專利名稱：：微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種產(chǎn)腈水解酶的微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，以及這種微生物的篩選方法和利用該方法篩選獲得的具有腈水解酶活性的菌才朱。(二)
背景技術(shù)：
：亞氨基二乙酸(IDA)是一種比較重要的化工原料，具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力能和多種金屬離子絡(luò)合而形成螯合物，和銅離子可以形成藍(lán)色的鰲合物，常用作絡(luò)合劑和表面活性劑，常用于有機(jī)合成，也是草甘膦(Glyphosate)生產(chǎn)的重要中間體。由于其分子中含有亞氨基和羧基，化學(xué)性質(zhì)很活潑，廣泛應(yīng)用于電鍍、染料、醫(yī)藥、電子等領(lǐng)域。是一種重要的化工中間體。目前制備亞氨基二乙酸一般采用化學(xué)方法，根據(jù)原料的不同主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法、氨代氯乙酸法、氫氰酸法、一乙醇胺法、二乙醇胺法等。傳統(tǒng)的化學(xué)方法存在產(chǎn)生成本高、污染嚴(yán)重、對設(shè)備要求高，或者使用劇毒的氫氰酸等弱點。利用生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸與化學(xué)水解法相比，其優(yōu)勢在于(l)反應(yīng)條件溫和?；瘜W(xué)水解法需要在100。C左右進(jìn)行，必須配備加熱和溫控裝置，反應(yīng)條件苛刻，能耗高而且對設(shè)備要求高。而生物催化法一般都是在常溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備成本相對較低。(2)原料消耗大幅度減少，基本不產(chǎn)生可溶性鹽。利用腈水解酶一步水解生成亞氨基二乙酸，省去了堿解和S吏化工藝，避免了NaOH和濃鹽酸的大量使用。生物法中利用NH40H調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化體系的pH值，在產(chǎn)物回收中采用再生技術(shù)，可以有效減少可溶性鹽的排放。(3)廢水排;故少。按照目前的化學(xué)水解工藝，生產(chǎn)每噸亞氨基二乙酸將至少產(chǎn)生廢水8噸。采用生物法后，以腈水解酶酶活力IO萬單位計算(回用5次)，生產(chǎn)每噸亞氨基二乙酸的廢水量可控制在2噸以下，且廢水中不存在鹽類等難處理雜質(zhì)，可生化性強(qiáng)。利用腈轉(zhuǎn)化酶生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸,可以克服化學(xué)法生產(chǎn)亞氨基二乙酸的缺陷。生物催化是迄今為止人類所知道的最高效、最具選擇性的催化體系，可以提供許多傳統(tǒng)化學(xué)方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，顯示出優(yōu)良的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。而且，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物純度高、容易分離和純化，在農(nóng)藥中間體的生產(chǎn)中，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?br/>發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸的制備方法。本發(fā)明所另一目的是提供一種產(chǎn)腈水解酶的微生物的篩選方法，以及提供篩選得到的產(chǎn)腈水解酶的微生物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，所述的方法是利用產(chǎn)腈水解酶的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶，以該酶為生物催化劑催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸。生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的過程如下NH(CH2CN)2月青緒,NH(CH2COOH)2(IDA)本發(fā)明所述的制備亞氨基二乙酸的方法為(A)將所述產(chǎn)腈水解酶的菌抹接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑a于100200r/min、2035。C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)25d;所述誘導(dǎo)劑a為正丁腈、異丁腈或己內(nèi)酰胺，誘導(dǎo)劑a添加量為120g/L產(chǎn)酶培養(yǎng)基；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基每1L按如下組成配制甘油8g,酵母膏6g，NaCllg,K2HP045g,MgSO40.2g,溶劑為水，pH值6.08.0;所述的誘導(dǎo)劑濃度為5g/L;(B)取亞氨基二乙腈配制成質(zhì)量濃度0.5%6%的水溶液，調(diào)初始pH為7.0~7.5,作為酶催化反應(yīng)底物溶液，通常加入氨水、NaOH、或HC1水溶液來調(diào)pH;以步驟(A)發(fā)酵獲得的濕菌體、細(xì)胞破碎獲得的粗酶液或經(jīng)固定化得到的固定化細(xì)胞作為酶源，酶源加入量以濕菌體計為0.1~10g濕菌體/10mL底物溶液；控制反應(yīng)溫度為20~55°C、反應(yīng)pH為6.0-9.0,進(jìn)4亍轉(zhuǎn)化反應(yīng)2~24h,反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液按常規(guī)方法進(jìn)行分離純化得到亞氨基二乙酸。上述步驟(A)所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選在30。C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)3d;步驟(B)所述的控制反應(yīng)溫度優(yōu)選為30°C,進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)10h。本發(fā)明所述的產(chǎn)腈水解酶的微生物即產(chǎn)腈水解酶菌林的篩選方法，所述方法包括初篩和復(fù)篩(l)初篩將待篩選菌抹接種至初篩培養(yǎng)基，2537。C培養(yǎng)14d,挑取菌落中產(chǎn)生黃色變色圈的菌林，接種到LB斜面培養(yǎng)基，2530。C培養(yǎng)25d后取菌林進(jìn)行復(fù)篩；所述初篩培養(yǎng)基終濃度組成如下亞胺基二乙腈5g/L，酵母膏6g/L,NaCllg/L，K2HP04lg/L,MgS04lg/L,溴鉀酚紫lg/L,瓊脂粉20g/L,溶劑為水，pH7.0;即所述初篩培養(yǎng)基每1L按如下組成配制亞胺基二乙腈5g，酵母膏6g，NaCl1g,K2HP041g,MgS04lg,溴鉀酚紫0.1g,瓊脂粉20g，溶劑為水，pH7.0;優(yōu)選步驟(1)初篩所述的培養(yǎng)溫度2830。C,培養(yǎng)34d。(2)復(fù)篩將初篩獲得的菌林接種至復(fù)篩培養(yǎng)基，100-200r/min、2535。C下培養(yǎng)27d,收集菌體測定亞氨基二乙酸的生成量，收集生成亞氨基二乙酸含量大于10%的微生物；所述復(fù)篩培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油8g/L、酵母膏6g/L、NaCllg/L、K2HP045g/L、MgSO40.2g/L,正丁腈5g，溶劑為麥，pH7.0，即所述復(fù)篩培養(yǎng)基每1L按如下組成配制甘油8g、酵母膏6g、NaCllg、K2HP045g、MgSO40.2g,誘導(dǎo)劑b5g,溶劑為水，pH7.0。優(yōu)選步驟(2)復(fù)篩所述的培養(yǎng)溫度為3032°C。本發(fā)明所述的誘導(dǎo)劑a與誘導(dǎo)劑b所表示的都是微生物培養(yǎng)過程中的誘導(dǎo)劑，這里a和b只是用以區(qū)分誘導(dǎo)劑出現(xiàn)在不同步驟。本發(fā)明還涉及根據(jù)所述方法篩選獲得的可高效生產(chǎn)亞氨基二乙酸的產(chǎn)腈水解酶的菌林，所述菌抹為下列之一(1)邊緣假單胞菌0"^/owwwwarg/""/&)ZJB09121，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M20卯43,保藏日期2009年3月18日；(2)敏捷食酸菌(爿c/t/ovorax/ac/to)ZJB09122,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209044,保藏日期2009年3月18日；(3)產(chǎn)酸克雷伯氏菌(兀e/ZwW/(20cytoca)ZJB09123,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209045,保藏日期2009年3月18日；(4)弗氏紅球菌(i/zc^ococcwwrafe/av/m^)ZJB09124，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209046,保藏日期2009年3月18日；(5)紫紅紅球菌(i/zotfococc^r/z^foc/zra^)ZJB09125，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209047,保藏日期2009年3月18日；(6)嗜他咬紅球菌(i/w(iococc^pjrWw/vorara)ZJB09126，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209048,保藏日期2009年3月18日；(7)赤紅球菌(i/w^coca^n/Mer)ZJB09127，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209049,保藏日期2009年3月18日；(8)惡臭假單胞菌(i^eWowo"".ZJBO9129,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209050,保藏日期2009年3月18日；(9)惡臭假單胞菌(i^ewJomo""s)ZJB09135,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209055，保藏日期2009年3月18日；(10)藤黃孩&求菌.(M/cracocc^/w&m)ZJB09131，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209051,保藏日期2009年3月18日；(11)耐鹽短桿菌(BrevZkjfc/er/Mw/z"/otoerara)ZJB09132，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209052,保藏日期2009年3月18曰；尸wz^om朋oyZJB09134,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209054,保藏日期2009年3月18日；(13)焚光葉叚單胞菌(尸w^fowowasy7Mw^ce/w)ZJB09137,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209056，.保藏日期2009年3月18日；(14)糞產(chǎn)堿桿菌(i^ewfifo/wwwo^wg/ww")ZJB09B8，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209057,保藏日期2009年3月18日；(15)節(jié)桿菌d欲n6ac,er"zYrog呵'aco〃譜)ZJUTB06-99，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M208252，保藏日期2008年12月11日。上述菌抹均由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所從土壤中分離獲得。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:提供了一種利用產(chǎn)腈水解酶的菌林經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)，得到腈水解酶，以該酶為生物催化劑催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸的方法，可高效生產(chǎn)亞氨基二乙酸，本發(fā)明還提供了可產(chǎn)腈水解酶的微生物的篩選方法，并獲得了多種產(chǎn)腈水解酶的菌抹，為采用生物催化亞氨基二乙腈生.產(chǎn)亞氨基二乙酸提供了基礎(chǔ)，具有重要應(yīng)用前t'.具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例1:產(chǎn)腈水解酶菌種的初篩初篩培養(yǎng)基每1L按如下組成配制酵母膏6g,NaCl1g，K2HP041g,MgS041g，瓊脂粉20g,pH7.0水補(bǔ)足至lOOOmL,滅菌后冷卻到50°C加入5g亞氨基二乙腈和1g溴曱酚紫，混勻到平板。收集細(xì)菌進(jìn)行篩選，涂布于平板上，在溫度2830。C,培養(yǎng)34d,挑取菌落中產(chǎn)生黃色變色圈的菌林，接種到LB斜面培養(yǎng)(2528°C);黃色變色圏的微生物菌抹有邊緣假單胞菌ZJB09121(尸w^fowomwZJB09121)、惡臭假單胞菌ZJB09134(尸化^fowo"osZJB09134)、惡臭假單胞菌ZJB09129(/^ei^omo"asjTO"aZJB09129)、惡臭假單胞菌ZJB09135(尸wmJowo"w/^"ZJB09135)、熒光假單胞菌ZJB09137(Aew^womwy/wo,wce"sZJB09137)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ZJB09123(A:e/ZwW/"ZJB09123)、弗氏紅球菌ZJB09124(W/2^/ococcwswra他/av/em^ZJB09124)、嗜吡咬紅球菌ZJB09126(i/wtfococc附p;/n^/打/wraraZJB09i26)、紫紅紅球菌ZJB09125(i/oc/ococc附,'/2wfoc/zrawsZJB09125)、赤紅球菌ZJB09127(7/zwfococc附n^6erZJB09127)、藤黃微球菌ZJB09131(M/cracocc^/wfewsZJB09131)、耐鹽短桿菌ZJB09132(5v/6acfen'wmk/otoeraraZJB09132)、敏捷食酸菌ZJB09122"c/cfowrax/ac,.feZJB09122)、糞產(chǎn)堿桿菌ZJB09138(J/ca//ge"es/"ecafoZJB09138)、節(jié)桿菌(^t/zra^cter"/fragMq/aco//cw)ZJUTB06-99,上述菌抹均已保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心，具體保藏信息見
發(fā)明內(nèi)容部分。實施例2:產(chǎn)腈水解酶菌種的復(fù)篩將實施例1中有篩選到的可產(chǎn)生變色反應(yīng)且黃色變色圈大的菌抹,接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，3032°C,100200r/min，500mL三角瓶裝液量150mL，發(fā)酵培養(yǎng)3d，發(fā)酵液離心得到粗酶液或濕菌體。各取lg濕菌體，置于500ml三角瓶中，加入50ml2%(w/w)的反應(yīng)底物亞氨基二乙腈水溶液，3(TC搖床150r/min條件下反應(yīng)60min,離心去除菌體，測定亞氨基二乙酸的生成量，計算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表l。復(fù)篩培養(yǎng)基每1L按如下組成配制甘油8g，酵母膏6g，NaCl1g,K2HP045g，MgSO40.2g，正丁腈5g，pH值7.0,水補(bǔ)足至1000mL;誘導(dǎo)劑正丁腈也可以異丁腈或己內(nèi)酰胺代替。表l:產(chǎn)腈水解酶菌種的復(fù)篩結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例3:產(chǎn)腈水解酶微生物的培養(yǎng)及生物催化制備亞氨基二乙酸產(chǎn)酶培養(yǎng)基每1L按如下組成配制甘油8g、酵母膏6g、NaCl1g、K2HP045g、MgSO40.2g,水補(bǔ)足至1000mL;另加入誘導(dǎo)劑正丁腈5g。產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝于500mL三角瓶中，裝液量100mL/瓶，用滅菌鍋熱滅菌20min，溫度為121°C。將實施例1中獲得的菌抹,分別接種1環(huán)經(jīng)斜面活化培養(yǎng)的菌種到添加了誘導(dǎo)劑的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在搖瓶轉(zhuǎn)速為200r/min，溫度為3(TC下、培養(yǎng)3d，收集濕菌體作為腈水解酶粗酶。在100mL3%(w/w)的亞氨基二乙腈水溶液中加入5g濕菌體進(jìn)行水解反應(yīng)，控制溫度30°C、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min,氨水自動流加調(diào)節(jié)pH7.0,水解10h后測定產(chǎn)物亞氨基二乙酸的產(chǎn)率并計算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表2。表2:產(chǎn)腈水解酶菌種亞氨基二乙酸的產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例4:游離細(xì)胞生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸為了考察實施例i中獲得的細(xì)菌菌林所產(chǎn)腈水解酶的穩(wěn)定性，按實施例3的方法，對實施例1中獲得的細(xì)菌菌抹進(jìn)行游離細(xì)胞反復(fù)分批酶水解試驗，水解10h后測定亞氨基二乙酸的含量，并離心收集菌體，離心收集的菌體再用于水解反應(yīng)，反復(fù)3次。試驗結(jié)果如表3。表3:產(chǎn)腈水解酶菌種的游離細(xì)胞反復(fù)分批酶水解試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例5:固定化細(xì)胞生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸為了進(jìn)一步考察實施例1中獲得的細(xì)菌菌抹所產(chǎn)腈水解酶的穩(wěn)定性，對部分菌林進(jìn)行細(xì)胞固定化，并進(jìn)行反復(fù)分，沐酶水解試驗。稱取按實施例3培養(yǎng)的邊緣假單胞菌ZJB09121(/^w^momwwwg/"afoZJB09121)、惡臭假單胞菌ZJB09134(尸sewcfem朋asZJB09134)、惡臭假單胞菌ZJB09129(尸"wcfo附o"asZJB09129)、惡臭假單胞菌ZJB09135(P化w^mo腦5戸出ZJB09135)、熒光假單胞菌ZJB09137(尸化MfibmowosyZwomsceraZJB09137)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌ZJB09123(《e仿wW/aoqytocaZJB09123)、弗氏紅球菌ZJB09124(i/20fifococc^wrafe/<3We"w:sZJB09124)、弗氏紅球菌ZJB09126(A/zo^cocc^/^WA."/voraraZJB09126)、紫紅紅球菌ZJB09125(i/2odoco固srW0c/7謂sZJB09125)、赤紅球菌ZJB09127(i^o^9coca^n/MwZJB09127)、藤黃微球菌ZJB0913i(M/crococc^ZJB09131)、耐鹽短桿菌ZJB09132(S固'teter/畫/7a/otoer應(yīng)ZJB09132)、敏捷食酸菌ZJB09122(Jc/Avorax/ac/foZJB09122、糞產(chǎn)石威桿菌ZJB09138(J/ca/7^e"as/aec"/^ZJB09138)、節(jié)桿菌(Jw/zroZacfermYragi^/aco//o)ZJUTB06-99的菌體細(xì)胞，用去離子水配制成菌懸液，將濃度為2%(w/w)海藻酸鈉加熱溶解，冷卻后將以濕菌體計的菌體細(xì)胞與海藻酸鈉溶液配成6%(g濕菌體/ml海藻酸鈉溶液)的均勻混合液，并將混合液滴入2%(w/w)的CaCl2溶液中，固定化12h;濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，上述固定化的細(xì)胞再用0.2%(w/v)的戊二醛-HC1溶液(含30mMCaCl2)室溫下攪拌處理24h,之后用蒸餾水洗3次，得到交聯(lián)固定化細(xì)胞。將上述不同菌林的交聯(lián)固定化細(xì)胞，用于反復(fù)分批水解拆分，反復(fù)3次，結(jié)果如表4。表4:產(chǎn)腈水解酶菌種的游離細(xì)胞反復(fù)分批酶水解試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2實施例6:游離酶生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸將實施例1中經(jīng)發(fā)酵獲得的細(xì)菌菌體，利用0.9%生理鹽水洗滌3次，收集菌體重懸于Tris-HClpH7.0緩沖液中，調(diào)節(jié)菌體濃度以濕菌體計為10%(g/ml),利用超聲波、高壓破碎儀、高壓均質(zhì)機(jī)對細(xì)胞進(jìn)行破碎，得到含有游離腈水解酶的粗酶液，利用游離酶進(jìn)行生物催化反應(yīng)。在9ml3%(w/w)的亞氨基二乙腈水溶液中加入1ml粗酶液進(jìn)行水解反應(yīng)，控制溫度30°C、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min,氨水自動流加調(diào)節(jié)pH7.0，水解10h后，10000rpm離心20min后，測定上清液中產(chǎn)物亞氨基二乙酸的產(chǎn)率并計算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表5。表5:游離腈水解酶生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>通過以上實施例得出結(jié)論本發(fā)明所篩選獲得的假單胞菌(i^ew必wo"as)、克雷伯氏菌(《e/6wW/a)、紅球菌(i/ocfococcw力、微球菌(M"/crococcws)、4干菌(j/cfl//ge"es)、》豆4干菌(5rev/ZacfenY/w)、節(jié)牙干菌(JrAra^cter)、食酸菌(JcWowrax)等屬的菌株及其突變林，對生產(chǎn)亞氨基二乙酸均有效，無論游離細(xì)胞、細(xì)胞破碎后的游離酶、固定化細(xì)胞都有很好的轉(zhuǎn)化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的效果。這些菌抹的游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞所產(chǎn)的腈水解酶的穩(wěn)定性較好，因此這些菌林可用于生物催化水解亞氨基二乙腈，進(jìn)而生產(chǎn)亞氨基二乙酸。權(quán)利要求1.微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，其特征在于所述的方法是利用產(chǎn)腈水解酶的菌株經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法為(A)將所述產(chǎn)腈水解酶的菌抹接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑a于100200r/min、20~35°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)25d;所述誘導(dǎo)劑a為正丁腈、異丁腈或己內(nèi)酰胺，誘導(dǎo)劑a的添加量為120g/L產(chǎn)酶培養(yǎng)基；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為甘油8g/L,酵母膏6g/L,NaCllg/L,K2HP045g/L,MgSO40.2g/L，溶劑為水，pH值6.0~8.0;所述誘導(dǎo)劑的終濃度為5g/L，(B)取亞氨基二乙腈配制成質(zhì)量濃度0.5%6°/。的水溶液，調(diào)初始pH為7.07.5，作為酶催化反應(yīng)底物溶液；以步驟(A)發(fā)酵獲得的濕菌體、細(xì)胞破碎獲得的粗酶液或經(jīng)固定化得到的固定化細(xì)胞作為酶源，酶源加入量以濕菌體計為0.110g濕菌體/10mL底物溶液；控制反應(yīng)溫度為2055°C、反應(yīng)pH為6.09.0,進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)816h,反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到亞氨基二乙酸。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(B)取亞氨基二乙腈配制成質(zhì)量濃度0.5。/。6%的水溶液，以氨水，NaOH或HC1水溶液調(diào)pH為7.0~7.5。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(A)所述的發(fā)酵培養(yǎng)在3(TC條件下進(jìn)^f亍發(fā)酵培養(yǎng)3d。5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(B)所述的控制反應(yīng)溫度為30°C,進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)10h。6.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的產(chǎn)腈水解酶的菌抹按如下方法篩選得到(1)初篩將待篩選菌抹接種至初篩培養(yǎng)基，2537。C培養(yǎng)l4d，挑取菌落中產(chǎn)生黃色變色圈的菌林，接種到LB斜面培養(yǎng)基，253(TC培養(yǎng)25d后取菌抹進(jìn)行二次篩選獲得初篩菌林；所述初篩培養(yǎng)基終濃度組成如下亞胺基二乙腈5g/L，酵母膏6g/L,NaCllg/L,K2HP04lg/L,MgS04lg/L,溴鐘酚紫lg/L,瓊脂粉20g/L,溶劑為水，pH7.0;(2)復(fù)篩將步驟(l)獲得的初篩菌株接種至復(fù)篩培養(yǎng)基，100200r/min、2535。C下培養(yǎng)27d,收集菌體測定其腈水解酶活力；篩選出產(chǎn)亞氨基二乙酸含量高于10%的微生物，所述復(fù)篩培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油8g/L、酵母膏6g/L、NaCl1g/L、K2HP045g/L、MgSO40.2g/L,誘導(dǎo)劑b5g/L,溶劑為水，pH7.0;所述的誘導(dǎo)劑為b為正丁腈、異丁腈或己內(nèi)酰胺。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)初篩所述的培養(yǎng)溫度2830。C,培養(yǎng)34d。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)復(fù)篩所述的培養(yǎng)溫度為30~32°C。9.如權(quán)利要求18之一所述方法，所述產(chǎn)腈水解酶的菌林為下列之一(1)邊緣假單胞菌(尸化^fowomwwm^/""fo)ZJB09121，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209043，保藏日期2009年3月18日；(2)敏捷食酸菌(JaWovomx/ac/fe)ZJB09122,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209044,保藏日期2009年3月18日；(3)產(chǎn)酸克雷伯氏菌oqytoca)ZJB09123，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209045,保藏日期2009年3月18日；(4)弗氏紅球菌(W/zocfococcuswra泡/m^ra^)ZJB09124,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209046,保藏日期2009年3月18曰；(5)紫紅紅球菌(i/zo^coccwr/zoc/oc^roz^)ZJB09125，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209047，保藏日期2009年3月18日；(6)嗜吡咬紅5求菌(i/zodococc^^^n'&m'wnms)ZJB09126,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209048,保藏日期2009年3月18日；(7)赤紅球菌(i/w^cocc^)ZJB09127,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209049,保藏日期2009年3月18日；(8)惡臭假單胞菌(i^Wowowosp^a)ZJB09129,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209050,保藏日期2009年3月18日；(9)惡臭假單胞菌(尸seWomo"^)ZJB09135,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209055,保藏日期2009年3月18曰；(10)藤黃孩t球菌(楊'cracoccws/"few)ZJB09131,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209051,保藏日期2009年l月f18日；(11)耐鹽短桿菌(^^v沾acfer/Mm/za/otoera肪)ZJB09132，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209052,保藏日期2009年3月18曰；(12)惡臭假單胞菌(PseMtfo附卵a(bǔ)sZJB09134,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M209054,保藏日期2009年3月18日；(13)熒光假單胞菌(尸"^/o/wo"asy7womscem)ZJBO9137，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M20卯56,保藏日期2009年3月18曰；(14)糞產(chǎn)堿桿菌(尸化^fo/wo"必"en^'"os")ZJB09138,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072,保藏編號CCTCCNo:M209057,保藏日期2009年3月18日；(15)節(jié)桿菌(jw/2rak"er打/rragi/q/aco/〖c似)ZJUTB06-99,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo:M208252,保藏日期2008年12月11曰。全文摘要本發(fā)明提供了微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，所述的方法是利用產(chǎn)腈水解酶的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶，以腈水解酶做為生物催化劑生物催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸。本發(fā)明還涉及產(chǎn)腈水解酶的微生物的篩選方法和利用該方法篩選獲得了具有腈水解酶活性的菌株。該發(fā)明為采用生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸提供了基礎(chǔ)，具有重要應(yīng)用前景。文檔編號C12P13/04GK101629192SQ20091010087公開日2010年1月20日申請日期2009年7月16日優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日發(fā)明者濤張,徐建妙,柳志強(qiáng),沈寅初,薛亞平,鄭仁朝,鄭裕國申請人:浙江工業(yè)大學(xué)