專利名稱：肝細(xì)胞癌相關(guān)基因和蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地是癌癥研究領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及新的蛋白，ZNFN3A1，其參與肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增生機(jī)制。本發(fā)明蛋白能夠被用來，例如，作為開發(fā)抗肝癌藥物的靶分子。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的癌癥之一，而且它的發(fā)病率在日本以及美國正逐漸升高(Akriviadis EA等，Br J Surg.1998 Oct；85(10)1319-31)。雖然最近的醫(yī)學(xué)進(jìn)展已經(jīng)在診斷方面取得很大進(jìn)步，很多HCC患者仍然是在晚期才被診斷出，而且他們的疾病依然很難完全治愈。此外，由于肝硬變或慢性肝炎患者具有HCC的高風(fēng)險(xiǎn)，它們可能形成多發(fā)肝腫瘤，或者甚至在完全除去原始腫瘤后形成新腫瘤。因此，開發(fā)高效化療藥物和預(yù)防策略是迫切關(guān)心的問題。
最近的分子生物學(xué)進(jìn)展表明多步驟過程在肝癌起源和發(fā)展為結(jié)腸腫瘤的過程中構(gòu)成了肝癌發(fā)生的基礎(chǔ)。這些過程包括各種基因產(chǎn)物的定性和定量改變。在一HCC亞群中，在包括TP53和AXIN1在內(nèi)的腫瘤抑制基因、以及諸如c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1和s-連環(huán)蛋白等癌基因中觀察到基因改變(Tanaka S等，Cancer Res.1993 Jun 15；53(12)2884-7；Satoh S等，NatGenet.2000 Mar；24(3)245-50)。在肝腫瘤細(xì)胞中的染色體區(qū)4q、6q、8p、8q、9p、9q、13q、16p、16q和17p已經(jīng)報(bào)道了頻繁的雜合性的丟失(LOH)(Feitelson MA等，Oncogene 2002 Apr 11；21(16)2593-604)。除了這些基因改變之外，許多基因例如TGFα的表達(dá)在改變在肝癌發(fā)生中發(fā)揮著作用(LeeGH等，Cancer Res 1992 Oct 1；52(19)5162-70)。
發(fā)明概述本發(fā)明人以前分析了肝細(xì)胞癌中基因的基因組范圍內(nèi)表達(dá)并鑒定了許多傾向于參與肝癌發(fā)生的基因。我們還公開了與患者體內(nèi)的肝炎病毒類型、腫瘤的組織學(xué)等級以及它們的血管浸潤狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的基因(Okabe H等，Cancer Res.2001 Mar 1；61(5)2129-37)。雖然已經(jīng)鑒定了一些腫瘤抑制基因，例如p53和p16INK4A的失活，但迄今為止還沒有哪個(gè)已知的癌基因被證明在肝細(xì)胞癌中通常是激活的。
本申請?zhí)峁┝朔蛛x的在肝細(xì)胞癌中過表達(dá)的基因ZNFN3A1，并鑒定出一種具有鋅指結(jié)構(gòu)域和SET結(jié)構(gòu)域的癌蛋白。該新基因ZNFN3A1的表達(dá)在HCC中常常是上調(diào)的，并傾向于通過轉(zhuǎn)錄激活性RNA聚合酶II復(fù)合體賦予癌細(xì)胞致癌活性，這種致癌活性，反過來，增強(qiáng)靶基因，包括EGFR的轉(zhuǎn)錄。因此，ZNFN3A1充當(dāng)HCC的新的分子靶。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供參與肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖機(jī)制的新蛋白和編碼該蛋白的基因，以及制備并利用它們診斷和治療肝細(xì)胞癌(HCC)的方法。
發(fā)明人著手發(fā)現(xiàn)治療HCC的藥物發(fā)現(xiàn)的新靶標(biāo)。因此，他們利用全基因組cDNA微陣列分析了HCC的表達(dá)概況。本文報(bào)道的是新的人類基因ZNFN3A1的鑒定，它的表達(dá)在大多數(shù)HCC中與相應(yīng)的非癌肝組織相比顯著升高。ZNFN3A1 cDNA由1622個(gè)核苷酸組成，它含有一個(gè)1284個(gè)核苷酸的開放讀框，編碼公認(rèn)的帶有鋅指基元的428個(gè)氨基酸的蛋白。有意思的是，ZNFN3A1蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞周期的進(jìn)展過程中或者由于培養(yǎng)細(xì)胞的密度而發(fā)生改變；當(dāng)細(xì)胞在S期中期到晚期或者培養(yǎng)在稀疏(sparse)條件下時(shí)，它在核中積聚，而當(dāng)它們處于其它階段和生長于密集條件下時(shí)，它定位于胞漿及核中。此外，ZNFN3A1直接與RNA螺旋酶KIAA0054結(jié)合，并與RNA聚合酶II形成復(fù)合體，通過該復(fù)合體與5’側(cè)翼區(qū)“(C)CCCTCC(T)”元件的直接結(jié)合，它激活下游基因包括表皮生長因子受體(EGFR)的轉(zhuǎn)錄。一致地，ZNFN3A1在NIH3T3細(xì)胞中的外源表達(dá)使細(xì)胞生長增加，而用反義S-寡核苷酸阻抑它的表達(dá)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌細(xì)胞顯著的生長抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明ZNFN3A1通過與RNA螺旋酶和RNA聚合酶II形成復(fù)合體，轉(zhuǎn)錄激活包括EGFR在內(nèi)的靶基因，從而賦予癌細(xì)胞致癌活性，而且抑制該復(fù)合體的活性應(yīng)該是有前景的治療HCC的策略。
因此，本發(fā)明涉及參與細(xì)胞增殖的新的ZNFN3A1蛋白和編碼它們的基因，以及它們的制備和應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明提供了以下這些本申請?zhí)峁┝舜龠M(jìn)細(xì)胞增殖和靶基因轉(zhuǎn)錄激活的新的人類蛋白ZNFN3A1或其功能等價(jià)體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ZNFN3A1蛋白包括由SEQ.ID.NO.1的開放讀框編碼的公認(rèn)的具有鋅指基元的428個(gè)氨基酸的蛋白。鋅指結(jié)構(gòu)域(MYND)位于密碼子49-87而SET(Su 3-9，zeste增強(qiáng)子，Trihorrax)結(jié)構(gòu)域位于密碼子117-246。ZNFN3A1蛋白優(yōu)選包括SEQ.ID.NO.2所示的氨基酸序列。本申請還提供分離的由至少一部分ZNFN3A1多核苷酸序列、或者有至少15％，更優(yōu)選至少25％與SEQ.ID.NO.1所示的序列互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼的蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步提供新的人類基因ZNFN3A1，它的表達(dá)在大多數(shù)HCC中與相應(yīng)的非癌肝組織相比顯著升高。分離的ZNFN3A1基因包括如SEQ.ID.NO.1中所描述的多核苷酸序列。特別地，ZNFN3A1 cDNA包括含有1284個(gè)核苷酸的開放讀框的1622個(gè)核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋與SEQ.ID.NO.1所示的多核苷酸序列雜交并至少有15％，更優(yōu)選至少25％與之互補(bǔ)的多核苷酸，只要它們編碼ZNFN3A1蛋白或其功能等價(jià)體。這種多核苷酸的例子是SEQ.ID.NO.1的簡并序列。
如本文所用，“分離的ZNFN3A1基因”是指其結(jié)構(gòu)與天然存在的多核苷酸或者天然存在的跨越3個(gè)以上獨(dú)立基因的基因組多核苷酸片段不同的多核苷酸。因此該術(shù)語包括，例如(a)具有其天然存在的生物體基因組中天然存在的基因組DNA分子的部分序列的DNA；(b)摻入到載體或者原核生物或真核生物基因組DNA中，從而使所產(chǎn)生的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不同的多核苷酸；(c)獨(dú)立的分子例如cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備的片段或者限制性片段；和(d)雜合基因，即編碼融合多肽的基因的部分重組核苷酸序列。該定義具體排除的是存在于不同(i)DNA分子，(ii)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或(iii)細(xì)胞克隆的混合物中的DNA分子的多核苷酸；例如，象存在于DNA文庫例如cDNA或基因組DNA文庫的中的這些多核苷酸。
因此，在一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述的多肽的分離的多核苷酸或其片段。優(yōu)選地，分離的多肽包括與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少60％同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，分離的核酸分子與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在分離的多核苷酸長度比參照序列，如SEQ ID NO1更長或相等的情況下，比較是與參照序列的全長進(jìn)行的。當(dāng)分離的多核苷酸比參照序列短，例如比SEQ ID NO1短的時(shí)候，比較是與相同長度的參照序列片段進(jìn)行的(排除任何同源計(jì)算所需的環(huán))。
還提供了包括ZNFN3A1蛋白和至少一個(gè)它的共激活因子的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體。在一個(gè)實(shí)施方案中，共激活因子可以是RNA螺旋酶和/或RNA聚合酶。RNA螺旋酶可以是RNA螺旋酶KIAA0054。RNA聚合酶可以是RNA聚合酶II。在一種形式中，復(fù)合體包括ZNFN3A1蛋白、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II。轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體通過與EGFR基因5’側(cè)翼區(qū)“(C)CCCTCC(T)”元件的直接結(jié)合，可以激活包括表皮生長因子受體(EGFR)在內(nèi)的基因的轉(zhuǎn)錄。
本申請還提供了治療癌癥的治療劑。治療劑可以被描述為如(SEQ.ID.NO.3)中所示的多核苷酸序列。治療劑還可以被描述為如SEQ.ID.NO.1中所顯示和描述的ZNFN3A1多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的至少一部分。合適的反義S-寡核苷酸是5’-GCGGGAGGATGGAGCC-3’(SEQ.ID.NO.3)。治療劑可以適當(dāng)?shù)赜脕碇委煾渭?xì)胞癌細(xì)胞。治療劑的作用療程期望可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長。治療劑可以施用于哺乳動物包括人和馴化的哺乳動物。
本申請還提供了識別ZNFN3A1蛋白的抗體。部分地，還提供了ZNFN3A1基因的反義DNA、核酶及RNAi(RNA干擾物)。
進(jìn)一步地，提供了篩選抗癌劑候選化合物的方法。該方法包括使ZNFN3A1多肽與候選化合物進(jìn)行接觸，并選擇與ZNFN3A1多肽結(jié)合的化合物。
ZNFN3A1多肽還可以在共激活因子存在下，在形成ZNFN3A1多肽和其共激活因子的復(fù)合體的合適條件下，與候選化合物進(jìn)行接觸。然后可以選擇抑制該復(fù)合體形成的化合物。共激活因子包括RNA螺旋酶和/或RNA聚合酶II。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選抗癌劑候選化合物的方法，其中該方法包括使ZNFN3A1多肽、它的共激活因子以及含有多肽靶序列的DNA與候選化合物，在形成ZNFN3A1多肽和該DNA的復(fù)合體的合適條件下接觸，并選擇抑制該復(fù)合體形成的化合物。靶序列期望是側(cè)接EGFR 5’區(qū)的CBS序列。
還提供了篩選抗癌劑候選化合物的方法，其中該方法包括使ZNFN3A1多肽、它的共激活因子以及具有為所述多肽和共激活因子復(fù)合體識別的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的報(bào)告基因，與候選化合物，在表達(dá)報(bào)告基因的合適條件下進(jìn)行接觸，并選擇抑制報(bào)告基因表達(dá)的化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷癌癥的方法，包括測定標(biāo)本生物樣品中ZNFN3A1基因的表達(dá)水平，將ZNFN3A1基因的表達(dá)水平與正常樣品相比較，并將樣品中ZNFN3A1基因的高表達(dá)水平判定為具有癌癥。癌癥適當(dāng)?shù)厥歉渭?xì)胞癌。
本發(fā)明還提供了通過用編碼ZNFN3A1蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并表達(dá)該多核苷酸序列來制備蛋白的方法。
應(yīng)當(dāng)理解前述的發(fā)明概述以及下列的詳細(xì)說明是優(yōu)選的實(shí)施方案，并非限制本發(fā)明或本發(fā)明其它備選的實(shí)施方案。


圖1A-1C描繪了A6681和ZNFN3A1在HCC中的表達(dá)。圖1A描繪了通過cDNA微陣列所檢測到的A6681在20個(gè)原發(fā)性HCC中的相對表達(dá)比例。它的表達(dá)在通過截留濾膜的12個(gè)臨床HCC中有11個(gè)(91.7％)顯著上調(diào)(Cy3和Cy5信號都大于25,000)。圖1B的照片呈現(xiàn)了通過RT-PCR產(chǎn)物的溴乙錠染色所顯示的描繪HCC候選基因表達(dá)(T，腫瘤組織；N，正常組織)。GAPDH的表達(dá)起內(nèi)部對照的作用。圖1C的照片描繪A6681在各種成人組織中的多-組織RNA印跡試驗(yàn)。
圖2A描繪了預(yù)測的ZNFN3A1蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白基元。ZNFN3A1蛋白基元是通過簡單模塊構(gòu)造研究工具(Simple Modular Architecture ResearchTool，SMART)預(yù)測的。圖2B描繪了ZNFN3A1和AK010447的公認(rèn)氨基酸序列之間的同源性。zf-MYND[鋅指蛋白(包含MYND結(jié)構(gòu)域)]結(jié)構(gòu)域(A)和SET[(Su(var)3-9，zeste增強(qiáng)子，Trithorax)]結(jié)構(gòu)域(B)分別表現(xiàn)出94％和95％的同一性。
圖3A-3R的照片顯示經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)，尤其熒光免疫組化染色所觀察到的ZNFN3A1亞細(xì)胞定位。圖3A-3C的熒光顯微照片顯示，被表達(dá)EGFP-標(biāo)記性ZNFN3A1的質(zhì)粒(pEGFP-ZNFN3A1)DNA轉(zhuǎn)染的SNU475細(xì)胞。FITC(g、j、m、p)、DAPI(h、k、n、q)、merge(i、l、o、r)。圖3D-3F的熒光顯微照片顯示，表達(dá)FLAG-標(biāo)記性ZNFN3A1的質(zhì)粒(pFLAG-ZNFN3A1)DNA轉(zhuǎn)染的SNU475細(xì)胞。抗-FLAG(d)、DAPI(e)、merge(f)。圖3G-3R的熒光顯微照片顯示ZNFN3A1在SNU475細(xì)胞(g-1)和SNU423細(xì)胞(m-r)中的內(nèi)源表達(dá)?？?ZNFN3A1(g、j、m、p)、DAPI(h、k、n、q)、merge(i、l、o、r)。細(xì)胞以低濃度(1.25×104細(xì)胞/孔)(g-I、m-o)和高濃度(1.0×105細(xì)胞/孔)(j-l、p-r)接種。
圖4A和4B描繪的是細(xì)胞周期進(jìn)程對ZNFN3A1亞細(xì)胞定位的影響。圖4A描繪的是通過阿非迪霉素(aphidicolin)同步化的Huh7細(xì)胞的FACS分析。通過與7.5μg/ml阿非迪霉素溫育36h將細(xì)胞生長阻抑在G1期，并通過去除阿非迪霉素而自G1解除。FACS于0、4、8和12h后進(jìn)行。圖4B的圖片顯示內(nèi)源ZNFN3A1蛋白在經(jīng)阿非迪霉素處理而同步化的Huh7中的熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
圖5A-5D描繪了ZNFN3A1在NIH3T3中的生長促進(jìn)效果。圖5A是描繪ZNFN3A1在NIH3T3細(xì)胞中的集落形成試驗(yàn)結(jié)果的圖片，比較了ZNFN3A1模擬物、NIH3T3-反義ZNFN3A1和NIH3T3-有義ZNFN3A1的表達(dá)。圖5B描繪了通過電子光密度測定計(jì)數(shù)的集落數(shù)。集落通過電子光密度測定計(jì)數(shù)。集落數(shù)表示為三份板的均值±SD。(*)表示由Fisher’s保護(hù)性最小顯著性檢驗(yàn)(Fisher’s protected least significant test)所測定的顯著性差異(p＜0.05)。圖5C的圖片顯示穩(wěn)定表達(dá)ZNFN3A1的NIH3T3細(xì)胞的生長誘導(dǎo)。ZNFN3A1 mRNA在穩(wěn)定-轉(zhuǎn)染體(NIH3T3-ZNFN3A1)細(xì)胞中的表達(dá)通過RT-PCR測定。圖5D描繪了通過錐蟲藍(lán)染色法所檢測到的細(xì)胞數(shù)目的時(shí)間曲線。
圖6A-6E顯示設(shè)計(jì)用于阻抑ZNFN3A1的反義S-寡核苷酸的生長阻抑效果。圖6A顯示設(shè)計(jì)用于阻抑ZNFN3A1的有義(Se)或反義(As)寡核苷酸構(gòu)建物。圖6B的圖片顯示ZNFN3A1在SNU475細(xì)胞中的表達(dá)，所述細(xì)胞用有義(Se)或者反義(As)寡核苷酸處理24h，經(jīng)RT-PCR和利用抗-ZNFN3A1抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡來檢測。圖6C的圖片顯示，利用ZNFN3A1 mRNA的有義或反義寡核苷酸在Huh7、Alexander、SNU423和SNU475細(xì)胞中進(jìn)行的集落形成試驗(yàn)。反義寡核苷酸(As)阻抑生長。圖6D顯示MIT試驗(yàn)的結(jié)果，它評估了在有義或反義寡核苷酸處理Huh7、Alexander、SNU423和SNU475細(xì)胞72小時(shí)后的細(xì)胞存活能力。圖6E顯示FACS分析結(jié)果，它評估Huh7細(xì)胞經(jīng)有義(Se)或反義(As)寡核苷酸處理72小時(shí)后的細(xì)胞周期。
圖7A-7C描繪了ZNFN3A1和RNA螺旋酶KIAA0054之間的相互作用。在圖7A中，繪制了KIAA0054的保守結(jié)構(gòu)域以及與ZNFN3A1結(jié)合的區(qū)域。圖7B呈現(xiàn)了描繪酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖片，其中含有ZNFN3A1的pAS2-1與含有兩種不同長度KIAA0054的文庫載體共-轉(zhuǎn)染到酵母菌株AH109中。結(jié)果顯示了在酵母菌株AH109中ZNFN3A1和KIAA0054之間結(jié)合的確認(rèn)信息。圖7C呈現(xiàn)了描繪在哺乳動物細(xì)胞中ZNFN3A1和KIAA0054之間結(jié)合的確認(rèn)信息的圖片。來自HeLa細(xì)胞的裂解物與抗-FLAG或抗-HA抗體免疫沉淀。免疫沉淀物用抗-HA或抗-FLAG抗體通過免疫印跡分析。對裂解物直接進(jìn)行免疫印跡分析，作為對照。
圖8的圖片證明ZNFN3A1與KIAA0054的相互作用是通過SET結(jié)構(gòu)域和KIAA0054的C-末端區(qū)域介導(dǎo)。分析了ZNFN3A1缺失構(gòu)建物在雙雜交系統(tǒng)中與KIAA0054的C-末端區(qū)域相互作用的能力。
圖9的圖片證明RNA螺旋酶KIAA0054與ZNFN3A1和RNA聚合酶II在體內(nèi)結(jié)合。細(xì)胞提取物是從由轉(zhuǎn)染了8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1(完整)和pCMV-HA-KIAA0054(全長)表達(dá)載體的HeLa細(xì)胞制備的。提取物與抗-RNA聚合酶II抗體、抗-HA抗體或抗-FLAG抗體免疫沉淀。免疫沉淀物用抗-RNA聚合酶II抗體、抗-HA抗體或抗-FLAG抗體通過免疫印跡分析。對裂解物直接進(jìn)行免疫印跡分析，作為對照。
圖10A和10B證明了受ZNFN3A1調(diào)節(jié)的侯選下游基因。圖10A描繪了利用含有全長ZNFN3A1的GST融合蛋白通過結(jié)合和擴(kuò)增反應(yīng)分離到的寡核苷酸序列。圖中顯示了含有隨機(jī)核苷酸區(qū)域的核心序列。圖10B呈現(xiàn)了描數(shù)個(gè)基因的延長轉(zhuǎn)錄本在外源表達(dá)ZNFN3A1的COS7穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體中的反轉(zhuǎn)錄分析圖片。
圖11(A)圖示了各種在EGFR 5’側(cè)翼區(qū)含有公認(rèn)的ZNFN3A1-結(jié)合元件的報(bào)告質(zhì)粒。相對于公認(rèn)的轉(zhuǎn)錄-起始位點(diǎn)的核苷酸位置由正或負(fù)數(shù)指示。(B)利用所示的報(bào)告質(zhì)粒對SNU475細(xì)胞中EGFR啟動子的分析。條，標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。*，由Fisher’s保護(hù)性最小-顯著性檢驗(yàn)測定的顯著性差異(p＜0.05)。
圖12示意ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之間形成的復(fù)合體，它能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
發(fā)明詳述除非另外明確指出，如本文所用的詞語“一個(gè)”、“一種”及“這種”是指“至少一個(gè)”。
本申請鑒定了新的人類基因ZNFN3A1，它的表達(dá)在HCC中與相應(yīng)的非癌肝組織中相比顯著升高。ZNFN3A1 cDNA由如SEQ.ID.NO.1所示的含有1284個(gè)核苷酸的開放讀框的1622個(gè)核苷酸組成。開放讀框編碼具有鋅指基元的公認(rèn)的428個(gè)氨基酸的蛋白。該蛋白被命名委員會命名為ZNFN3A1(鋅指蛋白，3A亞家族(含MYND)，1)。此外，ZNFN3A1直接與RNA螺旋酶KIAA0054結(jié)合，并與RNA聚合酶II形成復(fù)合體，通過該復(fù)合體與EGFR基因5’側(cè)翼區(qū)“(C)CCCTCC(T)”元件的直接結(jié)合，可以激活下游基因包括表皮生長因子受體(EGFR)的轉(zhuǎn)錄。一致地，ZNFN3A1在NIH3T3細(xì)胞中的外源表達(dá)使細(xì)胞生長增加，而用反義S-寡核苷酸阻抑它的表達(dá)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞顯著的生長抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明ZNFN3A1通過與RNA螺旋酶和RNA聚合酶II的復(fù)合體轉(zhuǎn)錄激活包括EGFR在內(nèi)的靶基因，從而賦予癌細(xì)胞致癌活性，而且抑制該復(fù)合體的活性應(yīng)該是有前景的治療HCC的策略。
本發(fā)明涵蓋新的人類基因ZNFN3A1，包括SEQ.ID.NO.1中所述的多核苷酸序列，及其簡并體和突變體，只要它們編碼ZNFN3A1蛋白，包括如SEQ.ID.NO.2中所示的氨基酸序列或它的功能等價(jià)體。與ZNFN3A1功能等價(jià)的蛋白的例子包括，例如，與人類ZNFN3A1蛋白相應(yīng)的其它生物體的同源蛋白，以及人類ZNFN3A1蛋白的突變體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“功能等價(jià)體”是指受試蛋白象ZNFN3A1蛋白一樣具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，并通過與RNA螺旋酶或RNA聚合酶或兩者形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體來賦予癌細(xì)胞致癌活性，這種致癌活性，反過來，增強(qiáng)靶基因，例如EGFR的轉(zhuǎn)錄。受試蛋白是否具有細(xì)胞增殖活性可以通過將編碼該受試蛋白的DNA引入到表達(dá)該蛋白的細(xì)胞(如NIH3T3中)，并檢測細(xì)胞增殖的促進(jìn)或者集落形成活性的提高來判斷。受試蛋白與RNA聚合酶或RNA螺旋酶或兩者形成復(fù)合體的能力，可以通過免疫共沉淀進(jìn)行分析，例如下文實(shí)施例中所描述的那些。EGRR轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)可以利用諸如下文實(shí)施例中所描述的那些報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行測定。
制備在功能上與給定蛋白等價(jià)的蛋白的方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的，并且包括向蛋白引入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過定點(diǎn)突變法在人類ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列中引入合適的突變，能夠制備在功能上與人類ZNFN3A1蛋白等價(jià)的蛋白(Hashimoto-Gotoh，T.等(1995)，Gene 152，271-275；Zoller，MJ和Smith，M.(1983)，Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)，Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W和Fritz HJ.(1987)Methods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)，Methods Enzymol.85，2763-2766)。氨基酸突變也能天然發(fā)生。本發(fā)明蛋白包括那些在人ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列中突變一或多個(gè)氨基酸所得的蛋白，只要所得的突變蛋白在功能上與人類ZNFN3A1蛋白等價(jià)。這樣的突變體中待突變的氨基酸數(shù)目一般為10個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選6個(gè)氨基酸或更少，并且更優(yōu)選3個(gè)氨基酸或更少。
突變或修飾蛋白，具有通過缺失、添加和/或取代某一氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾的氨基酸序列的蛋白，已知能保留原始的生物活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666，Zoller，M.J.& Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500，Wang，A.等，Science 224，1431-1433，Dalbadie-McFarland，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
待突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)椴煌被?、但保留原氨基酸?cè)鏈的性質(zhì)(公知的保守氨基酸取代操作)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的例子有疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，親水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及具有如下共同的官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P)；含羥基的側(cè)鏈(S、T、Y)；含硫原子的側(cè)鏈(C、M)；含羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D、N、E、Q)；含堿基的側(cè)鏈(R、K、H)和含芳基的側(cè)鏈(H、F、Y、W)。注釋，括號中的字母表示氨基酸的單字母代碼。
在人類ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.2)中添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所得的蛋白的例子是，含人類ZNFN3A1蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人類ZNFN3A1蛋白與其它肽或蛋白的融合物，并且包括在本發(fā)明之中。融合蛋白能夠通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)，例如通過連接編碼本發(fā)明的人類ZNFN3A1蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA，使讀框適配，將該融合DNA插入到表達(dá)載體中并使其在宿主中表達(dá)來制備。對于與本發(fā)明蛋白融合的肽或蛋白沒有限制。
能夠作為與本發(fā)明蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，F(xiàn)LAG(Hopp，T.P.等，Biotechnology(1988)6，1204-1210)、含6個(gè)His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感病毒凝激素(HA)、人類c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-標(biāo)簽、HSV-標(biāo)簽、E-標(biāo)簽、SV40 T抗原片段、lck標(biāo)簽、α-微管蛋白片段、B-標(biāo)簽、C蛋白片段等?？梢耘c本發(fā)明蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、流感病毒凝激素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結(jié)合蛋白)等等。
融合蛋白可通過將編碼上文所討論的融合肽或蛋白的商業(yè)可用的DNA與編碼本發(fā)明蛋白的DNA融合，并表達(dá)所制備的融合蛋白來制備。
本領(lǐng)域已知的分離功能等價(jià)體蛋白的另一種替代方法是，例如，利用雜交技術(shù)的方法(Sambrook，J.等，Molecular Cloning第2版9.47-9.58，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠容易地分離到與編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA序列(SEQ.ID.NO.1)的全部或部分具有高度同源的DNA，并從分離到的DNA中分離人類ZNFN3A1蛋白的功能等價(jià)體。本發(fā)明蛋白包括那些由與編碼人類ZNFN3A1蛋白的全部或部分DNA序列雜交的DNA編碼的、并與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價(jià)的蛋白。這些蛋白包括與來源于人類或小鼠的蛋白相應(yīng)的哺乳動物同系物(例如，由猴子、大鼠、兔子和牛基因編碼的蛋白)。在從動物中分離與編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu)選利用來自卵巢或睪丸的組織。
用來分離編碼與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價(jià)的蛋白的DNA的雜交條件可以由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員常規(guī)地選擇。例如，雜交可以通過利用“Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)在68℃進(jìn)行30分鐘或更長時(shí)間的預(yù)雜交，添加標(biāo)記探針，并在68℃保溫1小時(shí)或更長時(shí)間進(jìn)行。可以在，例如，低嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行如下的洗滌步驟。低嚴(yán)謹(jǐn)條件為，例如，42℃、2X SSC、0.1％SDS，或者優(yōu)選50℃、2X SSC、0.1％SDS。更優(yōu)選利用高嚴(yán)謹(jǐn)條件。高嚴(yán)謹(jǐn)條件為，例如，在2X SSC、0.01％SDS中于室溫下20分鐘洗滌3次，然后在1X SSC、0.1％SDS中于37℃20分鐘洗滌3次，并在1XSSC、0.1％SDS中于50℃20分鐘洗滌2次。不過，多種因素例如溫度和鹽濃度能夠影響雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，因而本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)谶x擇這些因素以獲得必要的嚴(yán)謹(jǐn)性。
作為雜交的替代，可以用基因擴(kuò)增法，例如，利用以編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA(SEQ.ID.NO.1)序列信息為基礎(chǔ)合成的引物，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法，分離編碼與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價(jià)的蛋白的DNA。
由通過上述雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)所分離到的DNA編碼的與人類ZNFN3A1蛋白在功能上等價(jià)的蛋白，通常與人類ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列具有高度同源?！案叨韧础蓖ǔＪ侵?0％或更高的同源性，優(yōu)選60％或更高的同源性，更優(yōu)選80％或更高的同源性，甚至更優(yōu)選95％或更高的同源性。蛋白的同源性可以通過如下“Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730”中的算法測定。
本發(fā)明蛋白可能在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、糖鏈的存在或無、或者形式方面具有變化，取決于用來制備它的細(xì)胞或宿主或者所用的純化方法。然而，只要它具有與本發(fā)明的人類ZNFN3A1蛋白(SEQ.ID.NO.2)等價(jià)的功能，它就落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法，本發(fā)明蛋白可以作為重組蛋白或天然蛋白制備。重組蛋白可通過將編碼本發(fā)明蛋白的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的DNA)插入到合適的表達(dá)載體中，將載體引入到合適的宿主細(xì)胞中，獲取提取物，并通過使提取物經(jīng)層析，例如，離子交換層析、反相層析、凝膠過濾或利用固定了針對本發(fā)明蛋白的抗體的柱子的親和層析，或通過不止一個(gè)前述柱子的結(jié)合來制備和純化蛋白。
并且當(dāng)本發(fā)明蛋白作為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白的融合蛋白、或者作為增加了多個(gè)組氨酸的重組蛋白在宿主細(xì)胞(例如，動物細(xì)胞和大腸桿菌(E.coli))內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)的重組蛋白可利用谷胱甘肽柱或鎳柱純化。
在純化融合蛋白后，還有可能根據(jù)需要用凝血酶或因子-Xa通過切割除去目的蛋白之外的區(qū)域。
天然蛋白可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如，通過使親和柱(該柱結(jié)合有下文所述的與ZNFN3A1蛋白結(jié)合的抗體)，與表達(dá)本發(fā)明蛋白的組織或細(xì)胞的提取物接觸來分離?？贵w可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。
本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明蛋白的部分肽。所述部分肽具有本發(fā)明蛋白特有的氨基酸序列，并由至少7個(gè)氨基酸，優(yōu)選8個(gè)氨基酸或更多，更優(yōu)選9個(gè)氨基酸或更多組成。部分肽能用于，例如，制備針對本發(fā)明蛋白的抗體，篩選與本發(fā)明蛋白結(jié)合的化合物，以及篩選本發(fā)明蛋白的促進(jìn)因子或抑制劑。
本發(fā)明的部分肽可以通過基因工程方法、通過已知的肽合成方法、或者通過用合適的肽酶消化本發(fā)明蛋白來制備。關(guān)于肽合成，舉例來說，可以利用固相合成或液相合成。
分離的ZNFN3A1蛋白包括公認(rèn)的428-氨基酸的蛋白，具有鋅指基元，由ZNFN3A1多核苷酸序列的開放讀框編碼。鋅指結(jié)構(gòu)域(MYND)位于第49-87位密碼子，而SET(Su 3-9，zeste增強(qiáng)子，Trihorrax)結(jié)構(gòu)域位于第117-246位密碼子。正如下文所詳細(xì)討論的，ZNFN3A1結(jié)合區(qū)位居SET結(jié)構(gòu)域之中。所以，ZNFN3A1的部分肽優(yōu)選包括SET結(jié)構(gòu)域。
此外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明蛋白的DNA。本發(fā)明的DNA能夠如上所述用于體內(nèi)或體外制備本發(fā)明蛋白，或者能夠應(yīng)用于因編碼本發(fā)明蛋白的基因的遺傳性異常引起的疾病的基因治療?？梢岳萌魏涡问降谋景l(fā)明的DNA，只要它編碼本發(fā)明蛋白。具體地，可以利用由mRNA合成的cDNA、基因組DNA以及化學(xué)合成的DNA。本發(fā)明的DNA包括包含了給定的核苷酸序列以及它的簡并序列的DNA，只要所得的DNA編碼本發(fā)明蛋白。
本發(fā)明的DNA可以通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法制備。例如，本發(fā)明的DNA可以通過從表達(dá)本發(fā)明蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫，并利用本發(fā)明的DNA(例如，SEQ.ID.NO.1)的部分序列作為探針進(jìn)行雜交來制備。cDNA文庫可以，例如，通過Sambrook J.等，《分子克隆》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1989)中所描述的方法制備；作為選擇地，可利用商業(yè)上可獲得的cDNA文庫。cDNA文庫還可以通過從表達(dá)本發(fā)明蛋白的細(xì)胞提取RNA，根據(jù)本發(fā)明的DNA(例如，SEQ.ID.NO.1)的序列合成oligo DNA，利用該寡聚物作為引物進(jìn)行PCR，并擴(kuò)增出編碼本發(fā)明蛋白的cDNA，來制備。
另外，通過對獲得的cDNA測序，可以常規(guī)地確定該cDNA編碼的翻譯區(qū)，并且能夠容易地獲得本發(fā)明蛋白的氨基酸序列。而且，通過利用所獲得的cDNA作為探針篩選基因組DNA文庫，能夠分離基因組DNA。
更具體地，可以首先從表達(dá)本發(fā)明蛋白的細(xì)胞、組織或器官(例如，卵巢、睪丸、胎盤等)中分離mRNA?？梢岳靡阎姆椒ǚ蛛xmRNA；例如，總RNA可以通過胍超速離心(Chirgwin J.M.等Biochemistry 185294-5299(1979))或AGPC法(Chomczynski P.和Sacchi N.Anal.Biochem.162156-159(1987))制備。另外，mRNA可以利用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等從總RNA中純化，或者，作為選擇地，mRNA可以通過QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化。
所獲得的mRNA利用反轉(zhuǎn)錄酶用于合成cDNA。cDNA可以利用商業(yè)上可獲得的試劑盒，例如AMV反轉(zhuǎn)錄酶第1鏈cDNA合成試劑盒(SeikagakuKogyo)合成。作為選擇地，cDNA可以按照5’-RACE法合成并擴(kuò)增(FrohmanM.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002(1988)；Belyavsky A.等Nucleic Acids Res.172919-2932(1989))，如本文所述，該方法利用引物等，5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
從PCR產(chǎn)物中制備所需的DNA片段，并將該片段與載體DNA連接。重組載體被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，并從挑選的克隆中制備所需的重組載體。所需的DNA的核苷酸序列可以通過常規(guī)方法，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法檢驗(yàn)。
通過考慮用于表達(dá)的宿主中的密碼子利用頻率，可以設(shè)計(jì)更有效地表達(dá)本發(fā)明的DNA的核苷酸序列(Grantham R.等Nucleic Acids Res.943-74(1981))。本發(fā)明的DNA可以通過商業(yè)上可獲得的試劑盒或者常規(guī)方法進(jìn)行改變。例如，DNA可以通過用限制酶消化、摻入合成寡核苷酸或合適的DNA片段、添加接頭、或者插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA、TGA或TAG)予以改變。
具體地，本發(fā)明的DNA涵蓋包含了編碼位于SEQ.ID.NO.2第49-87位密碼子的鋅指結(jié)構(gòu)域和位于SEQ.ID.NO.2第117-246位密碼子的DET結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的DNA。
此外，本發(fā)明提供了在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的DNA雜交、并編碼如上所述的在功能上與本發(fā)明蛋白等價(jià)的蛋白的DNA。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇嚴(yán)謹(jǐn)條件。例如，可以使用低嚴(yán)謹(jǐn)條件。更優(yōu)選地，可以使用高嚴(yán)謹(jǐn)條件。這些條件與上文所述相同。上文的雜交DNA優(yōu)選為cDNA或染色體DNA。
本發(fā)明還提供了插入了本發(fā)明的DNA的載體。本發(fā)明的載體可用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的DNA，或者用于表達(dá)本發(fā)明蛋白。
當(dāng)大腸桿菌為宿主細(xì)胞并且載體在大腸桿菌(如，JM109、DH5α、HB101或XL1Blue)中大量擴(kuò)增和生產(chǎn)時(shí)，載體應(yīng)當(dāng)具有在大腸桿菌中擴(kuò)增的復(fù)制起點(diǎn)″ori″以及用來選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)記基因(如，由藥物例如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等藥物進(jìn)行選擇的抗藥性基因)。例如，可以利用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以與上述載體一樣用于亞克隆和提取cDNA。當(dāng)利用載體制備本發(fā)明蛋白時(shí)，表達(dá)載體尤為有用。例如，待在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)具有可在大腸桿菌中擴(kuò)增的上述特征。當(dāng)利用大腸桿菌例如JM109、DH5α、HB101或XL1 Blue作為宿主細(xì)胞時(shí)，載體應(yīng)當(dāng)具有能夠在大腸桿菌中有效地表達(dá)所需基因的啟動子，例如，lacZ啟動子(Ward等，Nature(1989)341，544-546；FASEB J(1992)6，2422-2427)、arab啟動子(Better等，Science(1988)240，1041-1043)或T7啟動子等。就這方面而言，舉例來說，pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpresssystem”(Qiagen)、pEGFP和pET(在這種情況下，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7 RNA聚合酶的BL21)可用來代替上述載體。
另外，載體還可以含有多肽分泌的信號序列。指導(dǎo)待分泌的蛋白進(jìn)入大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列是pelB信號序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。將載體引入靶宿主細(xì)胞的手段包括，例如，氯化鈣法以及電穿孔法。
除了大腸桿菌，舉例來說，可利用來自哺乳動物的表達(dá)載體(例如，pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF、pCDM8)、來自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體(例如，“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、來自植物的表達(dá)載體(例如pMH1、pMH2)、來自動物病毒的表達(dá)載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、來自反轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如，pZIpneo)、來自酵母的表達(dá)載體(例如，“畢赤酵母表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)、以及來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的表達(dá)載體(例如，pPL608、pKTH50)生產(chǎn)本發(fā)明蛋白。
為了在動物細(xì)胞，例如CHO、COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)當(dāng)具有在這種細(xì)胞中表達(dá)所必須的啟動子，例如，SV40啟動子(Mulligan等，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV啟動子等，并且優(yōu)選具有用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因(例如，進(jìn)行藥物選擇的藥物抗性基因(如新霉素、G418))。具有這些特征的已知載體的例子包括，例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
另外，可以使用方法穩(wěn)定地表達(dá)基因，并同時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞中基因的拷貝數(shù)。例如，可以將包含互補(bǔ)DHFR基因的載體(例如pCHO I)引入到缺失了核酸合成路徑的CHO細(xì)胞中、并隨后通過氨甲喋呤(MTX)擴(kuò)增。此外，在基因瞬時(shí)表達(dá)的情況下，可以使用將包含SV40復(fù)制起點(diǎn)的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化到在染色體上包含SV40 T抗原表達(dá)基因的COS細(xì)胞中的方法。
如上所述獲得的本發(fā)明蛋白可以自宿主細(xì)胞的內(nèi)部或外部(例如培養(yǎng)基中)分離，并純化為基本純的均質(zhì)蛋白。如本文所用的關(guān)于給定多肽的術(shù)語“基本純”是指多肽基本上沒有其它生物大分子?；炯兊亩嚯母芍丶兌戎辽?5％(如，至少80、85、95或99％)。純度可以通過任何合適的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測量。蛋白分離和純化的方法不局限于任何特定的方法；事實(shí)上，可以利用任何標(biāo)準(zhǔn)方法。
例如，可以適當(dāng)?shù)剡x擇并組合柱層析、過濾、超濾、鹽沉淀、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、透析和重結(jié)晶以分離和純化蛋白。
層析的例子包括，例如，親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1996))。這些層析可以通過液相層析進(jìn)行，例如HPLC和FPLC。因此，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的高度純化的蛋白。
本發(fā)明蛋白可以任選地通過在純化前或后用合適的蛋白酶處理而被修飾或部分缺失。有用的蛋白修飾酶包括，但不限于，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰內(nèi)肽酶(lysylendopeptidase)、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。
本發(fā)明提供了與本發(fā)明蛋白結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體能夠以任何形式應(yīng)用，例如單克隆抗體或多克隆抗體形式，并且包括通過用本發(fā)明蛋白免疫動物例如兔子所獲得的抗血清、所有類型的多克隆和單克隆抗體、人類抗體以及通過基因重組制備的人源化抗體。
用作抗原以獲得抗體的本發(fā)明蛋白可以來自于任何動物物種，但優(yōu)選來自哺乳動物例如人類、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來自人類。來自人的蛋白可以從本文公開的核苷酸或氨基酸序列獲得。
根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的蛋白可以是完整蛋白或該蛋白的部分肽。部分肽可以包含，例如，本發(fā)明蛋白的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。這里，抗體被定義為與本發(fā)明蛋白的全長或者片段反應(yīng)的蛋白。
編碼本發(fā)明蛋白或它的片段的基因可以被插入到已知的表達(dá)載體中，然后它被用來轉(zhuǎn)化如本文所述的宿主細(xì)胞。所需蛋白或它的片段可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法自宿主細(xì)胞的外部或內(nèi)部回收，并且可以隨后用作為抗原。作為選擇地，表達(dá)蛋白的完整細(xì)胞或它們的裂解物，或者化學(xué)合成的蛋白可用作為抗原。
任何哺乳動物可以用該抗原免疫，但優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容性。一般地，利用嚙齒類(Rodentia)、兔類(Lagomorpha)或靈長類(Primates)動物。
嚙齒類動物包括，例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔類動物包括，例如，兔子。靈長類動物包括，例如，狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴子)猴子例如獼猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzees)。
用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域公知的。腹腔內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體地，抗原可以稀釋并懸浮于適量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、生理鹽水中等。如果需要，抗原懸浮液可以與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑(例如弗氏完全佐劑)混合，制成乳劑，然后給藥哺乳動物。優(yōu)選地，隨后每4到21天給藥與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原數(shù)次。適當(dāng)?shù)妮d體也可用于免疫。如上所述免疫之后，通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢查血清中所需抗體量的增加。
針對本發(fā)明蛋白的多克隆抗體可以通過，從血清中所需抗體增加的免疫動物收集血液，并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清來制備。多克隆抗體包括含有該多克隆抗體的血清，以及可以從血清中分離的含有多克隆抗體的組份。免疫球蛋白G或M可以從只識別本發(fā)明蛋白的組份中，利用例如，偶聯(lián)本發(fā)明蛋白的親和柱制備，并利用蛋白A或蛋白G柱進(jìn)一步純化該組份。
為制備單克隆抗體，從用抗原免疫的、并如上所述檢查到血清中所需抗體水平提高的哺乳動物中收集免疫細(xì)胞，并使之進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選獲自脾臟。其它優(yōu)選的與上述免疫細(xì)胞融合的親本細(xì)胞包括，例如，哺乳動物骨髓瘤細(xì)胞，并且更優(yōu)選具備用來由藥物選擇融合細(xì)胞的后天性質(zhì)的骨髓瘤細(xì)胞。
上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以根據(jù)已知的方法融合，例如，Milstein等的方法(Galfre，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)。
通過細(xì)胞融合所得的雜交瘤可以通過在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們進(jìn)行選擇，例如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基)。細(xì)胞培養(yǎng)通常在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)足以讓除了所需的雜交瘤之外的所有其它細(xì)胞(未融合細(xì)胞)死亡。然后，通過標(biāo)準(zhǔn)的有限稀釋篩選和克隆出產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。
除了上述用抗原免疫非人動物制備雜交瘤的方法之外，人類雜交瘤細(xì)胞例如那些被EB病毒感染的細(xì)胞可以用蛋白、蛋白表達(dá)細(xì)胞、或它們的裂解物在體外免疫。然后，免疫的淋巴細(xì)胞與來自人的能夠無限分裂的骨髓瘤細(xì)胞，例如U266融合，以得到能產(chǎn)生與所述蛋白結(jié)合的所需人類抗體的雜交瘤(未審的
公開日本專利申請No.(JP-A)Sho 63-17688)。
所得的雜交瘤隨后被移植到小鼠的腹腔內(nèi)，并提取腹水。所得的單克隆抗體可以通過，例如，硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)了本發(fā)明蛋白的親和柱純化。本發(fā)明的抗體不僅可用來純化和檢測本發(fā)明蛋白，而且可用作本發(fā)明蛋白的激動劑和拮抗劑的侯選者。另外，該抗體可用于與本發(fā)明蛋白相關(guān)的疾病的抗體治療。當(dāng)向人體給藥所得的抗體(抗體治療)時(shí)，優(yōu)選人類抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，可以用選自蛋白、蛋白表達(dá)細(xì)胞或其裂解物的抗原免疫具有人類抗體基因庫的轉(zhuǎn)基因動物。然后從動物中收集抗體生成細(xì)胞，并與骨髓瘤細(xì)胞融合以獲得雜交瘤，從中可以制備針對該蛋白的人類抗體(參見WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735和WO96-34096)。
作為選擇地，產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，例如免疫的淋巴細(xì)胞，可用癌基因永生化，并用于制備單克隆抗體。
這樣獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術(shù)重組制備(例如參見Borrebaeck C.A.K.和Larrick J.W.Therapeutic Monoclonal Antibodies，英國MacMillan出版社有限公司出版(1990))。舉例來說，可以從免疫細(xì)胞，例如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或免疫淋巴細(xì)胞克隆出編碼該抗體的DNA，將該DNA插入到合適的載體中，并引入宿主細(xì)胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了如上所述制備的重組抗體。
此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或修飾抗體，只要它與本發(fā)明的一或多種蛋白結(jié)合。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自H和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston J.S.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855879-5883(1988))。更具體地，抗體片段可以通過用酶，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生。作為選擇地，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將該基因插入到表達(dá)載體中，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(例如參見Co M.S.等J.Immunol.1522968-2976(1994)；Better M.和Horwitz A.H.Methods Enzymol.178476-496(1989)；Pluckthun A.和Skerra A.MethodsEnzymol.178497-515(1989)；Lamoyi E.Methods Enzymol.121652-663(1986)；Rousseaux J.等Methods Enzymol.121663-669(1986)；Bird R.E.和Walker B.W.Trends Biotechnol.9132-137(1991))。
抗體可通過與多種分子，例如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)而被修飾。本發(fā)明提供了這種修飾抗體。修飾抗體可以通過化學(xué)修飾抗體獲得。這些修飾方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
作為選擇地，本發(fā)明的抗體可以是來自非人抗體的可變區(qū)和來自人類抗體的恒定區(qū)的嵌合抗體、或者作為包含來自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、來自人類抗體的框架區(qū)(FR)以及恒定區(qū)的人源化抗體獲得。這樣的抗體可以利用已知的技術(shù)制備。
如上所述獲得的抗體可以被純化為均質(zhì)的。例如，抗體的分離和純化可以根據(jù)一般蛋白所用的分離和純化方法進(jìn)行。例如，抗體可以通過柱層析法的適當(dāng)選擇和組合進(jìn)行分離，例如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等(AntibodiesA Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，冷泉港實(shí)驗(yàn)室1988)，但不局限于此。
蛋白A柱或蛋白G柱可用作為親和柱?？捎玫睦拘缘鞍譇柱包括，例如，Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了親和以外的例示性層析包括，例如，離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification andCharacterizationA Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1996)。層析操作可以通過液相層析進(jìn)行，例如HPLC和FPLC。
舉例來說，可以利用吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)和/或免疫熒光測量本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在板上，向板上施加本發(fā)明蛋白，然后施加含有所需抗體的樣品，例如抗體生成細(xì)胞的培養(yǎng)上清或者純化的抗體。然后，施加識別一抗并且用酶，例如堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，并溫育板。接著，洗滌之后，向板中添加酶底物，例如p-硝基苯基磷酸，然后測量吸光度，以評估樣品的抗原結(jié)合活性。蛋白片段，例如C-末端或N-末端片段，可作為蛋白應(yīng)用。可以利用BIAcore(Pharmacia)評估根據(jù)本發(fā)明的抗體的活性。
上述方法通過將本發(fā)明的抗體暴露于預(yù)計(jì)含有本發(fā)明蛋白的樣品中，并檢測或測量抗體和蛋白形成的免疫復(fù)合體，使得能夠檢測或測量本發(fā)明蛋白。
由于檢測或測量根據(jù)本發(fā)明蛋白的方法能夠容易地檢測或測量蛋白，該方法可用在利用該蛋白的許多實(shí)驗(yàn)中。
本發(fā)明還提供了與編碼人類ZNFN3A1蛋白的DNA(SEQ.ID.NO.1)或其互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸，它包含至少15個(gè)核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是與編碼本發(fā)明蛋白的DNA特異性雜交的多核苷酸。如本文所用的術(shù)語“特異性雜交”是指在常用的雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，與編碼其它蛋白的DNA的交叉雜交不顯著發(fā)生。這樣的多核苷酸包括與編碼本發(fā)明蛋白的DNA或其互補(bǔ)鏈特異性地雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)。而且，這樣的多核苷酸可用于制備DNA芯片。
本發(fā)明包括與核苷酸序列SEQ.ID.NO.1之內(nèi)的任何位點(diǎn)雜交的反義寡核苷酸。該反義寡核苷酸優(yōu)選是針對核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸。甚至更優(yōu)選在上述至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸中含有起始密碼子的上述反義寡核苷酸。
反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物可作為反義寡核苷酸應(yīng)用。這種修飾產(chǎn)物的例子包括低級烷基膦酸酯修飾例如甲基膦酸酯型或乙基膦酸酯型修飾、硫代磷酸酯(phosphothioate)修飾和氨基磷酸酯(phosphoramidate)修飾。
如本文所用的術(shù)語“反義寡核苷酸”不僅是指其中與構(gòu)成DNA或mRNA特定區(qū)域的那些核苷酸相應(yīng)的核苷酸是完全互補(bǔ)的那些寡核苷酸，而且指那些具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸誤配的核苷酸，只要DNA或mRNA以及反義寡核苷酸能夠與核苷酸序列SEQ.ID.NO.1特異性雜交。
本發(fā)明包括這樣的多核苷酸，如在“至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的序列區(qū)域”具有至少70％或更高、優(yōu)選80％或更高、更優(yōu)選90％或更高、甚至更優(yōu)選95％或更高同源性的那些多核苷酸。本文所陳述的算法能夠用于確定同源性。如在稍后的實(shí)施例中所陳述的那樣，這樣的多核苷酸可作為探針用于分離或檢測編碼本發(fā)明蛋白的DNA，或者可作為引物用于擴(kuò)增。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物作用于產(chǎn)生本發(fā)明蛋白的細(xì)胞，通過與編碼本發(fā)明蛋白的DNA或mRNA結(jié)合、抑制它的轉(zhuǎn)錄或翻譯、促進(jìn)mRNA的降解、以及抑制該蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致對該蛋白功能的抑制。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物可以通過與適當(dāng)?shù)膶υ撗苌餆o活性的堿性材料混合，制成外用制劑，例如搽劑(liniment)或敷劑(poultice)。
并且，根據(jù)需要，衍生物可以通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、保存劑、鎮(zhèn)痛劑等配制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、脂質(zhì)體膠囊、注射劑、溶液、鼻滴劑和冷凍干燥制劑。這些可以通過如下通用方法制備。
反義寡核苷酸衍生物給予患者的方式是，直接施用于生病部位或者通過注射到血管中，從而它可到達(dá)疾病部位。還可以使用反義-固定(mounting)介質(zhì)提高耐久性和膜通透性。例子有脂質(zhì)體、多聚-L-賴氨酸、脂類、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物(Lipofectin)或這些物質(zhì)的衍生物。
本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物的劑量可以根據(jù)患者的情況適當(dāng)調(diào)整并按照所需的量使用。例如，可以給藥0.1到100mg/kg，優(yōu)選0.1到50mg/kg的劑量范圍。
本發(fā)明的反義寡核苷酸抑制本發(fā)明蛋白的表達(dá)，因而可用來阻抑本發(fā)明蛋白的生物活性。并且，包含本發(fā)明反義寡核苷酸的表達(dá)抑制劑，就它們能夠抑制本發(fā)明蛋白的生物活性而言是有用的。
而且，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明蛋白篩選與本發(fā)明蛋白結(jié)合的化合物的方法。這個(gè)篩選方法包括步驟(a)使本發(fā)明蛋白或其部分肽與受試樣品進(jìn)行接觸；(b)檢測本發(fā)明蛋白或其部分肽與受試樣品結(jié)合的活性，和(c)選擇與本發(fā)明蛋白或其部分肽結(jié)合的化合物。
用于篩選的本發(fā)明蛋白可以是重組蛋白和得自天然的蛋白，或者它的部分肽。可以使用任何受試樣品，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物以及天然化合物。與受試樣品接觸的本發(fā)明蛋白可以是，例如，純化的蛋白，可溶蛋白，與載體結(jié)合的形式或者與其它蛋白融合的融合蛋白。
很多本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法都可以用作篩選蛋白的方法，例如，利用本發(fā)明蛋白篩選與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白。這種篩選可以通過，例如免疫沉淀法，具體地，以如下方式進(jìn)行。編碼本發(fā)明蛋白的基因通過將該基因插入到用于外來基因的表達(dá)載體(如pSV2neo、pcDNA I和pCD8)上，而在動物細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)所用的啟動子可以是通常所用的任何啟動子，并且包括，例如，SV40早期啟動子(Rigby in Williamson(ed.)，GeneticEngineering，第3卷，學(xué)院出版社，倫敦，p.83-141(1982))、EF-1α啟動子(Kim等，Gene 91，p217-223(1990))、CAG啟動子(Niwa等Gene 108，p.193-200(1991))、RSV LTR啟動子(Cullen Methods in Enzymology 152，p.684-704(1987))、SRα啟動子(Takebe等，Mol.Cell.Biol.8，p.466(1988)、CMV即早期啟動子(Seed和Aruffo Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，p.3365-3369(1987))、SV40晚期啟動子(Gheysen和Fiers J.Mol.Appl.Genet.1，p.385-394(1982))、腺病毒晚期啟動子(Kaufman等，Mol.Cell.Biol.9，p.946(1989))、HSV TK啟動子等。將基因引入到動物細(xì)胞中以便表達(dá)外來基因時(shí)，所述引入可根據(jù)任何已知的方法進(jìn)行，例如，電穿孔法(Chu G.等Nucl.Acids Res.15，1311-1326(1987))、磷酸鈣法(Chen，C和Okayama，H.Mol.Cell.Biol.7，2745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopata，M.A.等Nucl.Acids Res.12，5707-5717(1984))，Sussman，D.J.和Milman，G.Mol.Cell.Biol.4，1642-1643(1985))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物法(Derijard，B.Cell 7，1025-1037(1994)；Lamb，B.T.等Nature Genetics 5，22-30(1993)Rabindran，S.K.等Science 259，230-234(1993))等。通過將已經(jīng)揭示其特異性的單克隆抗體的表位引入本發(fā)明蛋白的N-或C-末端，可以將本發(fā)明蛋白表達(dá)為包含單克隆抗體識別位點(diǎn)(表位)的融合蛋白。可以利用商業(yè)上可獲得的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine 13，85-90(1995))。利用，例如，β-半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的多克隆位點(diǎn)而表達(dá)與這些蛋白的融合蛋白的載體是商業(yè)上可獲得的。
還報(bào)道了一種融合蛋白，它是通過僅引入由幾個(gè)到幾十個(gè)氨基酸組成的小表位而制備的，所述融合不改變本發(fā)明蛋白的性質(zhì)。表位，例如多聚組氨酸(His-標(biāo)簽)、流感標(biāo)度凝集素HA、人類c-myc、FLAG、水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標(biāo)簽)、人單皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、E-標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等，以及識別它們的單克隆抗體，可作為表位-抗體系統(tǒng)用于篩選與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白(ExperimentalMedicine 13，85-90(1995))。
在免疫沉淀中，通過用合適的去污劑制備細(xì)胞裂解物，向該裂解物中添加這些抗體，可以形成免疫復(fù)合體。該免疫復(fù)合體由本發(fā)明蛋白、包含與該蛋白結(jié)合的活性的蛋白、以及抗體組成。除了利用針對上述表位的抗體之外，免疫沉淀還可以利用針對本發(fā)明蛋白的抗體進(jìn)行。針對本發(fā)明蛋白的抗體可以如下制備，例如將編碼本發(fā)明蛋白的基因引入到合適的大腸桿菌表達(dá)載體中，在大腸桿菌中表達(dá)該基因，純化表達(dá)的蛋白，并用該蛋白來免疫兔、小鼠、大鼠、山羊、家禽等。抗體還可以通過用本發(fā)明蛋白的合成性部分肽免疫上述動物來制備。
當(dāng)抗體為小鼠IgG抗體時(shí)，免疫復(fù)合體可以通過蛋白A Sepharose或蛋白GSepharose沉淀。如果將本發(fā)明蛋白制成與表位(如GST)的融合蛋白，就可以以相同的方式，利用與這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)(如谷胱甘肽-Sepharose 4B)以及抗本發(fā)明蛋白的抗體，形成免疫復(fù)合體。
免疫沉淀可以如下，或者根據(jù)，例如，文獻(xiàn)(Harlow，E.和Lane，D.Antibodies pp.511-552，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約(1988))中的方法進(jìn)行。
SDS-PAGE通常用于分析免疫沉淀的蛋白，結(jié)合的蛋白可以利用合適濃度的凝膠通過蛋白的分子量進(jìn)行分析。由于與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白難以由普通的染色方法，例如考馬斯亮蘭染色或銀染檢測，蛋白的檢測靈敏度可以通過在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白并檢測所述蛋白而得以提高。在得知蛋白的分子量之后，可以從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中直接純化靶蛋白，并測序。
可以利用West-Western印跡分析作為利用本發(fā)明蛋白分離與該蛋白結(jié)合的蛋白的方法(Skolnik，E.Y.等，Cell(1991)65，83-90)。具體地，與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白可以如下獲得利用噬菌體載體(如ZAP)從預(yù)期表達(dá)與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白的細(xì)胞、組織或器官(例如，諸如卵巢、睪丸和胎盤等組織或培養(yǎng)的細(xì)胞)中制備cDNA文庫，在LB-瓊脂上表達(dá)該蛋白，將表達(dá)的蛋白固定在濾膜上，使純化和標(biāo)記的本發(fā)明蛋白與上述濾膜反應(yīng)，并根據(jù)該標(biāo)記檢測處表達(dá)與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明蛋白可以利用生物素和抗生物素蛋白的結(jié)合、或者利用與本發(fā)明蛋白特異性結(jié)合的抗體或與本發(fā)明蛋白融合的肽或多肽(例如GST)進(jìn)行標(biāo)記。利用放射性同位素或熒光等的方法也可以使用。
作為選擇地，在本發(fā)明的篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用利用了細(xì)胞的雙雜交(two-hybrid)系統(tǒng)(“MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)”、“哺乳動物MATCHMAKER雙雜交測定試劑盒”、“MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)”(Clontech)；“HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)”(Stratagene)；參考文獻(xiàn)“Dalton S，和Treisman R(1992)Cell 68，597-612”、“Fields S.和Sternglanz R.TrendsGenet.(1994)10286-292”)。
在雙雜交系統(tǒng)中，本發(fā)明蛋白被融合到SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)期表達(dá)與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫，該文庫在表達(dá)時(shí)與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后將cDNA文庫引入到上述酵母細(xì)胞中，并從所測的陽性克隆(當(dāng)與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，兩者的結(jié)合可激活報(bào)告基因，使得能檢測陽性克隆)分離來自該文庫的cDNA。由該cDNA編碼的蛋白可以通過將如上述分離到的cDNA引入到大腸桿菌中并表達(dá)該蛋白來制備。
除了HIS3基因，還可以利用Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等作為報(bào)告基因。
與本發(fā)明蛋白結(jié)合的化合物可以利用親和層析篩選。例如，可將本發(fā)明蛋白固定在親和柱的載體上，向柱中加入含有預(yù)計(jì)表達(dá)與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白的受試樣品。本文中受試樣品可以是，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。將受試樣品上樣后，洗滌柱子，制備與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白。
對所得的蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)該序列合成oligo DNA，并利用該oligo DNA作為探針篩選cDNA文庫以獲得編碼該蛋白的DNA。
利用表面胞質(zhì)團(tuán)(plasmon)共振現(xiàn)象的生物傳感器可在本發(fā)明中用作檢測或定量結(jié)合化合物的工具。當(dāng)利用這種生物傳感器時(shí)，僅利用少量蛋白且無需標(biāo)記，就可以實(shí)時(shí)觀察本發(fā)明蛋白與受試化合物之間的相互作用，其為表面胞質(zhì)團(tuán)共振信號形式(例如BIAcore，Pharmacia)。所以，利用生物傳感器例如BIAcore評估本發(fā)明蛋白與測試化合物之間的結(jié)合是可能的。
通過將已被固定的本發(fā)明蛋白暴露于合成化學(xué)化合物、或天然物質(zhì)庫、或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫而篩選結(jié)合分子的方法，或者利用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選來分離與本發(fā)明蛋白結(jié)合的蛋白和化學(xué)化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法(Wrighton Nc，F(xiàn)arrel FX，Chang R，Kashyap AK，BarboneFP，Mulcahy LS，Johnson DL，Barret RW，Jolliffe LK，Dower WJ；Small peptidesas potent mimetics of the protein hormone erythropoietin，Science(美國)Jul 261996，273 p458-64，Verdine GL.，The combinatorial chemistry of nature.Nature(英國)Nov 7 1996，384，p11-13，Hogan JC Jr.，Directed combinatorial chemistry.Nature(ENGLAND)Nov 7 1996，384 p17-9)，都是本領(lǐng)域公知的。
通過篩選而分離的化合物是促進(jìn)或抑制本發(fā)明蛋白的活性、治療或預(yù)防引起細(xì)胞增性疾病(如癌癥)的疾病的侯選藥物。由本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物還包括這樣的化合物，其中通過本篩選方法獲得的、具有與本發(fā)明蛋白結(jié)合的活性的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代而被改變。
而且，本發(fā)明提供了篩選促進(jìn)或抑制本發(fā)明蛋白的活性的化合物的方法。由于本發(fā)明的ZNFN3A1蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，促進(jìn)或抑制本發(fā)明ZNFN3A1蛋白的這種活性的化合物可以利用這種活性作為指標(biāo)來篩選。
該篩選方法包括以下步驟(a)在受試樣品存在下培養(yǎng)表達(dá)ZNFN3A1蛋白的細(xì)胞，(b)檢測細(xì)胞的增生，和(c)選擇與不存在受試樣品時(shí)檢測到的增生相比促進(jìn)或抑制增生的化合物。抑制ZNFN3A1的表達(dá)和/或活性的化合物具有抗癌劑的用途。
任何ZNFN3A1蛋白都可以用來篩選，只要它們包含抑制細(xì)胞增殖的活性。例如，可以利用人類ZNFN3A1蛋白，以及與這些蛋白功能上等價(jià)的蛋白。ZNFN3A1蛋白可以由細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)或外源表達(dá)。
任何受試樣品，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制的蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物、天然化合物都可以利用。由上述與本發(fā)明蛋白結(jié)合的化合物的篩選獲得的化合物也可以用作為受試化合物。
通過這種篩選分離的化合物是本發(fā)明蛋白的激動劑或拮抗劑。術(shù)語“激動劑”是指通過結(jié)合本發(fā)明蛋白而激活該蛋白的功能的分子。同樣地，術(shù)語“拮抗劑”是指通過結(jié)合本發(fā)明蛋白而抑制該蛋白的功能的分子。而且，這種通過篩選分離的化合物是抑制本發(fā)明蛋白在體內(nèi)與分子(包括DNA和蛋白)相互作用的侯選化合物。
細(xì)胞增殖可以，例如，通過測定細(xì)胞增殖的速度、測量細(xì)胞周期等，以及通過測量集落形成活性予以檢測，象實(shí)施例中所描述的那樣。
通過該篩選分離到的化合物是抑制本發(fā)明蛋白的活性的侯選藥物，它可用于治療與本發(fā)明蛋白相關(guān)的疾病，例如，癌癥，更特定地，肝細(xì)胞癌。
而且，通過添加、缺失和/或取代而改變了抑制ZNFN3A1蛋白活性的那一部分結(jié)構(gòu)的化合物，包括在由本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物中。
當(dāng)由本發(fā)明的方法分離的化合物作為藥物給藥人類或其它哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、小雞、貓、綿羊、豬、牛、猴子、狒狒(baboon)、黑猩猩(chimpanzee)時(shí)，分離的化合物可以直接給藥，或者可以利用已知的藥物制備方法配制成劑型。例如，根據(jù)需要，藥物可以作為糖衣片劑、膠囊、藥酒和微膠囊口服，或者用水或其它任何藥學(xué)上可接受的液體配制成用于注射的無菌溶液或懸液形式，非口服給予。例如，化合物可以與藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)，具體地，無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑、媒介物、保存劑、粘附劑等，以藥物實(shí)施通常所接受的單位劑量的形式進(jìn)行混合。這些藥劑中活性成分的含量在指定范圍內(nèi)可獲得適當(dāng)?shù)膭┝俊?br> 能夠混合到片劑和膠囊中的添加劑的例子有，粘附劑例如明膠、玉米淀粉、黃芪膠和阿拉伯膠；賦形劑例如微晶纖維素；膨脹劑例如玉米淀粉、明膠和海藻酸；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精；調(diào)味劑例如薄荷油、Gaultheria adenothrix油和櫻桃。當(dāng)單位劑量形式為膠囊時(shí)，上述成分中還可以包括液體載體，例如油。用于注射的無菌組合物可以利用媒介物例如用于注射的蒸餾水，按照常規(guī)的藥物實(shí)施進(jìn)行配制。
生理鹽水、葡萄糖以及其它等滲液體包括助劑，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，可以用作為注射水溶液。這些可以與合適的增溶劑聯(lián)合使用，例如醇類，特別是乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，例如Polysorbate 80(TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可用作油質(zhì)液體，可以與苯甲酸芐酯或苯甲醇聯(lián)合用作增溶劑，還可與緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液；鎮(zhèn)痛劑，例如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，例如苯甲醇、酚；以及抗氧化劑一起配制。制備的注射劑可以填充到合適的安瓿中。
可以利用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的方法向患者給藥本發(fā)明的藥物化合物，例如作為動脈注射、靜脈注射、經(jīng)皮注射，并且還可以作為鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌內(nèi)或口服給藥。給藥的劑量和方法根據(jù)患者的體重和年齡以及給藥方法而變化；不過，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠常規(guī)選擇它們。如果所述化合物由DNA編碼，可將該DNA插入到基因治療載體中，并給藥載體進(jìn)行治療。給藥的劑量和方法根據(jù)患者的體重、年齡和癥狀變化，但是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)剡x擇它們。
舉例來說，當(dāng)向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60kg)口服給藥時(shí)，雖然就癥狀而言存在某些差異，但與本發(fā)明蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物的劑量為約0.1mg-100mg每天，優(yōu)選約0.1mg-50mg每天，更優(yōu)選約1.0mg-20mg每天。
當(dāng)以注射形式向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60kg)腸胃外給藥時(shí)，雖然就患者、靶器官、癥狀和給藥方法而言存在某些差異，但可以很方面地靜脈內(nèi)注射約0.01mg-30mg每天，優(yōu)選約0.1mg-20mg每天，更優(yōu)選約0.1mg-10mg每天的劑量。在其它動物的情況下，可以按60kg體重的標(biāo)準(zhǔn)換算給藥量。
而且，本發(fā)明提供了利用ZNFN3A1基因作為診斷標(biāo)志診斷癌癥的方法。該診斷方法包括步驟(a)測定標(biāo)本的生物樣品中ZNFN3A1基因的表達(dá)水平；(b)將ZNFN3A1基因的該表達(dá)水平與正常樣品中的進(jìn)行比較，和(c)將樣品中ZNFN3A1基因的高表達(dá)水平定義為具有癌癥。
ZNFN3A1基因在具體標(biāo)本中的表達(dá)水平可以通過定量相應(yīng)于ZNFN3A1基因的mRNA或者由ZNFN3A1基因編碼的蛋白進(jìn)行評估。mRNA定量方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的。例如，與ZNFN3A1基因相應(yīng)的mRNA可以通過RNA印跡或者RT-PCR進(jìn)行評估。由于ZNFN3A1基因的全部核苷酸序列已顯示在SEQ ID NO1中，本領(lǐng)域任何技術(shù)人員都能設(shè)計(jì)探針和引物的核苷酸序列以定量ZNFN3A1基因。
ZNFN3A1基因的表達(dá)水平可以根據(jù)該ZNFN3A1基因編碼的蛋白的活性或量進(jìn)行分析。測定ZNFN3A1蛋白量的方法顯示于下。例如，免疫測定法可用來測定生物材料中的上述蛋白。任何生物材料都可以用于該蛋白或其活性的測定。例如，分析血樣以評估由血清標(biāo)志所顯示的蛋白。另一方面，可以根據(jù)待分析的每種蛋白的活性選擇合適的方法用于測定ZNFN3A1基因所編碼的蛋白的活性。
評估標(biāo)本(受試樣品)中ZNFN3A1基因的表達(dá)水平并與正常樣品中的進(jìn)行比較。當(dāng)這種比較證明ZNFN3A1基因的表達(dá)水平高于正常樣品中的水平時(shí)，則判定受試者染有癌癥。來自正常樣品和受試者的標(biāo)本中ZNFN3A1基因的表達(dá)水平可以同時(shí)進(jìn)行測定。作為選擇地，可以根據(jù)對事先從對照組收集的標(biāo)本中ZNFN3A1基因的表達(dá)水平的分析所獲得的結(jié)果，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定表達(dá)水平的正常范圍。將通過檢查受試者樣品所獲得的結(jié)果與該正常范圍進(jìn)行比較；當(dāng)結(jié)果未落在正常范圍內(nèi)時(shí)，受試者被判定染有癌癥。在本發(fā)明中，待診斷的癌癥優(yōu)選為肝細(xì)胞癌。
本發(fā)明還提供了診斷肝細(xì)胞癌的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑包含與本發(fā)明的DNA或蛋白結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或者可與本發(fā)明蛋白結(jié)合的抗體可以作為這些化合物來用。
提供下列實(shí)施例是用來舉例說明本發(fā)明，并幫助普通技術(shù)人員制備和利用本發(fā)明的。這些實(shí)施例并不旨在以任何方式另外限制本發(fā)明的范圍。
本文所引用的任何專利、專利申請和出版物都并入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明通過下列實(shí)施例詳細(xì)地舉例說明，但不受限于這些實(shí)施例。
材料和方法許多哺乳動物宿主細(xì)胞包括人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh7和Alexander、人子宮頸細(xì)胞系HeLa和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3，它們均得自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，它們都用來分離和鑒定ZNFN3A1。還利用了人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系SNU423和SNU475，它們來自韓國細(xì)胞系庫。所有的細(xì)胞系在合適的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)用于Huh7 Alexander和NIH3T3的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基；用于HeLa的Eagle’s極限必需培養(yǎng)基；用于SNU423和SNU475的、補(bǔ)充有10％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)的RPM1640，在含有5％CO2的空氣中于37℃生長。
ZNFN3A1的克隆化通常利用KOD-plus(TOYOBO)通過PCR進(jìn)行。為進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)，ZNFN3A1編碼區(qū)被克隆到pET21a的EcoR I-Kpn I位點(diǎn)。
為進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，ZNFN3A1編碼區(qū)被克隆到pcDNA3.1(+)和(-)(Invitrogen)的EcoR I-Kpn I位點(diǎn)、pFLAG的EcoR I-Kpn I位點(diǎn)以及pEGFP 的EcoR I-Kpn I位點(diǎn)(Clontech)。KIAA0054編碼區(qū)被克隆到pCMV-HA(Clontech)的EcoR I-Xho I位點(diǎn)。
RNA在如下實(shí)驗(yàn)中利用Qiagen RNeasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(Life Technologies)根據(jù)制造商的方案通過提取總RNA進(jìn)行制備。
本文通過RT-PCR擴(kuò)增RNA。利用poly dT12，18引物(AmershamBiosciences)和Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)將10μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。稀釋每一單鏈cDNA用于隨后的PCR擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR在20μl體積的PCR緩沖液(TAKARA)中進(jìn)行，并在Gene Amp PCR系統(tǒng)9700(Perkin-Elmer)中于94℃變性4分鐘、接著以94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s進(jìn)行20個(gè)(對于GAPDH)或30個(gè)(對于ZNFN3A1)循環(huán)予以擴(kuò)增。引物序列如下，GAPDH正向5’-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQ.ID.NO.4)及反向5’-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQ.ID.NO.5)，ZNFN3A1正向5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(SEQ.ID.NO.6)及反向5’-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(SEQ.ID.NO.7)。
為檢測ZNFN3A1，制備了兔抗-ZNFN3A多克隆抗體。利用睪丸cDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增了ZNFN3A1全長編碼序列并克隆到pET21a(Novagen)中。用已克隆的載體轉(zhuǎn)染BL21-CodonPlus感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)。重組ZNFN3A1蛋白由1.0mM IPTG于30℃誘導(dǎo)6小時(shí)。利用Pro BondTMResin(Invitrogen)純化His-ZNFN3A1融合蛋白。兔子用純化的His-ZNFN3A1免疫10次。用所得多克隆抗體進(jìn)行的免疫印跡顯示了50kD的單一條帶，它是帶有FLAG-標(biāo)記的ZNFN3A1，這與利用抗-FLAG單克隆抗體(Sigma)所檢測到的模式(數(shù)據(jù)未顯示)相同。
ZNFN3A1在細(xì)胞周期進(jìn)程中的效果由流式細(xì)胞術(shù)測定。細(xì)胞以1×105細(xì)胞/100mm皿的密度鋪板。細(xì)胞在指定的時(shí)間用胰蛋白酶處理，收集于PBS中，并固定在70％冷乙醇中。RNase處理后，細(xì)胞在PBS中用碘化丙錠(50μg/ml)染色。在Becton Dickinson FACScan上進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過CellQuest和ModFit軟件(Verity Software House)進(jìn)行分析。從至少20,000個(gè)未經(jīng)選通的細(xì)胞確定處于細(xì)胞周期G0/G1、S和G2/M期的核、以及任何亞-G1細(xì)胞群的百分比。
還在各種實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了免疫印跡和免疫組化分析。在免疫印跡中，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并用裂解緩沖液(150mM NaCI、1％Triton X-100、50mM Tris-HCI pH7.4、1mM DTT和1X完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche))收集。在細(xì)胞勻漿并于10,000xg離心30分鐘后，通過Bradford測定(Bio-Rad)對上清進(jìn)行蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白通過10％SDS-PAGE分離，并用小鼠抗-FLAG、兔抗-RNA聚合酶II、兔抗-HA抗體以及兔抗-ZNFN3A1抗體進(jìn)行免疫印跡。HRP-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠1gG和抗-兔1gG作為ECL檢測系統(tǒng)(Amersham Biosciences)的二抗。
在免疫組化分析中，利用抗-ZNFN3A1抗體進(jìn)行免疫組化染色。根據(jù)制造商建議的方法將石蠟-包埋的組織切片置于SAB-PO過氧化物酶免疫染色系統(tǒng)(Nichirei，東京，日本)中。將檸檬酸緩沖液(pH6)中的載玻片在微波爐中700W預(yù)處理10分鐘，使抗原從脫石蠟且再水合的組織中回收。
實(shí)施例1鑒定在HCC中頻繁上調(diào)的新基因利用具有23040個(gè)基因的基因組范圍的cDNA微陣列，我們鑒定了表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，它在乙型肝炎-陽性和/或丙型肝炎-陽性HCC中普遍上調(diào)。其中，我們聚焦于與一種EST對應(yīng)的基因A6681(Hs.8109)，因?yàn)榕c相應(yīng)的非癌肝組織相比，它的表達(dá)在12個(gè)臨床HCC中有11個(gè)(91.7％)顯著上調(diào)(圖1A)?；駻6681的表達(dá)提高在另外的10個(gè)HCC病例中通過RT-PCR也得到了確認(rèn)(圖1B)。通過半定量RT-PCR確認(rèn)的相對表達(dá)與通過cDNA微陣列確認(rèn)的非常相關(guān)。
實(shí)施例2A新的人類基因ZNFN3A1的分離和鑒定利用Clonetech的多組織RNA印跡，使32P標(biāo)記的部分A6681 cDNA與約1.7-kb轉(zhuǎn)錄本雜交，該轉(zhuǎn)錄本購自Clontech，可在睪丸及骨骼肌中表達(dá)(圖1C)。A6681探針利用一組引物5’-TTCCCGATATCAACATCTACCAG-3’(SEQ.ID.NO.6)和5′-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT-3′(SEQ.ID.NO.7)通過RT-PCR制備。預(yù)雜交、雜交和洗滌根據(jù)供應(yīng)商的建議進(jìn)行。印跡用增感屏于-80℃放射自顯影24小時(shí)。約1.7kb的多核苷酸轉(zhuǎn)錄本被命名為ZNFN3A1基因。
利用Clontech的Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒根據(jù)制造商的指示通過cDNA末端5’快速擴(kuò)增(5’RACE)，從而測定轉(zhuǎn)錄本5’區(qū)序列。為擴(kuò)增ZNFN3A1 cDNA的5’部分，采用基因特異性反向引物(5’-CTGCCAAGAAGTCGGAGTCTGGAG)[SEQ.ID.NO.8]。cDNA模板通過RT-PCR自人睪丸mRNA合成。PCR產(chǎn)物利用Invitrogen的TA克隆化試劑盒進(jìn)行克隆，其序列用來自Applied Biosystems的ABI PRISM 377 DNA測序儀進(jìn)行測定。結(jié)果，組裝得到SEQ.ID.NO1所示的具有1622個(gè)核苷酸的序列，它含有編碼428個(gè)氨基酸的1284個(gè)核苷酸的開放讀框。
由于在EST數(shù)據(jù)庫中未鑒定出含有ZNFN3A1基因5’部分的EST克隆，在基因組數(shù)據(jù)庫中查找了與ZNFN3A1 cDNA相應(yīng)的基因組序列。在基因組序列對比中發(fā)現(xiàn)了歸屬于染色體帶1q44的粘粒序列，它也包括ZNFN3A1基因。利用GENSCAN和Gene Recognition(GENSCAN來自MIT(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)而GRAIL 2來自IMS(http//www.genome.ad.jp))以及ABI提供的Assembly Internet Link程序(AutoAssembler 2.1)，預(yù)測了侯選外顯子序列，并進(jìn)行了外顯子連接。
實(shí)施例2B分離并鑒定新的人類蛋白，ZNFN3A1利用含有編碼428個(gè)氨基酸的開放讀框的1622個(gè)核苷酸的序列，利用簡單模塊構(gòu)造研究工具(SMART)從中EMBL(http//smart.embl-heidelberg.de)鑒定到了蛋白ZNFN3A1。SMART提示，ZNFN3A1蛋白含有zf-MYND[鋅指蛋白(含MYND結(jié)構(gòu)域)]結(jié)構(gòu)域(密碼子49-87)以及SET[(Su(var)3-9，zeste增強(qiáng)子，Trithorax)]結(jié)構(gòu)域(密碼子117-246)(圖2A)。ZNFN3A1蛋白的氨基酸序列與小鼠(Mus musculus)ES細(xì)胞cDNA的氨基酸序列(GenBank登錄號AK010447)享有94％的同一性(圖2B)，編碼該蛋白的基因被命名委員會命名為“ZNFN3A1”/(鋅指蛋白，亞家族3A(含MYND結(jié)構(gòu)域)，1)。
實(shí)施例3ZNFN3A1亞細(xì)胞定位與ZNFN3A1相應(yīng)的完整編碼區(qū)被克隆到pEGFP-N1載體和pFLAG-CMV-5a載體中，這些構(gòu)建物被轉(zhuǎn)染到SNU475細(xì)胞中并表達(dá)。EGFP標(biāo)記型ZNFN3A1和FLAG標(biāo)記型ZNFN3A1通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)(數(shù)據(jù)未顯示)。通過熒光免疫細(xì)胞化學(xué)分析，在胞漿和核中都檢測到均質(zhì)的ZNFN3A1-EGFP融合蛋白和FLAG-標(biāo)記的ZNFN3A1蛋白(圖3A-F)。利用ZNFN3A1特異性抗體觀察了內(nèi)源ZNFN3A1蛋白的亞細(xì)胞定位。
有趣的是，ZNFN3A1蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞周期進(jìn)程中或者因培養(yǎng)細(xì)胞的密度而改變。通過進(jìn)行內(nèi)源ZNFN3A1蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)分析，有些量的蛋白在低細(xì)胞濃度培養(yǎng)的情況下定位于核內(nèi)(圖3G-I和圖3M-O)。不過，在高細(xì)胞濃度培養(yǎng)的情況下，大多數(shù)ZNFN3A1蛋白定位于胞漿中(圖3J-L和圖3P-R)。這些結(jié)果揭示ZNFN3A1的亞細(xì)胞定位取決于細(xì)胞濃度。當(dāng)細(xì)胞處于S期中期到晚期或者培養(yǎng)于稀疏條件下時(shí)，ZNFN3A1在核中積聚，而當(dāng)它們處于其它時(shí)期或生長在密集條件下時(shí)，ZNFN3A1定位于胞漿和核中。
進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，用含4％多聚甲醛的PBS將培養(yǎng)的細(xì)胞在帶有小格的載玻片上固定15分鐘，然后用含0.1％Triton X-100的PBS室溫下處理2.5分鐘使之滲透。細(xì)胞用2％BSA在PBS中于4℃覆蓋24小時(shí)以封閉非特異性雜交，隨后與1∶2000稀釋的小鼠抗-FLAG抗體和1∶3000稀釋的兔抗-ZNFN3A1抗體(一抗)溫育?？贵w用熒光底物偶聯(lián)的抗-小鼠IgG和抗-兔1gG二抗(ICN/Cappel和Jackson Immuno Research)染色。核用4′，6′-聯(lián)脒-2′-苯基吲哚二氫氯化物(4’，6’-diamidine-2’-phenylindole dihydrochioride)(DAPI)復(fù)染。熒光圖像用ECLIPSE E800顯微鏡獲取。
ZNFN3A1的定位可能取決于細(xì)胞周期，因而利用流式細(xì)胞儀在不同細(xì)胞濃度的SNU475細(xì)胞中分析細(xì)胞周期。細(xì)胞以1×105細(xì)胞/100mm皿的密度鋪板。細(xì)胞在指定的時(shí)間用胰蛋白酶處理，收集于PBS中，并固定在70％冷乙醇中。RNase處理后，細(xì)胞在PBS中用碘化丙錠(50μg/ml)染色。在Becton Dickinson FACScan上進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過CellQuest和ModFit軟件(Verity Software House)進(jìn)行分析。從至少20,000個(gè)未經(jīng)選通的細(xì)胞確定處于細(xì)胞周期G0/G1、S和G2/M期的核、以及任何亞-G1細(xì)胞群的百分比。
將低細(xì)胞濃度和高細(xì)胞濃度相比，處于G0/G1期的細(xì)胞群在高細(xì)胞濃度的情況下升高，然而S和G2/M期的細(xì)胞群大大下降。為詳細(xì)確定細(xì)胞周期對ZNFN3A1定位的影響，利用阿非迪霉素(aphidicolin)使Huh7細(xì)胞同步化，并觀察ZNFN3A1的亞細(xì)胞定位(圖4a，b)。大多數(shù)Huh7細(xì)胞在阿非迪霉素處理36小時(shí)之后停留在G0/G1期，并且ZNFN3A1定位于胞漿中。當(dāng)從培養(yǎng)基中除去阿非迪霉素后，細(xì)胞周期得以前進(jìn)，并且ZNFN3A1蛋白從胞漿轉(zhuǎn)移到核中。這些數(shù)據(jù)證明ZNFN3A1蛋白的亞細(xì)胞定位受細(xì)胞周期狀態(tài)的調(diào)控，而且ZNFN3A1蛋白在增殖條件下轉(zhuǎn)移到核中。
實(shí)施例4ZNFN3A1對正常組織細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞的生長的促進(jìn)為分析ZNFN3A1基因轉(zhuǎn)移對肝細(xì)胞癌細(xì)胞系生長的影響，用包含有義ZNFN3A1和反義-ZNFN3A1的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染正常組織細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞。
利用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)供應(yīng)商的建議用含有全長ZNFN3A1編碼序列的pcDNA3.1載體(Invitrogen)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。細(xì)胞在含有10％FBS和0.9mg/ml遺傳霉素(geneticin)的DMEM中維持，并挑選單個(gè)集落。通過RT-PCR確定組成型ZNFN3A1表達(dá)。
NIH3T3細(xì)胞通常不表現(xiàn)出ZNFN3A1 mRNA的內(nèi)源表達(dá)。在集落形成時(shí)，有義ZNFN3A1表達(dá)載體促進(jìn)的NIH3T3細(xì)胞的集落形成，而模擬物和反義-ZNFN3A1載體與之則相比顯示未生長，如圖5A、5B所示。
集落形成測定通過將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/100mm皿的密度鋪板來進(jìn)行。24小時(shí)后，利用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用適當(dāng)濃度的遺傳霉素培養(yǎng)2周。細(xì)胞用100％甲醇固定，并用Giemsa溶液染色。這些集落形成測定通過三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。
為進(jìn)一步研究ZNFN3A1的生長促進(jìn)效果，進(jìn)一步對ZNFN3A1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行檢查。被有義ZNFN3A1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)組成型ZNFN3A1 mRNA(圖5C，5D)。表達(dá)由RT-PCR測定。如圖5C、5D中所示，持續(xù)表達(dá)ZNFN3A1的集落與被反義ZNFN3A1和對照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，表現(xiàn)出高的生長能力，表明ZNFN3A1對于肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長促進(jìn)具有重要作用。
實(shí)施例5反義寡核苷酸所致的ZNFN3A1表達(dá)的降低阻抑了肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長為調(diào)查阻抑ZNFN3A1是否可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的生長遲緩和/或細(xì)胞死亡，合成了許多反義寡核苷酸以抑制ZNFN3A1的表達(dá)?？缙鹗济艽a子的ZNFN3A1的有義或反義S-寡核苷酸利用LIPOFECTIN試劑(GIBCO-BRL)轉(zhuǎn)染。硫代磷酸酯修飾的ODN序列如下反義S-寡核苷酸5’-GCGGGAGGATGGAGCC(SEQ.ID.NO.3)。
細(xì)胞與有義和反義S-寡核苷酸培養(yǎng)24小時(shí)，并通過RT-PCR和利用抗-ZNFN3A1抗體的蛋白質(zhì)印跡對它們的ZNFN3A1和ZNFN3A1表達(dá)進(jìn)行分析。
用跨起始密碼子的反義S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯著降低組成型地表達(dá)大量ZNFN3A1的SNU475和Huh7細(xì)胞中ZNFN3A1的內(nèi)源表達(dá)(圖6A、B)。如先前所描述的集落形成測定所確定的，反義S-寡核苷酸的轉(zhuǎn)染還顯著抑制Huh7和SNU475細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。
MTT試驗(yàn)通過將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/100mm皿的密度鋪板來進(jìn)行。第二天，細(xì)胞用ZNFN3A1的有義或反義S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染，一式三份。培養(yǎng)72小時(shí)之后，培養(yǎng)基用含5mg 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑溴化物(MTT)(SIGMA)的10ml新鮮培養(yǎng)基替換。于37℃進(jìn)一步溫育4小時(shí)之后，細(xì)胞通過添加1ml 0.01N HCI/10％SDS裂解。顏色反應(yīng)用ELISA板閱讀器在570nm測試波長處定量(參比，630nm)。細(xì)胞存活力表示為與對照相比較的吸光度。
還在其它HCC細(xì)胞系包括Alexander細(xì)胞和SNU423細(xì)胞中觀察到因反義-ZNFN3A1轉(zhuǎn)染所引起的與對照S-寡核苷酸相比的細(xì)胞生長阻抑，如圖6C、6D所示，所述兩種細(xì)胞也都組成型地表達(dá)大量的ZNFN3A1。集落形成測定結(jié)果通過三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到確認(rèn)。此外，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示抑制ZNFN3A1表達(dá)可顯著降S期細(xì)胞群的細(xì)胞數(shù)目并提高亞-G1期的數(shù)目(圖6E)。這些結(jié)果揭示，阻抑ZNFN3A1表達(dá)可誘導(dǎo)HCC的生長抑制和促進(jìn)其凋亡。
實(shí)施例6ZNFN3A1與RNA螺旋酶KIAA0054的相互作用為調(diào)查ZNFN3A1的致癌機(jī)制，利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)尋找與ZNFN3A1相互作用的蛋白。酵母雙雜交試驗(yàn)利用Clontech的MATCHMAKER GAL4雙雜交系統(tǒng)2和系統(tǒng)3根據(jù)制造商的方案進(jìn)行。全長ZNFN3A1編碼序列被克隆到pAS2-1的EcoR I位點(diǎn)中作為誘餌載體。為篩選文庫，將人睪丸文庫克隆到pACT2(Clontech)中。將同時(shí)共轉(zhuǎn)化的AH109酵母細(xì)胞(帶有pAS2-1誘餌載體和多個(gè)pACT2捕獲載體)涂板在添加有25mg/L X-α-Gal(Clontech)和25mM 3-氨基-1，2，4，-三唑(Sigma)的SD基本培養(yǎng)基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)上。從陽性集落中分離文庫質(zhì)粒，并對序列和讀框進(jìn)行確認(rèn)。
在鑒定的克隆中，RNA螺旋酶KIAA0054的C-末端區(qū)與ZNFN3A1通過利用pAS2.1-ZNFN3A1和pACT2-KIAA0054進(jìn)行的同時(shí)轉(zhuǎn)化而相互作用(圖7A、7B)。RNA螺旋酶構(gòu)成一個(gè)利用核苷三磷酸作為能源解開雙鏈RNA的蛋白家族。很清楚RNA螺旋酶是事實(shí)上發(fā)現(xiàn)于所有的生物過程中的廣泛分布的一組蛋白。
為進(jìn)一步確認(rèn)ZNFN3A1和KIAA0054的相互作用，制備了FLAG-標(biāo)記的ZNFN3A1蛋白。每10-cm皿HeLa細(xì)胞用8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1和pCMV-HA-KIAA0054 DNA轉(zhuǎn)染，并且再過48小時(shí)后收集。細(xì)胞用含150mM NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(PBS)(pH7.4)洗滌1次，并在NET-N緩沖液(150mM NaCl、0.5％NP-40、20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、和1X完全蛋白酶抑制劑混合物)中裂解。在典型的免疫沉淀反應(yīng)中，300μgHela全細(xì)胞裂解物提取物與1μg所需抗體和20μl蛋白A或蛋白G Sepharose珠子(Zymed)于4℃溫育1-2小時(shí)。珠子用1ml NET-N緩沖液洗滌4次。結(jié)合于珠子的蛋白通過在SDS樣品緩沖液中煮沸而洗脫，通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜如上所述用于免疫印跡。裂解物用抗-FLAG抗體和抗-HA抗體作為對照通過免疫印跡進(jìn)行直接分析。ZNFN3A1蛋白顯示了它與表達(dá)在HeLa哺乳動物細(xì)胞中的HA-標(biāo)記的KIAA0054蛋白的結(jié)合(圖7C)。
為鑒定ZNFN3A1中負(fù)責(zé)與KIAA0054相互作用的區(qū)域，利用ZNFN3A1缺失片段進(jìn)行雙雜交試驗(yàn)。缺乏氨基酸1-250或者100-428的突變體與KIAA0054 C-末端區(qū)的相互作用為陰性，而含有氨基酸100-250的片段為陽性(圖8)。這說明ZNFN3A1-結(jié)合區(qū)位于SET結(jié)構(gòu)域中。
實(shí)施例7ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之間的相互作用RNA螺旋酶通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II對轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵作用。這些結(jié)果顯示存在著鋅指蛋白ZNFN3A1通過不僅與RNA螺旋酶KIAA0054而且與RNA聚合酶II結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄的可能性。ZNFN3A1、RNA螺旋酶KIAA0054和RNA聚合酶II之間的結(jié)合由共免疫沉淀測試(圖9)。每10-cm皿HeLa細(xì)胞用8μg pFLAG-CMV-ZNFN3A1和pCMV-HA-KIAA0054 DNA轉(zhuǎn)染，并且再過48小時(shí)后收集。細(xì)胞用含150mM NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(PBS)(pH 7.4)洗滌1次，并在NET-N緩沖液(150mM NaCl、0.5％NP-40、20mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、和1X完全蛋白酶抑制劑混合物)中裂解。在典型的免疫沉淀反應(yīng)中，300μg全細(xì)胞裂解物提取物與1μg抗體和20μl蛋白A或蛋白G Sepharose珠子(Zymed)于4℃溫育1-2小時(shí)。珠子用1ml NET-N緩沖液洗4次。結(jié)合于珠子的蛋白通過在SDS樣品緩沖液中煮沸而洗脫，通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜如上所述用于免疫印跡。
利用抗-FLAG抗體、抗-HA抗體和抗-RNA聚合酶II抗體檢測到與內(nèi)源RNA聚合酶II的結(jié)合。當(dāng)抗-FLAG抗體用于免疫沉淀并且抗RNA聚合酶II抗體用于免疫印跡的時(shí)候，RNA聚合酶II特異性帶在共同表達(dá)FLAG-ZNFN3A1蛋白和HA-KIAA0054蛋白的情況下被強(qiáng)烈檢測到，并且在僅表達(dá)FLAG-ZNFN3A1蛋白的情況下少量檢測到。在另一方面，當(dāng)抗-HA抗體用于免疫沉淀并且抗RNA聚合酶II抗體用于免疫印跡的時(shí)候，RNA聚合酶特異性帶不僅在共同表達(dá)FLAG-ZNFN3A1蛋白和HA-KIAA0054蛋白的情況下，而且還在僅表達(dá)HA-KIAA0054蛋白的情況下被強(qiáng)烈檢測到。而且，通過改變用于免疫沉淀和免疫印跡的抗體反向進(jìn)行了共免疫沉淀。結(jié)果與利用對等抗體的情況相似。這些結(jié)果證明RNA螺旋酶KIAA0054通過分別與ZNFN3A1蛋白和RNA聚合酶II接觸，可以介導(dǎo)ZNFN3A1蛋白和RNA聚合酶II之間的復(fù)合體的形成。因此，ZNFN3A1、RNA螺旋酶KIAA0054和RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能在肝細(xì)胞癌致癌作用中對促進(jìn)細(xì)胞生長方面具有重要作用。圖12是ZNFN3A1、RNA螺旋酶和RNA聚合酶II之間形成的復(fù)合體調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的圖解。
實(shí)施例8ZNFN3A1蛋白的序列特異性結(jié)合利用含有20個(gè)隨機(jī)核苷酸的核心的寡核苷酸構(gòu)建物測定了ZNFN3A1的共有DNA結(jié)合位點(diǎn)。利用隨機(jī)寡核苷酸通過DNA選擇手段尋找公認(rèn)的能夠在體外與ZNFN3A1蛋白結(jié)合的保守性序列。制備了GST-ZNFN3A1融合蛋白，并將其固定在Sepharose 4B是噶報(bào)告，選出能與該蛋白結(jié)合的雙鏈隨機(jī)寡核苷酸DNA。在經(jīng)過10次選擇和隨后的擴(kuò)增之后，擴(kuò)增的DNA被克隆到PCR載體(Clontech)中，并對92個(gè)克隆進(jìn)行了測序。在這92個(gè)克隆中，32個(gè)(34.8％)含有共有序列5’-CCCTCC-3’，這是比計(jì)算概率高102倍的發(fā)生率(圖10A)。為制備表達(dá)ZNFN3A1鋅指結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，利用一對引物5’-CGGAATTCATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3’[SEQ.ID.NO.9]和5’-CCGCTCGAGGGATGCTCTGATGTTGGCGTCG-3’[SEQ.ID.NO.10]，通過RT-PCR擴(kuò)增了與全長ZNFN3A1密碼子對應(yīng)的cDNA片段，將其亞克隆到pGEX-6P質(zhì)粒中合適的克隆位點(diǎn)上。如前所述制備重組融合蛋白并由Sepharose 46柱純化。具有序列“5’-GGGAGAATTCCGACACGCGT(N20)CTCGAGCGTCTACATGGATCCTCA-3”’[SEQ.ID.NO.11]的寡核苷酸，用于按照上文所述進(jìn)行選擇和擴(kuò)增。
利用真核啟動子數(shù)據(jù)庫(http//www.epd.isb-slb.ch/index.html)，尋找ZNFN3A1下游候選基因，并挑選到5個(gè)候選基因。首選，通過半定量RT-PCR在外源表達(dá)ZNFN3A1的COS7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體中測定每個(gè)基因的表達(dá)水平(圖10B)。這些結(jié)果揭示EGFR、myc和Bc12的表達(dá)被ZNFN3A1上調(diào)。
在EGFR的5’側(cè)翼區(qū)-213-bp和-207-bp之間(CBS1)、-106-bp和-100-bp之間(CBS2)、-65-bp和-59-bp之間(CBS3)、以及-46-bp和-40-bp之間(CBS4)，鑒定到四個(gè)公認(rèn)的ZNFN3A1結(jié)合位點(diǎn)，它們的共有靶序列為5’-(C)CCCTCC(T)或(A)GGAGGG(G)-3’。通過將CBS1、CBS2、cBS3和CBS4每個(gè)序列克隆到pGL3-基礎(chǔ)載體(Promega)的合適的酶位點(diǎn)中，制備了含有這些序列的野生型報(bào)告質(zhì)粒(P1)以及該質(zhì)粒的四個(gè)缺失構(gòu)建體(P2、P3、P4和P5)。質(zhì)粒P1、P2、P3、P4和P5通過擴(kuò)增來制備，其中用到P1-F(5′-GGGGTACCCAGTGCTGGGAACGCCCCTCTCG-3′)[SEQ.ID.NO.12]、P2-F(5’-GGGGTACCCACTCCCGCCGGAGACTAGGTCC-3’)[SEQ.ID.NO.13]、3-F(5’-GGGGTACCCTCGCATTCTCCTCCTCCTCTGC-3’)[SEQ.ID.NO.14]、4-F(5’-GGGGTACCTGGTCCCTCCTCCTCCCGCCCTG-3’)[SEQ.ID.NO.15]或P5-F(5’-GGGGTACCTCCCGCCCTGCCTCCCGCGCCTC-3’)[SEQ.ID.NO.16]以及相同的反向引物(P1-R；5’-GAAGATCTAG GTGGCCTGTCGTCCGGTCTG G-3’)[SEQ.ID.NO.17]。利用QuickChange定點(diǎn)誘變試劑盒根據(jù)供應(yīng)商(Stratagene)的建議用CATTCC取代CCCTCC，從而對兩個(gè)公認(rèn)的ZNFN3A1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變。
每個(gè)報(bào)告質(zhì)粒(2μg)利用FuGENE6試劑(Boehringer)根據(jù)制造商的說明與0.2μg pRL-TK質(zhì)粒(Promega)共轉(zhuǎn)染。利用雙重-螢光素酶報(bào)告子測定系統(tǒng)(Promega)按照制造商的方案進(jìn)行螢光素酶測定。
實(shí)施例9ZNFN3A1對EGFR啟動子活性的上調(diào)既然在HCC中報(bào)道了增強(qiáng)的EGFR表達(dá)，我們聚焦于該報(bào)告分子并測試它的啟動子是否受ZNFN3A1-結(jié)合序列的調(diào)控。我們在它的5’側(cè)翼區(qū)鑒定到四個(gè)可能的ZNFN3A1-結(jié)合基元(CBS1、2、3和4)，并制備了含有這四個(gè)基元的報(bào)告質(zhì)粒(P1)以及多個(gè)缺失形式(P2、P3、P4和P5)。當(dāng)這些報(bào)告質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到SNU475細(xì)胞中時(shí)，P1的活性顯著高于P2、P3、P4或P5?？紤]到P4的活性與P5的非常相似的事實(shí)，我們認(rèn)為-261和-50之間含有CBS1、CBS2和CBS3的區(qū)域，可能與EGFR的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。為揭露這些結(jié)構(gòu)域的作用，我們構(gòu)建了含有突變體CBS1(P1m1)和突變體CBS2(P1m2)或者突變的CBS3(P1m3)的報(bào)告質(zhì)粒，其中每個(gè)候選結(jié)合基元由5’-CCCTCC-3’變?yōu)?’-CATTCC-3’(圖11A)。報(bào)告子測定揭示含突變基元的片段(P1m1、P1m2和P1m3)激活EGFR轉(zhuǎn)錄的程度比P1弱(圖11B)。這些結(jié)果意味著這三個(gè)公認(rèn)的ZNFN3A1-結(jié)合基元參與EGFR的轉(zhuǎn)錄激活。
工業(yè)實(shí)用性新的人類基因ZNFN3A1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與非癌肝組織相比顯著提高。因此，該基因可作為HCC的診斷標(biāo)志，而其所編碼的蛋白因此可用于診斷測定。
本發(fā)明人還已經(jīng)證明新蛋白ZNFN3A1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長，反之細(xì)胞生長受與ZNFN3A1相應(yīng)的反義寡核苷酸的抑制。這些發(fā)現(xiàn)表明ZNFN3A1刺激致癌活性。因此，這種新的癌蛋白是開發(fā)抗癌醫(yī)藥品的有用靶。舉例來說，封閉ZNFN3A1表達(dá)或者阻止它的活性的制劑可能會找到作為抗癌制劑的治療用途，特別是治療HCC的抗癌制劑。這類制劑的例子包括識別ZNFN3A1的反義寡核苷酸和抗體。
此外，本發(fā)明人已經(jīng)證明ZNFN3A1直接與RNA螺旋酶聯(lián)合并與RNA聚合酶II形成復(fù)合體。該復(fù)合體隨即通過與5’側(cè)翼區(qū)元件“(C)CCCTCC(T)”的直接結(jié)合，激活下游靶基因，包括EGFR的轉(zhuǎn)錄。因此，抑制該復(fù)合體活性的制劑可能也會找到治療和預(yù)防HCC的用途。
盡管已經(jīng)詳細(xì)并參照其中的具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員顯而易見的是，能夠?qū)ζ溥M(jìn)行各種變化和修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>東京大學(xué)總長代表日本國(JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THEUNIVERSITY OF TOKYO ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)<120>肝細(xì)胞癌相關(guān)基因和蛋白<130>ONC-A0206P<150>US 60/324.261<151>2001-09-25<150>US 60/391,666<151>2002-06-26<150>CA<151>2002-08-23<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1622<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(96)..(1382)<223>
<400>1gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg60cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag gtg 113Met Glu Pro Leu Lys Val1 5gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg acc 161Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn Gly Leu Arg Ala Val Thr10 15 20
ccg ctg cgc ccc gga gag cta ctc ttc cgc tcg gat ccc ttg gcg tac 209Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg Ser Asp Pro Leu Ala Tyr25 30 35acg gtg tgc aag ggg agt cgt ggc gtc gtc tgc gac cgc tgc ctt ctc 257Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val Cys Asp Arg Cys Leu Leu40 45 50ggg aag gaa aag ctg atg cga tgc tct cag tgc cgc gtc gcc aaa tac 305Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln Cys Arg Val Ala Lys Tyr55 60 65 70tgt agt gct aag tgt cag aaa aaa gct tgg cca gac cac aag cgg gaa 353Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp Pro Asp His Lys Arg Glu75 80 85tgc aaa tgc ctt aaa agc tgc aaa ccc aga tat cct cca gac tcc gtt 401Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg Tyr Pro Pro Asp Ser Val90 95 100cga ctt ctt ggc aga gtt gtc ttc aaa ctt atg gat gga gca cct tca 449Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu Met Asp Gly Ala Pro Ser105 110 115gaa tca gag aag ctt tac tca ttt tat gat ctg gag tca aat att aac 497Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp Leu Glu Ser Asn Ile Asn120 125 130aaa ctg act gaa gat aag aaa gag ggc ctc agg caa ctc gta atg aca 545Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu Arg Gln Leu Val Met Thr135 140 145 150ttt caa cat ttc atg aga gaa gaa ata cag gat gcc tct cag ctg cca 593Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln Asp Ala Ser Gln Leu Pro155 160 165cct gcc ttt gac ctt ttt gaa gcc ttt gca aaa gtg atc tgc aac tct 641Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala Lys Val Ile Cys Asn Ser170 175 180ttc acc atc tgt aat gcg gag atg cag gaa gtt ggt gtt ggc cta tat 689Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu Val Gly Val Gly Leu Tyr185 190 195
ccc agt atc tct ttg ctc aat cac agc tgt gac ccc aac tgt tcg att 737Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys Asp Pro Asn Cys Ser Ile200 205 210gtg ttc aat ggg ccc cac ctc tta ctg cga gca gtc cga gac atc gag 785Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg Ala Val Arg Asp Ile Glu215 220 225 230gtg gga gag gag ctc acc atc tgc tac ctg gat atg ctg atg acc agt 833Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu Asp Met Leu Met Thr Ser235 240 245gag gag cgc cgg aag cag ctg agg gac cag tac tgc ttt gaa tgt gac 881Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln Tyr Cys Phe Glu Cys Asp250 255 260tgt ttc cgt tgc caa acc cag gac aag gat gct gat atg cta act ggt 929Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp Ala Asp Met Leu Thr Gly265 270 275gat gag caa gta tgg aag gaa gtt caa gaa tcc ctg aaa aaa att gaa 977Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu Ser Leu Lys Lys Ile Glu280 285 290gaa ctg aag gca cac tgg aag tgg gag cag gtt ctg gcc atg tgc cag 1025Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln Val Leu Ala Met Cys Gln295 300 305 310gcg atc ata agc agc aat tct gaa cgg ctt ccc gat atc aac atc tac 1073Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu Pro Asp Ile Asn Ile Tyr315 320 325cag ctg aag gtg ctc gac tgc gcc atg gat gcc tgc atc aac ctc ggc 1121Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp Ala Cys Ile Asn Leu Gly330 335 340ctg ttg gag gaa gcc ttg ttc tat ggt act cgg acc atg gag cca tac 1169Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Met Glu Pro Tyr345 350 355agg att ttt ttc cca gga agc cat ccc gtc aga ggg gtt caa gtg atg 1217Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val Arg Gly Val Gln Val Met360 365 370
aaa gtt ggc aaa ctg cag cta cat caa ggc atg ttt ccc caa gca atg 1265Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly Met Phe Pro Gln Ala Met375 380 385 390aag aat ctg aga ctg gct ttt gat att atg aga gtg aca cat ggc aga 1313Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met Arg Val Thr His Gly Arg395 400 405gaa cac agc ctg att gaa gat ttg att cta ctt tta gaa gaa tgc gac 1361Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu Leu Glu Glu Cys Asp410 415 420gcc aac atc aga gca tcc taa gggaacgcag tcagagggaa atacggcgtg 1412Ala Asn Ile Arg Ala Ser425tgtctttgtt gaatgcctta ttgaggtcac acactctatg ctttgttagc tgtgtgaacc1472tctcttattg gaaattctgt tccgtgtttg tgtaggtaaa taaaggcaga catggtttgc1532aaaccacaag aatcattagt tgtagagaag cacgattata ataaattcaa aacatttggt1592tgaggatgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1622<210>2<211>428<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Pro Leu Lys Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn1 5 10 15Gly Leu Arg Ala Val Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg20 25 30Ser Asp Pro Leu Ala Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val35 40 45Cys Asp Arg Cys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln50 55 60
Cys Arg Val Ala Lys Tyr Cys Ser Ala Lys Cys Gln Lys Lys Ala Trp65 70 75 80Pro Asp His Lys Arg Glu Cys Lys Cys Leu Lys Ser Cys Lys Pro Arg85 90 95Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu100 105 110Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp115 120 125Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu130 135 140Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln145 150 155 160Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala165 170 175Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu180 185 190Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys195 200 205Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg210 215 220Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu225 230 235 240Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln245 250 255Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp260 265 270Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu275 280 285Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln290 295 300
Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu305 310 315 320Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp325 330 335Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr340 345 350Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val355 360 365Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly370 375 380Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met385 390 395 400Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu405 410 415Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser420 425<210>3<211>16<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>3gcgggaggat ggagcc16<210>4<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>4acaacagcct caagatcatc ag22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>5ggtccaccac tgacacgttg 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>6ttcccgatat caacatctac cag 23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>7agtgtgtgac ctcaataagg cat 23<210>8<211>24
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>8ctgccaagaa gtcggagtct ggag 24<210>9<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>9cggaattcat ggagccgctg aaggtggaaa ag 32<210>10<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>10ccgctcgagg gatgctctga tgttggcgtc g 31<210>11<211>64<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(40)<223>″n″＝A，G，C或T<400>11gggagaattc cgacacgcgt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ctcgagcgtc tacatggatc60ctca 64<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>12ggggtaccca gtgctgggaa cgcccctctc g 31<210>13<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>13ggggtaccca ctcccgccgg agactaggtc c 31<210>14<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>14
ggggtaccct cgcattctcc tcctcctctg c 31<210>15<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>15ggggtacctg gtccctcctc ctcccgccct g 31<210>16<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>16ggggtacctc ccgccctgcc tcccgcgcct c 31<210>17<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>一個(gè)人工合成的引物序列<400>17gaagatctag gtggcctgtc gtccggtctg g 3權(quán)利要求
1.分離的DNA，為下面(a)到(d)中任何之一(a)編碼由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的DNA；(b)包含核苷酸序列SEQ.ID.NO.1的編碼區(qū)的DNA；(c)編碼由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的DNA，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，從而所編碼的蛋白是由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的功能等價(jià)體；和(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由核苷酸序列SEQ.ID.NO.1組成的DNA雜交的DNA，從而所編碼的蛋白是由任何一種SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列組成的蛋白的功能等價(jià)體。
2.分離的DNA，編碼由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2組成的蛋白的部分肽。
3.載體，其中插入了權(quán)利要求1或2的DNA。
4.轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包含權(quán)利要求1或2的DNA，或者權(quán)利要求3的載體。
5.分離的蛋白，由根據(jù)權(quán)利要求1的DNA編碼，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和靶基因的轉(zhuǎn)錄激活的活性。
6.分離的多肽，由根據(jù)權(quán)利要求2的DNA編碼。
7.制備權(quán)利要求5的蛋白的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并從細(xì)胞或其培養(yǎng)上清收集所表達(dá)的蛋白的步驟。
8.轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，包括權(quán)利要求5的蛋白及其至少一種共激活因子。
9.權(quán)利要求8的復(fù)合體，其中的共激活因子選自RNA螺旋酶或RNA聚合酶。
10.抗體，它識別并特異性結(jié)合權(quán)利要求5的蛋白或權(quán)利要求8的復(fù)合體。
11.多核苷酸，與由核苷酸序列SEQ.ID.NO.1組成的DNA或其互補(bǔ)鏈雜交，并包括至少15個(gè)核苷酸。
12.用于治療癌癥的治療制劑，包括權(quán)利要求10的抗體或者權(quán)利要求11的多核苷酸。
13.篩選與權(quán)利要求5所述蛋白結(jié)合的化合物的方法，包括步驟(a)使包含至少一種測試化合物的受試樣品與權(quán)利要求5的蛋白或其部分肽進(jìn)行接觸；(b)檢測受試樣品與蛋白或其部分肽的結(jié)合活性；和(c)選擇與蛋白或其部分肽結(jié)合的測試化合物。
14.與權(quán)利要求5的蛋白結(jié)合的化合物，它能夠通過權(quán)利要求13的方法分離。
15.篩選抑制權(quán)利要求5所述蛋白的活性的化合物的方法，包括步驟(a)在存在包含至少一種測試化合物的受試樣品的時(shí)候培養(yǎng)表達(dá)權(quán)利要求5的蛋白或其部分肽的細(xì)胞；(b)檢測細(xì)胞增殖；和(c)選擇與不存在受試樣品時(shí)所檢測到的增殖相比抑制增殖的測試化合物。
16.抑制權(quán)利要求5的蛋白的活性的化合物，它能夠通過權(quán)利要求15的方法分離。
17.篩選抗癌活性的化合物的方法，包括步驟(a)使包含至少一種測試化合物的受試樣品與權(quán)利要求5的蛋白、它的共激活因子以及包含所述蛋白的靶序列的DNA，在允許所述蛋白和DNA形成復(fù)合體的合適條件下接觸；和(b)選擇抑制復(fù)合體形成的測試化合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述靶序列包括側(cè)接EGFR 5’區(qū)的CBS序列。
19.篩選抗癌活性的化合物的方法，包括步驟(a)使包含至少一種測試化合物的受試樣品與權(quán)利要求7的復(fù)合體和具有為所述復(fù)合體識別的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的報(bào)告基因接觸；和(b)選擇抑制報(bào)告基因表達(dá)的測試化合物。
20.抗癌組合物，包括通過權(quán)利要求18或19的方法分離的化合物作為活性成分。
21.抗癌組合物，包括與權(quán)利要求1的DNA結(jié)合的反義寡核苷酸、核酶或干擾性RNA作為活性成分。
22.診斷癌癥的方法，其中所述方法包括步驟(a)測定標(biāo)本的生物樣品中ZNFN3A1基因的表達(dá)水平；(b)將ZNFN3A1基因的表達(dá)水平與正常樣品中的水平相比較，和(c)將樣品中ZNFN3A1基因的高表達(dá)水平判定為具有癌癥。
23.權(quán)利要求13的方法，其中癌癥是肝細(xì)胞癌。
24.診斷肝細(xì)胞癌的診斷劑，包括與權(quán)利要求1的DNA或者權(quán)利要求5的蛋白結(jié)合的化合物。
全文摘要
本申請?zhí)峁┝诵碌娜祟惢騔NFN3A1，它的表達(dá)在大多數(shù)HCC中與相應(yīng)的非癌肝組織相比顯著升高。該基因編碼的蛋白具有鋅指結(jié)構(gòu)域以及SET結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)與RNA螺旋酶和RNA聚合酶形成調(diào)節(jié)復(fù)合體。
文檔編號G01N33/15GK1628179SQ0282340
公開日2005年6月15日 申請日期2002年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月25日
發(fā)明者中村佑輔, 古川洋一 申請人:東京大學(xué)總長代表日本國, 腫瘤療法科學(xué)股份有限公司