0047] 3.搖瓶復篩
[0048] 1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無瓊脂)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為l〇〇g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)15h左右，使菌 體處于對數(shù)生長中期。
[0049] 2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基(含250g/L葡萄糖的碳酸 鈣MRS培養(yǎng)基)平皿中、pH為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養(yǎng)基(低pH值改性MRS培養(yǎng)基）和 亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基（單一氮源為2g/L亞硝酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）上（注:采用 250mL三角瓶）。200印!11，37°(：培養(yǎng)3-4天，每天分別檢測碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn) 生速率、LPHMRS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速 率。發(fā)酵結(jié)束后，比較100株菌種的碳酸鈣篩選液體培養(yǎng)基中L-乳酸產(chǎn)生速率、LPHMRS液體 培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0050] 3)選擇兼具高L-乳酸產(chǎn)生速率、耐受低pH(該菌種僅能在最低為pHl. 8的培養(yǎng)基中 生長)和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L2菌。
[0051 ] 4.遺傳穩(wěn)定性試驗
[0052]將L2菌在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情 況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說 明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。菌株命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
[0053] 5. 5L發(fā)酵罐試驗
[0054] 1)取斜面上的植物乳桿菌L2-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊脂）（葡萄糖濃度 為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處于對數(shù)生長中期。 [0055] 2)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°(：下100印111培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10%(通氣0.5171^11)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌L2的乳酸產(chǎn)量達到95g/L。這樣的產(chǎn)乳酸速率 利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0056] 3)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L pH為1.8的LPHMRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為50g/ L)的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下lOOrpm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10 % (通氣 0.5L/min)，后期厭氧，整個過程用0.5mol/L的氫氧化鈉將發(fā)酵液pH控制在1.8，總培養(yǎng)時間 為48小時。發(fā)酵結(jié)束后，檢測植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說明植物乳桿菌L2能夠在 pHl.8的環(huán)境中生存。
[0057] 4)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸 鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的5L發(fā)酵罐中。接種量為10 %，37 °C下1 OOrpm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前 期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L 的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計算發(fā)酵過程植物乳桿菌L2對亞硝酸鈉的降解 速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，L2對亞硝酸鈉的降解速率可以達到563mg/h/L。
[0058] 5)將對數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預處理過的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個發(fā)酵過程中，L2菌對亞硝酸 鈉的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于5mg/kg，遠低于國家標 準GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0059]有益效果
[0060] 本發(fā)明的肥料由復合微生物發(fā)酵而成，能夠改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的 生長提供有益條件。本發(fā)明的肥料能夠改良土壤。肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)，占土 壤有機質(zhì)的〇 . 1 %，與植物粘液，礦物胚體和有機膠體結(jié)合在一起，可以改善土壤團粒結(jié)構(gòu)， 增強土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還能參與腐殖質(zhì)形成。所以 施用微生物肥料能改善土壤物理性狀，有利于提高土壤肥力。本發(fā)明的肥料能夠增強作物 的抗旱能力。本發(fā)明的復合菌種分解土壤里硅元素供植物利用，使得植物的蠟質(zhì)層增厚，提 高植物保水能力；能促進土壤團粒結(jié)構(gòu)形成，防止土壤板結(jié);破壞土壤毛細現(xiàn)象，防止土壤 水分蒸發(fā)。
[0061] 肥料顆粒表面的聚谷氨酸可以在實際使用過程中吸納水分形成水凝膠，為顆粒內(nèi) 部肥料的迅速生長繁殖提供水分環(huán)境，同時也可以達到緩慢釋放生物菌肥力的效果，且可 以有效減少作物生長階段的灌溉用水量13%以上。
[0062]本產(chǎn)品使用方法簡單，每畝地使用量0.3-1公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或生 長期灌水前使用。
【具體實施方式】
[0063]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0064]本發(fā)明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03是由實驗室保藏的一 株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2010經(jīng)多輪亞硝基胍誘變，然后對突變 株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌 株（Aspergillus niger)Li-2013-03〇
[0065]本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101 )，保藏號為 CGMCC NO.7927〇
[0066]產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括以下步驟：
[0067] 1)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2010劃線接種斜面培養(yǎng) 基，30°C培養(yǎng)2~3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色孢子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下 麥芽汁1000mL，pH值自然，121°C滅菌20min;
[0068] 2)孢子懸液制備（以下步驟均在無菌條件下操作）：向試管斜面加入15mL無菌水， 把孢子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的150mL三角瓶 中，將三角瓶放入搖床振蕩10-15min，使孢子分散。
[0069] 3)亞硝基胍(NTG)誘變
[0070] A.用無菌水將孢子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成106-107個/mL。
[0071 ] B.取10mL菌懸液轉(zhuǎn)移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成終濃度為10mg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0072] C.在30°C下200rpm振蕩反應30min，5000rpm離心10min收集菌體，用無菌生理鹽水 洗滌數(shù)次，中止反應。
[0073] D.適當稀釋將孢子濃度調(diào)節(jié)為103個/mL，取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于 纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株 200支。（所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉10g、剛果紅0.2g、硫酸銨 5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉 O.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL，pH值5-6，121 °C滅菌20min)。
[0074] E.復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至孢子鋪 滿斜面。分別將孢子以無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行發(fā)酵， 接種量1〇%~八），30°(：、10(^/1^11培養(yǎng)9611，分別測定各菌株的纖維素酶活性。（所述復篩培 養(yǎng)基組成如下：纖維素粉50g、硫酸銨5g、硫酸鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉0. lg、自來水 定容1000mL，pH值5-6，121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。 [0075] 4)遺傳穩(wěn)定性試驗
[0076]將Li-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后 的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標 都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0077] 5)放大試驗
[0078] ①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入 500mL三角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150rpm搖床培養(yǎng)72-96h。
[0079]③種子罐培養(yǎng):將種子液以10 % (v/v)接種量接入裝有7.5L發(fā)酵液的10L發(fā)酵罐 中，控制pH值恒定為6.0 ± 0.2，培養(yǎng)溫度30 ± 0.1°C，攪拌速度300rpm，通風量(v/v) 1:0.8-1.2,培養(yǎng)時間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉100g、硫酸銨5g、硫酸 鎂0.25g、磷酸二氫鉀lg、氯化鈉 0. lg、自來水定容1000mL，pH值5-6,121°C滅菌20min。
[0080] 發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液（粗酶液)進行酶活力檢測經(jīng)測定，菌株Aspergillus niger Li-2013-03的外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別 達到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分別比出發(fā)菌株Aspergillus niger Li-2010 提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0081] 解磷巨大芽抱桿菌是芽抱桿菌屬(Bacillus)中的一個種。運動，形成莢膜，好氧。 從葡萄糖產(chǎn)酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，不產(chǎn)生卵磷脂酶，VP陰性。能分解 土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷。
[0082] 解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所提供，地址：中國河北滄州市運 河區(qū)解放西路顧和國際商務中心A座1區(qū)807-812。
[0083] 本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02。該菌株已于2013 年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：中 國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏號為CGMCC No.7926。
[0084] 所述菌株特點如下：
[0085] 所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運 動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P實 驗成陽性。
[0086] 所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013_02由一株保藏于本實驗室的產(chǎn) 耐高溫淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013經(jīng)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變篩選獲 得，具體篩選步驟如下：
[0087] (1)菌懸液的制備
[0088]將在平板劃線分離后長出的Li-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培 養(yǎng)12h后，取lmL培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗滌兩次，并重懸與9mL生理鹽水中。
[0089] (2)紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變
[0090]將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攪拌照射100s。將 經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做 對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板 上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋 后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂 布于氯化鋰平板。
[0091] (3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0092]將上述涂布均勻的平板，置40°C培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌 落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02，Li-2013-03
[0093] (4)搖瓶發(fā)酵復篩
[0094] 將獲得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02, Li-2013-03在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中進行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、100r/min培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上 清液制得粗酶液。
[0095] (5)酶活測定
[0096] 酶活單位的定義：lmL粗酶液，于105°C、pH 4.2條件下，1111；[11液化111^可溶性淀粉， 即為1個酶活力單位，以U/mL表示。
[0097] 經(jīng)測定，菌株Li-2013-02,為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達到30000U/mL，比原始菌 株酶活提高1.6倍。
[0098] 所述氯化鋰平板：淀粉1 %，蛋白胨1 %，（NH)2S〇4〇 · 4%，K2HP〇4〇 · 8%，CaCl20 · 2%， 氯化鋰0.9%，瓊脂2%。
[0099] 所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉l%，NaCl 1%。
[0100] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，（NH)2S040.4%， K2HP040.8%，CaC120.2%。
[0101] 所述的搖瓶培養(yǎng)條件：該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10% (V/V)，100r/min、40°C發(fā)酵培養(yǎng)72h。
[0102] 由菌株Li-2013-02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α-淀粉酶，其酶學性質(zhì)如下：
[0103] (1)該酶溫度適應范圍較寬，最適作用溫度在105-115Γ之間，且在110°C以下保存 的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C以上保存長時間溫度穩(wěn)定性較差。
[0104] (2)該酶最適反應pH值為4.2。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在pH值為3.0 時酶活完全穩(wěn)定。
[0105] (3)酶活性：由本發(fā)明所提供的突變株Li-2013-02,制備的耐高溫α-淀粉酶酶活力 為30000-35000U/ml。
[0106] 1、本發(fā)明使用紫外線-氯化鋰-硫酸二乙酯復合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高 溫α_淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013-02,該菌株具有強耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點。
[0107] 2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α-淀粉酶酶活力高達30000-35000u/ml，；適用溫度 范圍為25-115 °C，最適反應溫度110 °C，在110 °C酶活完全穩(wěn)定；適用反應pH值范圍為3.0-7.0，在pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α-淀粉酶酶活力 高，酶作用最適pH值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存 的工業(yè)化需求。
[0108] 發(fā)明所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.11763,保 藏地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編： 100101。。
[0109] 植物乳桿菌益生特性如下：
[0110] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC N0.11763經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)能夠在pH為1.50的條件 下存活，在1%膽鹽培養(yǎng)4小時后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC N0.11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kg以下；CGMCC N0.11763在發(fā)酵60h小時后，對膽固醇降解率可達到64.76%。 CGMCC N0 · 11763黏附能力測定的自凝集率為95 · 71 %。
[0111] CGMCC N0.11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0112] 取lml CGMCC N0.11763母液接種于10mL的MRS膽固醇液體培養(yǎng)基（膽固醇含量 0.1mg/ml，pH 6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養(yǎng)20h、40h、60h備用，以接入lmL無菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對照，取以上培養(yǎng)不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . lml于相應的試管中，加冰醋酸0.3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.Oml，混合均勻。室溫靜置lOmin，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復，以同樣方法制 作膽固醇標準曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見表1?？芍?，CGMCC NO. 11763 對膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時后，降解率可達到64.76%。
[0113] 表1對膽固醇的降解情況
[0114]
[0115] CGMCC N0.11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0116] 取CGMCCN0.11763菌液lmL接種菌種于含有不同膽鹽(含量梯度為0.0 %、0.2 %、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液體培養(yǎng)基(？!1=6.4)，置于37°(：下分別培養(yǎng)0、2、411， 每個處理3個重復。各取lml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄計算平 板上的菌數(shù)個數(shù)。結(jié)果見表2?？芍摼谀扄}濃度為1 %處理4h后菌的生長量依然達到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0117] 表2耐膽鹽能力檢測[(土s) X 107cfu/ml]
[0118]
[0119] CGMCC NO.11763菌株的耐酸試驗
[0120] 取CGMCC N0.11763母液按lml接種菌種于不同pH值(pH梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10mL MRS液體培養(yǎng)基，置于37 °C下分別培養(yǎng)0、2、4h，每一處理3個重復。各取lml 樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0.1ml稀釋液于MRS中涂布，于37°C生化 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄平板上的菌落個數(shù)。結(jié)果見表3。說 明該菌具有很強的耐酸能力。
[0121] 表3耐酸能力檢測[(土s) X 107cfu/ml]
[0122]
[0123] CGMCC NO.11763菌株的黏附能力測定
[0124] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌DH5a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離心10min，收集菌泥，分別用pH = 7.0的無菌磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離心 lOmin，收集菌體）。自凝集率（％ :用無菌的roS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長600nm處 的吸光值為0.4 ±0.1 (A 0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測定吸光值A 24,自凝集率 (%)公式為(A 0-A 24)/A 0。；他凝集率（％):將CGMCC如.11763和大腸桿菌0耶€[的懸菌 液調(diào)節(jié)成在波長600nm處的吸光值為0.6±0.1 (A 0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測定吸光 值A 24,他凝集率（％ )公式為(A 0 -A 24)/A 0。測定結(jié)果見表4,可知CGMCC N0.11763的自 凝集率為95.71 %，有很強的黏附能力。
[0125] 表4黏附能力表
[0126]
[0127] 菌株生理特性
[0128] 所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.11763,保藏地 址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。
[0129] 該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛， 不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0130] 理化特征為:過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實驗( + )，運動性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (_)，亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。經(jīng)過 生理生化鑒定為為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0131] 菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0132] 本發(fā)明植物乳桿菌由采集人李建樹，從新疆維吾爾族老鄉(xiāng)家中酸奶中分離得到， 采集時間2015年6月2日。
[0133] 5L發(fā)酵罐試驗
[0134] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCC N0.11763-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處 于對數(shù)生長中期。
[0135] (2)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°(：下100印111培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10%(通氣0.5171^11)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌CGMCC N0.11763的乳酸產(chǎn)量達到110g/L。這樣 的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0136] (4)將對數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝 酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的5L發(fā)酵罐中。接種量為10 %，37°C下lOOrpm培養(yǎng)8小時，對數(shù) 前期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計算發(fā)酵過程植物乳桿菌CGMCC N0.11763 對亞硝酸鈉的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，XH對亞硝酸鈉的降解速率可以達到653mg/ h/L〇
[0137] (5)將對數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預處理過的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個發(fā)酵過程中，XH菌對亞硝酸 鈉的分解速率為10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于4.8mg/kg，遠低于國家 標準GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0138] 實施例1
[0139] 復合微生物肥重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑20份，曲霉混合培養(yǎng)物14份， 解磷巨大芽抱桿菌菌劑1份，枯草芽孢桿菌菌粉8份，聚谷氨酸0.6份。
[0140] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成.
[0141] 植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌CGMCC9405 6份，植物乳桿菌 CGMCC11763 2份。
[0142 ]曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0143 ]曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物2份，黑曲霉培養(yǎng)物7份。
[0144] 所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0145] 所述復合微生物肥的制備方法如下：
[0146] 將植物乳桿菌混合菌劑，曲霉混合培養(yǎng)物，解磷巨大芽抱桿菌菌劑，枯草芽孢桿菌 菌粉，聚谷氨酸按照比例混合均勻，采用肥料造粒機造粒，粒徑在〇. 5-2_之間，隨后將上述 肥料顆粒與聚谷氨酸進行混合，使聚谷氨酸黏附在肥料顆粒表面。
[0147] 采用的菌種如下：
[0148] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0149] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0150] 黑曲霉（Aspergillus niger)Li-2013-03保藏號為CGMCC Ν0·7927〇
[0151] 泡盛曲霉菌劑的制備方法：
[0152]技術(shù)方案如下：
[0153 ]斜面菌種活化培養(yǎng):將泡盛曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27 °C培養(yǎng)3天。 [0154]固體一級種子培養(yǎng):挑取泡盛曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升三角 瓶中進行種子培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3天即可。
[0155]固體二級種子培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000克 培養(yǎng)基的5000_升三角瓶中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:30 °C培養(yǎng)3天即可。
[0156] 固體發(fā)酵培養(yǎng):將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混 合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在30°C，濕度85%，每隔10小時翻料一次，培養(yǎng)時間6天； 固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù);待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)基預先經(jīng) 高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121°C，時間1小時。
[0157] 干燥粉碎:發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設備上進行干燥，干燥溫度控制 在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后將固體培養(yǎng)料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目以 上。
[0158] 培養(yǎng)基組成：固體原料:麩皮80 %，豆餅粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自來水； 初始pH自然。
[0159] 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的制備方法：
[0160] 1.發(fā)酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
[0161] (1)-級種子培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100 毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0162] (2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0163] (3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0164] (4) 一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風量（V/V) 1: 0.5，罐壓 0.05Mpa，培養(yǎng)時間24小時；
[0165] (5)發(fā)酵培養(yǎng):將一級種子罐菌種以10%接種量接入總?cè)莘e為1.5噸二級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28°C，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風量(V/V) 1:0.5，罐壓 0.05Mpa，培養(yǎng)時間24小時。
[0166] 培養(yǎng)基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03 1%，ρΗ6.8。
[0167] 植物乳桿菌劑的制備方法：
[0168] (1)-級種子培養(yǎng):將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升， 培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0169] (2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0170] (3)三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0171] (4) 一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以5%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時間18小時；
[0172] (5)發(fā)酵罐培養(yǎng):將一級種子罐菌種以5%接種量接入總?cè)莘e為3噸二級種子罐，發(fā) 酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時間22小時。發(fā)酵完畢發(fā)酵 液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好 的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaC0 3 25份，糊精12份。流 化床干燥，干燥溫度50 °C。
[0173] 培養(yǎng)基組成為:酪蛋白胨1 %，牛肉提取物1 %，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸鈉 0.5%,檸檬酸二胺 0.2%, Tween 800.1%，K2HP040.2%，MgS04.7H20 0.02%, MnS04.H20 0.005% ,CaC032% ,瓊脂1.5% ,ρΗ6·8。
[0174] 實施例2
[0175] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種復合微生物肥.
[0176] 復合微生物肥重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑30份，曲霉混合培養(yǎng)物16份， 解磷巨大芽抱桿菌菌劑1份，枯草芽孢桿菌菌粉10份，聚谷氨酸0.5份。
[0177] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成.
[0178] 植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC9405 8份，植物乳桿菌 CGMCC11763 2份。
[0179 ]曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0180]曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物1份，黑曲霉培養(yǎng)物7份。
[0181 ]所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0182] 實施例3
[0183] 基本同實施例1
[0184] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種復合微生物肥.
[0185] 復合微生物肥重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑30份，曲霉混合培養(yǎng)物10份， 解磷巨大芽抱桿菌菌劑3份，枯草芽孢桿菌菌粉5份，聚谷氨酸0.5份。
[0186] 植物乳桿菌混合菌劑由植物乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCC11763組成.
[0187] 植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC9405 3份，植物乳桿菌 CGMCC11763 4份。
[0188] 曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；
[0189] 曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物2份，黑曲霉培養(yǎng)物7份。
[0190] 所述聚谷氨酸為γ -聚谷氨酸。
[0191] 產(chǎn)品效果實驗
[0192] 試驗地的選擇與試驗設計:試驗于2015年在寧夏鹽池縣進行。
[0193] 試驗田達到田種植玉米10畝，分別在種植時使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.4公斤，出苗1 個月左右通過鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.2公斤，對照組使用市場銷售同類產(chǎn)品。
[0194] 發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達到790公斤，對照組達到540公斤，作物生長階段 的灌溉用水量比對照減少18%。
【主權(quán)項】
1. 一種復合微生物肥，重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑15-30份，曲霉混合培養(yǎng) 物10-16份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1-3份，枯草芽孢桿菌菌粉5-10份，聚谷氨酸0.5-1份。2. 如權(quán)利要求1所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述植物乳桿菌混合菌劑由植物 乳桿菌為CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCCl 1763組成。3. 如權(quán)利要求2所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述植物乳桿菌混合菌劑重量份 數(shù)組成為植物乳桿菌CGMCC94053-8份，植物乳桿菌CGMCCl 17632-4份。4. 如權(quán)利要求1所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉 培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成。5. 如權(quán)利要求4所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組 成為泡盛曲霉培養(yǎng)物1 -3份，黑曲霉培養(yǎng)物6-8份。6. 如權(quán)利要求1所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述復合微生物肥重量份數(shù)組成 為:植物乳桿菌混合菌劑20份，曲霉混合培養(yǎng)物14份，解磷巨大芽抱桿菌菌劑1份，枯草芽孢 桿菌菌粉8份，聚谷氨酸0.6份。7. 如權(quán)利要求6所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述植物乳桿菌混合菌劑由植物 乳桿菌CGMCC9405和植物乳桿菌CGMCCl 1763組成;植物乳桿菌混合菌劑重量份數(shù)組成為:植 物乳桿菌CGMCC94056份，植物乳桿菌CGMCCl 17632份。8. 如權(quán)利要求6所述一種復合微生物肥，其特征在于，所述曲霉混合培養(yǎng)物由泡盛曲霉 培養(yǎng)物和黑曲霉培養(yǎng)物組成；曲霉混合培養(yǎng)物重量份數(shù)組成為泡盛曲霉培養(yǎng)物2份，黑曲霉 培養(yǎng)物7份。9. 如權(quán)利要求1所述一種復合微生物肥的制備方法，如下：將植物乳桿菌混合菌劑，曲 霉混合培養(yǎng)物，解磷巨大芽抱桿菌菌劑，枯草芽孢桿菌菌粉按照比例混合均勻，采用肥料造 粒機造粒，粒徑在0.5-2mm之間，隨后將上述肥料顆粒與聚谷氨酸進行混合，使聚谷氨酸黏 附在肥料顆粒表面。
【文檔編號】C09K17/14GK105907397SQ201610252130
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】李秉京
【申請人】義烏市錦鈺信息科技有限公司