專利名稱：一種均相特異性檢測核酸的探針及應用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種均相特異性檢測核酸的探針。
用探針特異性檢測核酸一般都需要將未雜交的探針分離出來，而均相檢測方法則不須分離步驟，具有反應速率快，操作簡單，容易定量等突出優(yōu)點。如Molecular beacons技術(shù)。
均相核酸檢測近幾年在核酸擴增中應用廣泛。如聚合酶鏈式反應(PCR)，這是一種80年代后期發(fā)展起來的一種體外擴增核酸片段的技術(shù)，可在數(shù)小時內(nèi)使特定的核酸片段擴增至幾百萬倍。該項技術(shù)自發(fā)明以來已廣泛應用于生物和醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域。早期的PCR是通過電泳來檢測結(jié)果，其操作繁瑣，不能進行實時監(jiān)測。實時熒光PCR是近幾年發(fā)展起來的新檢測技術(shù)，具有諸多優(yōu)點，尤其在臨床診斷中優(yōu)勢明顯。由于采用閉管測定方式，消除了傳統(tǒng)凝膠電泳或其它非均相方法的擴增產(chǎn)物污染的隱患，從而在測定步驟中杜絕了假陽性的主要來源。并且通過實時動態(tài)監(jiān)測可以獲得準確的原始模板定量，動態(tài)范圍也較終點測定方式大大加寬。同時熒光測定在分析靈敏度、簡便性等方面都具有明顯優(yōu)勢。
目前實時熒光PCR檢測技術(shù)已有多種方式，可以分為非探針型和探針型兩類。非探針型有熒光嵌入劑法、Sunrise Primer(又稱Amplifluor)、AmpliSensor等；探針型包括5’—核酸外切酶技術(shù)(TaqMan探針)、分子信標(molecularbeacon)技術(shù)、應用于Lightcycler的雙探針技術(shù)、蝎子引物(Scorpions primer)等。前者由于無法識別非特異擴增產(chǎn)物，在實際應用中受到很大限制。后一種類型，由于增加了探針識別步驟，提高了測定的可靠性，但普遍存在實驗設計復雜，價格高昂等缺點，并且有些方法識別單堿基突變的能力不強。
本發(fā)明設計的熒光雙鏈探針，可以均相特異性檢測核酸，要求的實驗設計簡單，可操作性強。在保證特異性和靈敏度的同時，實現(xiàn)對核酸的測定。
熒光雙鏈探針的構(gòu)成熒光雙鏈探針是一對(兩條)按照脫氧核糖核酸(DNA)堿基互補配對原則而反向互補的寡核苷酸，兩條鏈長度不同。因為兩條鏈不等長，所以從整體上看探針可以分為兩部分，一是單鏈的觸手區(qū)，一是雙鏈區(qū)。這種探針我們稱為“觸手探針”。在其中的一條寡核苷酸上標記熒光供體，在另一條寡核苷酸上標記熒光受體或淬滅劑。并且探針序列與靶序列互補，可以發(fā)生雜交反應。熒光雙鏈探針在不同的條件下可以形成多種形態(tài)，并且伴隨熒光強度的改變。探針兩條鏈在穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，淬滅劑靠近熒光劑，熒光劑的熒光被淬滅，此時探針沒有熒光；在酸、堿、熱等條件下探針分開成兩條單鏈，淬滅劑遠離熒光劑，熒光劑發(fā)出熒光；當恢復至溫和條件，兩條鏈復性為雙鏈狀態(tài)，淬滅劑靠近熒光劑，探針沒有熒光；當有靶序列存在時，探針的兩條鏈分別與各自互補的靶序列雜交，兩條鏈因此而分開，淬滅劑遠離熒光劑，熒光劑發(fā)出熒光。探針的應用主要有以下兩方面“觸手探針”與靶序列自發(fā)地發(fā)生置換式雜交反應“觸手探針”可以與溶液中的單鏈靶序列發(fā)生置換式雜交反應，探針的“觸手”是單鏈的，它會首先與溶液中的單鏈靶序列碰撞結(jié)合，然后靶序列將置換短鏈與長鏈形成更穩(wěn)定的靶序列和長鏈的雜交體，此時探針的長鏈和短鏈分離，熒光劑遠離淬滅劑，探針發(fā)出熒光。見

圖1。
用“觸手探針”PCR反應的實時監(jiān)測所述的熒光雙鏈探針在進行PCR檢測中，兩條寡核苷酸的3’端必須進行封閉，使其不能作為引物延伸。
在由熒光雙鏈探針存在的PCR反應混合體系中，進入熱變性階段，“觸手探針”和模板均發(fā)生變性，熒光劑遠離淬滅劑，熒光性質(zhì)得以恢復。
溫度降低至退火溫度時，如果沒有靶序列的存在，兩條探針將恢復至雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光劑與淬滅劑靠近，熒光劑被淬滅；如果有靶序列的存在，兩條探針將分別與靶序列雜交，使兩條探針無法恢復至雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光劑遠離淬滅劑，熒光劑發(fā)出熒光。
在PCR的延伸階段，因為高溫兩條探針從靶序列上解離，使延伸反應順利進行。然后進入下一個循環(huán)。
由以上過程可見，我們可以通過實時熒光PCR儀在PCR反應的復性階段檢測熒光的變化，從而動態(tài)監(jiān)測靶序列的有無及含量。見圖2。
熒光雙鏈探針的設計方法1.兩條鏈的長度兩條鏈一般不等長，探針的堿基互補配對使其呈雙鏈結(jié)構(gòu)，長出的“觸手”長度最好在2-10核苷酸之間。
2.熒光劑和淬滅劑的標記位置熒光劑和淬滅劑可以標記在探針的頂端也可標記在探針的中間，但最好標記在同一對互補的堿基上，這樣熒光劑和淬滅劑的位置很近，可以達到最大的淬滅效率。
3.做PCR實驗所用儀器和數(shù)據(jù)采集可以使用PE公司PE-7700儀器，BIO-RAD公司iCycler儀器，ROCHE公司Lightcycler儀器，THE ROTER-GENE公司GP2000儀器等，熒光數(shù)據(jù)在退火時采集。
“觸手探針”的積極效果；1.探針設計簡單，實驗成功率高對探針設計以及整個反應體系沒有太多要求，整個系統(tǒng)非常簡單，容易掌握。
2.探針制備較簡單熒光雙鏈探針的標記是寡核苷酸的單一熒光物質(zhì)修飾，可以通過固相合成直接制備，純化一步完成，因此產(chǎn)率也高。其它的探針或引物，多數(shù)為雙修飾(雙端修飾或內(nèi)部插入修飾)，且須按照彼此的規(guī)則進行特殊處理，雙修飾純化繁瑣，產(chǎn)率低，價格也較昂貴。
3.特異性高有文獻報道，能量限制型探針的特異性高于非能量限制型探針，在已有的熒光PCR技術(shù)中只有分子信標(molecular beacon)是分子內(nèi)能量限制型探針，它與靶序列雜交所釋放的能量必須高于分子信標本身閉和成發(fā)夾結(jié)構(gòu)所釋放的能量，所以它的特異性高于線性探針的特異性。而觸手探針是一種分子間能量限制型探針，它與靶序列雜交所釋放的能量也必須高于兩條鏈互相復性所釋放的能量。這樣就保證了探針雜交的高特異性，即如果靶序列發(fā)生了突變或有非特異擴增產(chǎn)物，熒光標記雙鏈探針將自身恢復至雙鏈狀態(tài)，不會形成非特異雜交體。
圖1.自發(fā)雜交反應原理2.熒光雙鏈探針實時檢測PCR產(chǎn)物原理3.熒光雙鏈探針檢測靶序列結(jié)果4.熒光雙鏈探針實時檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果圖實施例一與靶序列自發(fā)地發(fā)生置換式雜交反應在探針的兩條鏈已穩(wěn)定結(jié)合成雙鏈結(jié)構(gòu)的溶液中，加入過量的寡核苷酸靶序列，可以觀測到熒光強度升高了20倍以上。圖3。靶序列和熒光雙鏈探針的置換反應是特異的，加入的核酸必須是完全與探針互補的，否則即使有一個堿基的不同也不能發(fā)生置換反應，熒光強度不會升高。圖3。
自發(fā)進行置換式雜交反應探針由上海申友技術(shù)公司合成，長鏈5’-FAM-ACG AAC CTC AAA CAG ACA CCA T-3’；短鏈5’-TGT CTG TTT GAG GTTGCT-DABCYL-3’。50μL反應液，內(nèi)含10mM Tris-HCl pH8.0，1.5mM MgCl2，兩探針分別為0.8μ mol/L，先94℃變性2分鐘，再50℃雜交5分鐘，使兩條鏈成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，在25℃測定熒光強度5分鐘，然后加入靶序列，野生靶序列5’-CCA TGG TGT CTG TTT GAG GTT GCT-3’突變探針5’-CCA TGG TGT CTGTTT CAG GTT GCT-3’，下畫線堿基為突變堿基。靶序列的終濃度為探針濃度的2倍，然后每分鐘測定1次。由圖3可見完全互補地靶序列(◆)熒光升高20倍以上，而點突變序列(■)熒光強度幾乎沒有升高。
實施例二人β-珠蛋白熒光標記雙鏈探針實時熒光PCR檢測一、擴增片段及引物和探針擴增人β-珠蛋白基因，擴增片段長268bp。
引物為5’-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3’5’-CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3’
探針為不等長雙鏈探針，兩條鏈按照堿基互補配對原則反向互補5’-FAM-AGC AAC CTC AAA CAG ACA CCA TGG-3’-封閉，5’-TGT CTG TTT GAG GTT GCT-Dabcyl-3’。
引物和探針由上海申友生物技術(shù)公司合成。
二、樣品提取正常人外周血由實驗室志愿者提供。用淋巴細胞液分離法分離血液白細胞和用常規(guī)酚氯仿抽提，乙醇沉淀法提取白細胞DNA。
三、PCR反應PCR反應總體積為50μL，內(nèi)含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，，2.0U Taq酶，200μ mol/L dNTP，2.0mmol/L MgCl2，0.4μmol/L兩引物，0.2μmol/L探針，各梯度模板5μL。經(jīng)95℃，5min預變性，再95℃ 30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，40個循環(huán)后。熒光數(shù)據(jù)采集在退火階段即50℃時采集。結(jié)果見圖4。
權(quán)利要求
1.一種均相特異性檢測核酸的探針，其特征是兩條鏈分別標記熒光劑和淬滅劑的雙鏈寡核苷酸探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的均相特異性檢測核酸的探針，其特征在于雙鏈探針是兩條根據(jù)堿基互補配對原則而反向互補的寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的均相特異性檢測核酸的探針，其特征在于兩條寡核苷酸鏈不等長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的均相特異性檢測核酸的探針，其特征在于雙鏈探針的兩條鏈分別標記熒光供體和受體，使其在探針和靶序列雜交時可以發(fā)生熒光強度的改變。
5.根據(jù)權(quán)利要求1均相特異性檢測核酸的探針，其特征在于特異性檢測核酸時雙鏈探針序列與待測核酸序列堿基互補。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的均相特異性檢測核酸的探針，其特征在于雙鏈探針的兩條鏈3’端用化學基團封閉，使其不能作為引物延伸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的均相特異性檢測核酸的探針，其特征在于熒光劑和淬滅劑分別標記在兩條鏈上，并且是在同一對互補的核苷上，并且是在兩條鏈的3’端或5’端。
8.一種應用“觸手探針”自發(fā)地均相檢測溶液中的單鏈核酸的方法，其特征是熒光雙鏈探針的溶液中，加入單鏈核酸靶序列，可以觀測到熒光強度的升高。
9.一種應用“觸手探針”實時檢測PCR擴增產(chǎn)物的方法，其特征在于可以在PCR反應的退火階段實時監(jiān)測擴增產(chǎn)物，而不必分離未雜交的探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的均相特異性檢測核酸的探針及應用方法。這種探針由兩條分別標記熒光劑和淬滅劑并且反向互補的寡核苷酸組成,正常條件下,探針因堿基互補而成雙鏈結(jié)構(gòu),當與靶序列雜交時可以發(fā)生熒光信號的改變。這種探針可以在室溫自發(fā)地與靶序列發(fā)生置換式雜交,從而檢測核酸是否存在。而單堿基突變的靶序列則不能發(fā)生雜交反應。另外,還可以利用熒光雙鏈探針對PCR反應進行實時檢測。
文檔編號G01N33/53GK1348096SQ0110144
公開日2002年5月8日 申請日期2001年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月10日
發(fā)明者欒國彥, 李慶閣, 梁基選 申請人:欒國彥, 李慶閣, 梁基選