本發(fā)明涉及四環(huán)素檢測的，具體涉及一種鐵摻雜氧化銅納米酶及其在檢測四環(huán)素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、飼料中添加的獸藥種類比較多，其中四環(huán)素類藥物由于具有良好的廣譜抗菌作用而被廣泛應(yīng)用。在飼喂過程中加入適量的該類藥物可以起到殺菌作用，但是長期使用或過度使用易損害動物腎功能和造血系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。更嚴(yán)重的是，由于四環(huán)素類藥物在環(huán)境中不容易降解，還容易造成環(huán)境污染和食品安全問題。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第282號-2-2020《飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素的測定》中規(guī)定了使用高效液相色譜法-熒光檢測器測定四種四環(huán)素類的檢測限為3mg/kg。目前，tc的檢測的主要依賴于傳統(tǒng)方法，如生物傳感器法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、抗菌生物測定、高效液相色譜法（hplc）等。這些方法雖然具有高靈敏度和選擇性，但也存在一些問題，如耗時長、成本高、操作復(fù)雜，這些局限性限制了它們在現(xiàn)場的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法來快速檢測tc殘留尤其必要。

2、與傳統(tǒng)的儀器分析方法相比，比色法具有操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)且可通過目視直接檢測等優(yōu)點(diǎn)，實現(xiàn)現(xiàn)場化對tc的快速檢測，成為目前較為流行的一種檢測手段。如岳寧寧基于au納米酶與eu離子進(jìn)行絡(luò)合顯色的比色法檢測tc類抗生素，其功能性更多地依賴于其表面修飾和與其他分子的相互作用，但是其本身并不具備催化活性，該方法依賴于au納米酶的形態(tài)變化，對反應(yīng)條件非常敏感。專利cn114166772?a公開了一種利用cu-g-c3n4納米酶檢測四環(huán)素殘留的方法，其將cu-g-c3n4納米酶用作h2o2-tmb反應(yīng)的催化劑，利用四環(huán)素與cu-g-c3n4發(fā)生“π?-π堆積”產(chǎn)生阻塞作用控制催化h2o2-tmb的顯色程度，根據(jù)四環(huán)素濃度和顯色強(qiáng)度的關(guān)系建立起一種快速測定四環(huán)素的新方法，但是cu-g-c3n4納米酶的制備需要再高溫下進(jìn)行反應(yīng)，制備方法復(fù)雜、用時較長且成本高。專利cn?117233115?a公開了一種納米酶基快速檢測四環(huán)素或亞硝酸鹽的方法，以磷鎢酸和氯化銅為前驅(qū)，微波法合成具有類氧化酶活性的含銅磷鎢酸納米酶，但是其制備方法耗時長，檢測方法所用體系復(fù)雜且存在一定的毒性。

3、利用納米酶檢測四環(huán)素都是基于小尺寸納米酶具有較大的比表面積，能夠更好地與底物接觸發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)了反應(yīng)速率。但一些納米酶的催化活性仍然相對較低，限制了它們的潛在應(yīng)用，因此尋求一種穩(wěn)定性高、成本低、易于批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)的納米酶材料成為了熱。cu是許多天然酶的重要組成部分，大部分的納米酶都具有類氧化還原酶活性，包括過氧化氫酶（cat）、過氧化物酶（pod）、氧化酶（oxd）和超氧化物歧化酶（sod）等。牛嘉雪等人綜述了多種cu基納米酶的分類以及催化機(jī)理，發(fā)現(xiàn)cuo納米酶的催化活性仍然低于天然的類過氧化物酶，因此開發(fā)新的方法來提高cuo納米酶的活性仍然是一個挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種鐵摻雜氧化銅納米酶及其在檢測四環(huán)素中的應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種鐵摻雜氧化銅納米酶，所述鐵摻雜氧化銅納米酶由以下方法制備而成：

4、（1）將fecl2和cucl2溶于水中，攪拌均勻得到混合溶液；

5、（2）向混合溶液中加入naoh溶液，在60-80℃下攪拌1-3h，得到膠體溶液，經(jīng)冷卻、洗滌、過濾得到過濾物，將過濾物干燥，研磨，得到鐵摻雜氧化銅納米酶。

6、作為優(yōu)選，步驟（1）中，fecl2、cucl2和水加入量的比為（200-300）mg：（1800-2000）mg：（20-30）ml。

7、作為優(yōu)選，naoh溶液的濃度為14-16m，水和naoh溶液的加入量的體積比為5：1。

8、本發(fā)明的第二方面，提供上述鐵摻雜氧化銅納米酶及其在檢測四環(huán)素中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明的第四方面，提供一種利用上述鐵摻雜氧化銅納米酶檢測四環(huán)素的方法，包括以下步驟：

10、將鐵摻雜氧化銅納米酶溶液與不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液混各均勻，而后加入磷酸緩沖液中，在50-70℃下孵育10-20min；之后加入h2o2溶液與tmb溶液，反應(yīng)4-6?min，反應(yīng)后，過濾收集濾液，于652?nm處測定溶液吸光度，建立吸光度與四環(huán)素濃度的定量關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程；利用回歸方程對待測物中四環(huán)素的含量進(jìn)行檢測。

11、作為優(yōu)選，鐵摻雜氧化銅納米酶溶液的濃度為0.5-1.5mg/ml。

12、作為優(yōu)選，tmb溶液的濃度為1-3mg/ml、h2o2溶液的濃度為80-120?mm。

13、作為優(yōu)選，鐵摻雜氧化銅納米酶溶液、不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液、h2o2溶液與tmb溶液的添加量的比為（200-300）μl：（700-900）μl：（80-120）μl：（40-60）μl?。

14、作為優(yōu)選，所述磷酸緩沖液的ph值為2.5-3.5。

15、本發(fā)明使用比色法檢測tc機(jī)理如下：

16、首先，合成的?cuo?納米酶在?3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（tmb）/h2o2體系中表現(xiàn)出較高的過氧化物酶模擬活性。該反應(yīng)觸發(fā)h2o2分子的還原，并釋放關(guān)鍵的ros物質(zhì)（·oh），當(dāng)存tc分子時，tc首先被·oh氧化產(chǎn)生羥基化異構(gòu)體，然后通過取代或脫水過程迅速轉(zhuǎn)移到幾個中間體，產(chǎn)品進(jìn)一步氧化釋放，最后，這些產(chǎn)物被分解成?co2和h2o。根據(jù)?tc?降解的機(jī)制，·oh是溶液中釋放的主要ros，這是由于自由基（·ooh）配體給予?cuo?納米酶產(chǎn)生的·oh。所以，由于tc?的存在，使得·oh?更傾向于與tc共享e?，在tc和·oh?之間形成共價鍵。利用tc在cuo/tmb/?h2o2體系中的競爭行為，從而阻止·oh?直接與tmb?反應(yīng)。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、1、本發(fā)明通過肉眼半定量地觀察溶液的顏色變化，即可粗略判斷tc的含量，cuo、fex-cu1-xo納米酶對tc的檢測下限分別為558.1?nm、400.7?nm，證明fe摻雜對cuo進(jìn)行了良好的改性，有效的增加了cuo納米酶的酶催化能力，對tc有更低檢測下限。本發(fā)明為四環(huán)素的簡單、快速檢測提供了參考。

19、2、本發(fā)明以fecl2和cucl2為鐵源和銅源制備納米酶方法快速、成本低，檢測方法所涉及體系簡單、綠色環(huán)保。

技術(shù)特征：

1.一種鐵摻雜氧化銅納米酶，其特征在于，所述鐵摻雜氧化銅納米酶由以下方法制備而成：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵摻雜氧化銅納米酶，其特征在于，步驟（1）中，fecl2、cucl2和水加入量的比為（200-300）mg：（1800-2000）mg：（20-30）ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵摻雜氧化銅納米酶，其特征在于，naoh溶液的濃度為14-16m，水和naoh溶液的加入量的體積比為5：1。

4.權(quán)利要求1-3任一項所述的鐵摻雜氧化銅納米酶在檢測四環(huán)素中的應(yīng)用。

5.利用權(quán)利要求1-3任一項所述的鐵摻雜氧化銅納米酶檢測四環(huán)素的方法，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，鐵摻雜氧化銅納米酶溶液的濃度為0.5-1.5mg/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，tmb溶液的濃度為1-3mg/ml、h2o2溶液的濃度為80-120mm。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，鐵摻雜氧化銅納米酶溶液、不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液、h2o2溶液與tmb溶液的添加量的比為（200-300）μl：（700-900）μl：（80-120）μl：（40-60）μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液的ph值為2.5-3.5。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種鐵摻雜氧化銅納米酶及其在檢測四環(huán)素中的應(yīng)用，屬于四環(huán)素檢測的技術(shù)領(lǐng)域，所述鐵摻雜氧化銅納米酶由以下方法制備而成：將FeCl<subgt;2</subgt;和CuCl<subgt;2</subgt;溶于水中，攪拌均勻得到混合溶液；向混合溶液中加入NaOH溶液，在60?80℃下攪拌1?3h，得到膠體溶液，經(jīng)冷卻、洗滌、過濾、干燥，研磨，得到鐵摻雜氧化銅納米酶。本發(fā)明通過肉眼半定量地觀察溶液的顏色變化，即可粗略判斷TC的含量，CuO、Fe<subgt;x</subgt;?Cu<subgt;1?x</subgt;O納米酶對TC的檢測下限分別為558.1?nM、400.7?nM，證明Fe摻雜對CuO進(jìn)行了良好的改性，有效的增加了CuO納米酶的酶催化能力，對TC有更低檢測下限。

技術(shù)研發(fā)人員：付穎,杜園園,王瑞雪,高星,田金鋒,郭超,黃圓圓
受保護(hù)的技術(shù)使用者：齊魯理工學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21