專利名稱：一株根瘤菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株根瘤菌及其應(yīng)用，屬應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
尼古丁(Nicotine)，俗稱煙堿，是多種煙草的主要生物堿，是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一，也是煙草工業(yè)廢水和煙草廢棄物中的主要有害成分。煙堿對人的中樞神經(jīng)有強(qiáng)烈的刺激和麻痹作用，進(jìn)入人體內(nèi)90%被肺部吸收，進(jìn)入血液后6s即可到達(dá)大腦，它對人體最顯著的作用是對交感神經(jīng)產(chǎn)生影響，通常表現(xiàn)為短暫的興奮，緊接著就是抑制，因此少量的煙堿可以使人興奮，大量則會(huì)引起眩暈、嘔吐甚至中毒死亡。適量吸煙可以使人記憶力增強(qiáng)；但過度吸煙則對人的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用。 煙堿還有使人精神安定和抗憂郁作用，對人的緊張情緒有一定的鎮(zhèn)靜作用。煙堿也是一種環(huán)境有毒物質(zhì)，煙氣環(huán)境中就含有大量的煙堿，同時(shí)煙草加工過程也會(huì)產(chǎn)生許多含高濃度尼古丁等生物堿的廢物，這種廢物被認(rèn)為是“有毒的危險(xiǎn)廢物”，煙堿能溶于水，因此極易滲入到地下水中造成污染。因此有效地控制卷煙和環(huán)境中尼古丁的含量，對于維護(hù)人類健康有著深遠(yuǎn)的意義。國內(nèi)卷煙企業(yè)目前貯存的上部煙葉較多，一般因其煙堿含量較高而難以較多用于葉組配方中。這個(gè)問題已引起有關(guān)方面的重視，如何降低這些煙葉中的煙堿含量是各卷煙企業(yè)所面臨的一個(gè)現(xiàn)實(shí)問題，而當(dāng)前國內(nèi)研究較多的是如何從農(nóng)業(yè)田間管理方面考慮降低煙堿以及通過化學(xué)途徑來綜合調(diào)節(jié)卷煙的煙堿。因此，在工業(yè)上開展利用微生物對煙草進(jìn)行降解煙堿處理研究具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可以提高煙葉資源的利用率，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前，已有不少文獻(xiàn)報(bào)道過微生物在煙草工業(yè)上的研究和應(yīng)用情況，例如通過微生物的作用來降低煙堿的含量、制備天然香料和改善煙葉、再造煙葉及煙梗的內(nèi)在品質(zhì)等。 而且，在未來的很長一段時(shí)間內(nèi)，它仍將是煙草行業(yè)的一個(gè)熱門研究課題和研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株根瘤菌及其應(yīng)用，能夠有效降低煙草中尼古丁的含量。本發(fā)明從云南省紅河州彌勒縣多年種植煙草的土壤樣品中分離了一株具有降解尼古丁能力的細(xì)菌5- ，對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化性質(zhì)和16S rRNA基因序列分析，鑒定結(jié)果表明該細(xì)菌屬于根瘤菌屬，該菌株命名為根瘤菌(Sinorhizobium sp.)5_28。該菌株已經(jīng)保存在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國.北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期2011年11月3日；保藏號為CGMCC No. M43。根瘤菌5- 菌株的主要形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)為根瘤菌5- 菌落邊緣整齊、呈乳白色、較粘稠。在顯微鏡下觀察為短桿狀，革蘭氏染色陰性，硝酸鹽還原為陰性，接觸酶試驗(yàn)為陽性，能液化吲哚，不能液化明膠，不能水解淀粉，甲基紅(MR)實(shí)驗(yàn)陰性，苯丙氨基酸脫氨酶和乙酰甲基甲醇(V-P)實(shí)驗(yàn)均為陰性，檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)為陽性，苯丙氨基酸脫氨酶實(shí)驗(yàn)為陰性。本菌株對葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘露醇發(fā)酵不產(chǎn)酸。根瘤菌518菌株的分子鑒定特征為利用通用引物 20F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1500R(5，-GGTTACCTTGTTACGA CT-3，)，以根瘤菌 5-28的基因組DNA作為模板擴(kuò)增得到1500bp左右的PCR產(chǎn)物，回收測序、校正之后得到的5- 菌株的部分16S rRNA基因序列1446bp，該序列已經(jīng)遞交國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫 (GenBank)，序列的索引號為JN700177。本發(fā)明按常規(guī)方法用常規(guī)設(shè)備制備。即將根瘤菌518擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)后得到。本發(fā)明的根瘤菌應(yīng)用于制備降低煙草中尼古丁含量的生物催化劑中。本發(fā)明具有能調(diào)整煙葉原料的尼古丁含量，提高煙葉可用性，及能分解煙塵中的尼古丁，減少其對環(huán)境的污染的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為根瘤菌5- 耐受尼古丁的濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2為根瘤菌518降解尼古丁的生長曲線。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的1.根瘤菌5- 菌株的培養(yǎng)方法1)試管斜面培養(yǎng)采用Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基，重量百分比配方為1 %蛋白胨，1 %氯化鈉， 0.5%酵母提取物，2%瓊脂粉。121°C滅菌25分鐘，擺成斜面。接種Sinorhizobium sp. 5- ，28°C培養(yǎng)M小時(shí)，獲得試管種。2)液體擴(kuò)大培養(yǎng)A.種子培養(yǎng)，重量百分比配方為蛋白胨，氯化鈉，0.5%酵母提取物。 121°C滅菌25分鐘。接種Sinorhizobium sp. 5-28試管種培養(yǎng)12小時(shí)，獲得液體菌種。B.發(fā)酵培養(yǎng)基，Ig 尼古丁，0. 26g K2HPO4. 3H20,0. 8g KH2PO4,0.41g MgSO4. 7H20,
0.Ig CaSO4 · H20,0. 0039g NaMoO4,0. 005g FeSO4 · 7H20，0. 3g (NH4)2SO4,力口水至 IOOOmL, pH7.0。培養(yǎng)基初始pH7.0，接種量(體積百分比，￥八)2(%，轉(zhuǎn)速150印111，溫度觀1。發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)。2.根瘤菌5- 菌株耐受尼古丁濃度試驗(yàn)將培養(yǎng)12小時(shí)的液體菌種(0D· 0. 8)以(液體菌種體積百分比，ν/ν)的接種量接于尼古丁濃度梯度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，尼古丁的濃度梯度為Og/L、0. 5g/L、1.0g/L、
1.5g/L、2. 0g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L、4. Og/L和 4. 5g/L，轉(zhuǎn)速 150rpm，溫度 ，培養(yǎng)48 小時(shí)離心收集菌體，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌三次后用等體積緩沖液重懸并測定 OD600 (圖 1)。
由圖1的試驗(yàn)結(jié)果知根瘤菌518菌株在本試驗(yàn)條件下，最適生長的尼古丁濃度為1. 5g/L，最高尼古丁耐受濃度為2. 5g/L。3.根瘤菌5- 菌株降解尼古丁的生長曲線將培養(yǎng)12小時(shí)的液體菌種(0D· 0. 8)以(液體菌種體積百分比，ν/ν)的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度^°C，每隔2小時(shí)取菌液，用高效液相測定尼古丁含量，并測定0D_(圖2)。由圖2的試驗(yàn)結(jié)果知隨著根瘤菌5- 菌株在培養(yǎng)液中的OD6tltl值增加，尼古丁的濃度也逐漸下降。4.根瘤菌518菌株降解尼古丁菌制劑的制備利用發(fā)酵培養(yǎng)基制備IOOOmL的發(fā)酵液，SOOOrpm離心15min收集菌體，把菌體用滅菌的緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)進(jìn)行懸浮，SOOOrpm離心15min收集菌體，重復(fù)兩次，菌體細(xì)胞最后用50ml的緩沖液進(jìn)行懸浮，即能用于降解尼古丁。5.根瘤菌518制劑的降解煙葉中尼古丁試驗(yàn)分別稱取2g保山紅大C3F煙葉，噴灑5ml菌制劑，三個(gè)重復(fù)，反應(yīng)體系為30ml的 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，以未噴灑菌制劑的煙葉作為對照，置于^°C、150rpm搖床培養(yǎng)，每隔小時(shí)取樣一次，12000rpm離心5min，上清稀釋2倍后用過濾器(0. 45微米)過濾，最后用HPLC對煙堿進(jìn)行定量檢測(表1)。表1 根瘤菌5- 制劑降解煙葉中尼古丁的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株根瘤菌，其特征在于根瘤菌(Sinorhizobium sp.) 5-28已于2011年11月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. M43。
2.權(quán)利要求1所述的根瘤菌，其特征在于該根瘤菌應(yīng)用于制備降低煙草中尼古丁含量的生物催化劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株根瘤菌及其應(yīng)用，屬應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由生產(chǎn)菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后得到。生產(chǎn)菌株為根瘤菌(Sinorhizobium sp.)5-28，該菌株已于2011年11月3日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.5443該菌株具有較強(qiáng)的尼古丁降解能力和尼古丁毒性抗性能力，能在高達(dá)2.5g/L尼古丁濃度下生長。通過大量培養(yǎng)該菌株，利用該菌株的完整細(xì)胞為生物催化劑將純煙堿完全降解，同時(shí)能降解煙葉中的尼古丁含量。本發(fā)明具有能調(diào)整煙葉原料的尼古丁含量，也能分解煙草廢棄物中的尼古丁，減少卷煙對人體的危害和尼古丁對環(huán)境的污染的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號B01D53/54GK102433276SQ201110389039
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者張克勤, 楊金奎, 陳晨, 雷麗萍, 麻廣慧 申請人:云南大學(xué)