專利名稱：具有靜電層的固體支持物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定DNA等的支持物以及固定化的核酸分子。
背景技術(shù)：
一般地，見JP-A-7-75544和JP-A-7-303469，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是從已有序列合成一個(gè)核苷酸序列的方法。
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中，目標(biāo)DNA的兩側(cè)是一對引物，DNA聚合酶反復(fù)作用于目標(biāo)DNA，通過此方法，被引物包圍的區(qū)域可以被連續(xù)地?cái)U(kuò)增。
只有目標(biāo)序列才能通過PCR被大量、正確地?cái)U(kuò)增，產(chǎn)生大量的拷貝；而且在短時(shí)間內(nèi)的有效擴(kuò)增也是可能的，因此目前PCR被廣泛應(yīng)用于生化、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)許多不同的研究、測定、試驗(yàn)等中。
通常認(rèn)為PCR的原則是控制溫度，反應(yīng)是通過加熱和冷卻的步驟不斷反復(fù)(熱循環(huán))而進(jìn)行的。更具體地講，PCR包含以下步驟首先在高溫下將擴(kuò)增目標(biāo)DNA雙鏈分子變性為互補(bǔ)的單鏈；然后通過冷卻使引物與DNA鏈退火，所選引物與DNA的一部分互補(bǔ)；最后再次加熱，在DNA聚合酶的作用下，DNA向引物的下游延伸。如此不斷循環(huán)進(jìn)行，含有變性、退火和延伸三個(gè)步驟的一個(gè)循環(huán)被多次地重復(fù)，這樣就可以擴(kuò)增出大量的雙鏈DNA。
具體地，需要多次重復(fù)該熱循環(huán)，其由以下構(gòu)成1)提高樣品的溫度到95℃以破壞雙鏈DNA的氫鍵；2)接著將樣品的溫度降低到45℃，使DNA與引物重結(jié)合以復(fù)制；3)然后再次升高樣品的溫度到74℃，使用耐熱的聚合酶對引物進(jìn)行延伸使DNA復(fù)制。在這樣一個(gè)DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)上述的熱循環(huán)，需要將樣品放入由合成樹脂等制成的容器內(nèi)，再將該容器放入一個(gè)鋁制加熱部件中。
但是上述的熱循環(huán)消耗大量的時(shí)間，且要得到所需量的DNA需要數(shù)小時(shí)。此外，當(dāng)通過控制溫度(加熱和冷卻)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)改變溫度有一個(gè)限度，步驟之間的改變不能平穩(wěn)進(jìn)行，這樣將要被擴(kuò)增出來的核苷酸序列的精確性可能會(huì)受到影響，或者在某些情況下非目標(biāo)DNA序列會(huì)被復(fù)制。而且需要特殊的儀器或技術(shù)以迅速改變溫度，因此存在經(jīng)濟(jì)問題如對設(shè)備的投資以及技術(shù)問題。
考慮到上述的問題，WO 00/22108、WO 02/12891或JP-A-2002-82116開發(fā)出了一種固體支持物，作為一種能夠容易固定DNA的支持物，并且適用于于通過DNA擴(kuò)增反應(yīng)來復(fù)制DNA，該支持物的基質(zhì)表面包含一個(gè)經(jīng)過表面處理和化學(xué)修飾的薄層，此薄層具有能夠順序與核酸分子共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。
但是在上述固體支持物上并不總能固定足夠量的DNA，并且結(jié)合DNA的鍵并不總具有足夠的強(qiáng)度，因此一直需要有能以更高鍵強(qiáng)結(jié)合DNA的且能固定更高濃度DNA的固體支持物。
本發(fā)明的目的是提供能夠以更高鍵強(qiáng)結(jié)合核酸分子且能固定高濃度核酸分子的固體支持物。
發(fā)明公開本發(fā)明的發(fā)明者為了解決上述的問題，進(jìn)行了詳細(xì)的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在其基質(zhì)上有能共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)的固體支持物上，進(jìn)一步增加一個(gè)靜電層以靜電吸引核酸分子，可以顯著增加固定化的核酸分子的量，提高結(jié)合核酸分子的鍵強(qiáng)。
具體地，本發(fā)明包括以下發(fā)明。
(1)固體支持物，它具有靜電層用以靜電吸引核酸分子，以及在其基質(zhì)上具有能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
(2)根據(jù)上述(1)中的固體支持物，其中固體支持物基質(zhì)的表面由至少一種以下的物質(zhì)進(jìn)行表面處理金剛石、軟金剛石、含碳物質(zhì)和碳化物。
(3)根據(jù)上述(1)或(2)的固體支持物，其中的靜電層含有含氨基化合物，該化合物與基質(zhì)不共價(jià)結(jié)合。
(4)根據(jù)上述(1)或(2)的固體支持物，其中的靜電層由與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的含氨基化合物組成，該含氨基化合物在其不與基質(zhì)結(jié)合的末端有一個(gè)氨基。
(5)根據(jù)上述(1)至(3)中的任何一項(xiàng)的固體支持物，它通過將具有未取代或單取代氨基的化合物和碳化合物沉積在基質(zhì)上，并且然后引入一個(gè)可以共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)而得到。
(6)根據(jù)上述(1)至(4)中的任何一項(xiàng)的固體支持物，它通過將基質(zhì)浸入到具有未取代或者單一取代氨基的化合物的溶液中，并且然后引入一個(gè)可以共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)而得到。
(7)根據(jù)上述(6)的固體支持物，其中具有未取代或者有單一取代氨基的化合物是聚丙烯酰胺。
(8)根據(jù)上述(1)至(7)中的任何一項(xiàng)的固體支持物，其中的核酸分子是DNA。
(9)固定化的核酸分子，它含有固定在根據(jù)上述(1)至(8)中任何一項(xiàng)的固體支持物上的核酸分子。
(10)生產(chǎn)固體支持物的一種方法，其特征在于將具有未取代或單取代氨基的化合物和碳化合物沉積在基質(zhì)上，并且然后引入可以共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
(11)生產(chǎn)固體支持物的一種方法，其特征在于將基質(zhì)浸入到具有未取代或單取代氨基的化合物的溶液中，并且然后引入可以共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
(12)下述方法將引物固定在根據(jù)上述(1)至(8)中任何一項(xiàng)的固體支持物上，然后使核酸分子與引物雜交，由此使得與該核酸分子互補(bǔ)的核酸分子得以延伸。
(13)檢測核酸分子的方法，該方法包括將引物固定在根據(jù)上述(1)至(8)中任何一項(xiàng)的固體支持物上，使核酸分子與引物雜交，在標(biāo)記的核酸的存在下使與上述核酸分子互補(bǔ)的核酸分子得以延伸，以及讀取來自整合入互補(bǔ)核酸分子中的標(biāo)記核酸分子產(chǎn)生的信號(hào)。
(14)擴(kuò)增核酸分子的方法，這包括將引物固定在根據(jù)上述(1)至(8)中任何一項(xiàng)的固體支持物上，使核酸分子與引物雜交并且進(jìn)行PCR反應(yīng)。
(15)擴(kuò)增DNA的方法，這包括將引物固定在根據(jù)上述(1)至(8)中任何一項(xiàng)的固體支持物上，使DNA與引物雜交，并使用鏈取代DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
(16)根據(jù)(13)的方法，該方法還包括在核酸分子與引物雜交后擴(kuò)增核酸分子的步驟。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式可以用作本發(fā)明中的基質(zhì)的物質(zhì)實(shí)例包括，例如聚硅氧烷、玻璃、纖維、木頭、紙、陶瓷和塑料(例如聚酯樹脂、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹脂)、尼龍、丙烯酸樹脂、碳氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚氨酯樹脂、甲基戊烯樹脂、酚醛樹脂、三聚氰胺樹脂、環(huán)氧樹脂、聚氯乙烯樹脂)。
在使用上面提到的物質(zhì)作為基質(zhì)材料時(shí)，不一定有一個(gè)經(jīng)過表面處理的薄層。但是最好進(jìn)行表面處理以牢固地固定化合物用以引入能在基質(zhì)上共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
對于表面處理，最好使用合成金剛石、高壓合成金剛石、天然金剛石、軟金剛石(如金剛石樣碳)、無定形碳、含碳物質(zhì)(例如石墨、碳60或者碳納米管)、以上物質(zhì)的混合物或者以上物質(zhì)的層壓產(chǎn)物。此外還可以使用碳化物，例如碳化鉿、碳化鈮、碳化硅、碳化鉭、碳化釷、碳化鈦、碳化鈾、碳化鎢、碳化鋯、碳化鉬、碳化鉻或者碳化釩等。在這里，軟金剛石是一個(gè)集合名詞，代表了具有部分金剛石結(jié)構(gòu)，即金剛石和碳的混合物，例如所謂的金剛石樣碳(DLC)，其中金剛石和碳的比例沒有特別的限制。
可以用載玻片表面形成一層軟金剛石薄膜來作為一個(gè)經(jīng)過表面處理的基質(zhì)的實(shí)例。優(yōu)選在含有0-99％(體積比)氫氣和100-1％甲烷的混和氣體中使用金剛石樣碳，通過離子化沉積方法制備這種基質(zhì)。
經(jīng)過表層處理的薄層其厚度優(yōu)選1納米到100微米。
可以用如以下的已知方法在基質(zhì)表面生成表面處理的薄層微波等離子體CVD(化學(xué)蒸氣沉積)法、ECRCVD(電子回旋共振器化學(xué)蒸氣沉積)法、IPC(電感偶合等離子體)法、直流濺鍍法、ECR(電子回旋共振器)濺鍍法、離子電鍍法、電弧離子電鍍法、EB(電子束)沉積法、電阻加熱蒸氣沉積法、離子化沉積法、電弧沉積法、激光沉積法等。
在本發(fā)明中使用的基質(zhì)的實(shí)例，不僅僅包括上面提到的已經(jīng)形成表面處理薄層的結(jié)構(gòu)，而且還包括合成金剛石、高壓合成金剛石、天然金剛石、軟金剛石(例如金剛石樣碳)、無定形碳、金屬，例如金、銀、銅、鋁、鎢和鉬、塑料(例如聚脂樹脂、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、ABS樹脂、尼龍、丙烯酸樹脂、碳氟樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚氨酯樹脂、甲基戊烯樹脂、酚醛樹脂、三聚氰氨樹脂、環(huán)氧樹脂、聚氯乙烯樹脂)、由上述金屬的粉末和陶瓷等物質(zhì)的粉末混合，使用上述的樹脂作為黏合劑制成的基質(zhì)、由壓模機(jī)將上述金屬或者陶瓷粉末壓制并在高溫下對該粉末進(jìn)行燒結(jié)制成的基質(zhì)。此外，基質(zhì)還可以是一種層壓產(chǎn)物，或者是上述材料組成的復(fù)合材料(例如由金剛石和另一種物質(zhì)組成的復(fù)合材料，如一種雙相的物質(zhì))。
基質(zhì)的形狀和大小并沒有特別的限制。形狀可以是盤狀、線狀、球狀、多邊形、粉末狀等等。對于基質(zhì)的大小，就盤狀基質(zhì)而言，一般0.1-100毫米寬，0.1-100毫米長，0.01-10毫米厚。
除此之外，在基質(zhì)的前表面和后表面可以形成鈦、金、鉑、鈮、鉻、碳化鈦、氮化鈦等形成的單層作為反射層，或者由上述材料的復(fù)合材料層作為反射層。反射層的厚度應(yīng)為10納米或者更厚，最好是100納米或者更厚，因?yàn)檎麄€(gè)表面必須均一。
如果使用玻璃作為基質(zhì)，優(yōu)選將表面1-1000納米的范圍內(nèi)弄粗糙表示為Ra(expressed in Ra)(JIS B 0601)。這種粗糙化的表面具有的優(yōu)勢是增加了基質(zhì)的表面積，因此可以高密度地固定大量的DNA探針等。
本發(fā)明的固體支持物中還具有能夠靜電吸引核酸分子的靜電層。
只要靜電層能夠靜電吸引核酸分子并且增加被固定的核酸的量，則對于靜電層就沒有什么特別的限制。靜電層可以由帶正電的化合物，例如含氨基化合物形成。
上述含氨基化合物包括含有未取代氨基和單取代(由一個(gè)含1至6個(gè)碳原子的烴基或類似物取代的)氨基的化合物(-NHR，R是取代基)。例如，1，2-乙烷二胺、六亞甲基二胺、正丙胺、單甲胺、二甲胺、單乙胺、二乙胺、芳胺、氨基偶氮苯、氨基醇(例如乙醇胺)、利凡諾、氨基苯甲酸、氨基蒽醌、氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、苯胺、上述物質(zhì)的多聚物(例如聚芳胺和聚賴氨酸)或者其共聚物、多胺(多價(jià)胺)例如4，4′，4″-三氨基三苯基甲烷、triamterene、亞精胺、精胺和腐胺。
可以不與基質(zhì)或者表面處理薄層發(fā)生共價(jià)結(jié)合，或者發(fā)生共價(jià)結(jié)合而形成靜電層。
如果不與基質(zhì)或者表面處理薄層發(fā)生共價(jià)結(jié)合而形成靜電層，則在表面處理薄層形成時(shí)，將上述含氨基化合物加入到薄膜形成裝置中形成含氨基的含碳薄膜。氨氣可以作為加入到薄膜形成裝置中的化合物。此外，表面處理薄層可以是多個(gè)薄層，其中含有氨基的薄層在黏著層之后形成。這種情況下可以在含氨氣的氣氛中進(jìn)行薄膜形成。
如果不與基質(zhì)或者表面處理薄層發(fā)生共價(jià)結(jié)合而形成靜電層，優(yōu)選在基質(zhì)上沉積上述含未取代或者單取代氨基的化合物和碳化合物之后引入能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)，以提高親和性，即靜電層和基質(zhì)或表面處理層之間的粘著。這里使用的碳化合物并沒有特殊的限制，只要它可以以氣態(tài)提供，然而優(yōu)選在常溫下為氣態(tài)的甲烷、乙烷和丙烷。優(yōu)選使用離子化沉積法作為沉積方法，其使用條件優(yōu)選是工作壓力0.1到50帕，且加速電壓200到1000伏。
如果與基質(zhì)或者表面處理薄層發(fā)生共價(jià)結(jié)合而形成靜電層，則可以在氯氣環(huán)境下對基質(zhì)或者帶有表面處理薄層的基質(zhì)進(jìn)行紫外輻射，使表面氯化，并與上述含氨基的化合物(例如多價(jià)胺，如聚芳胺、聚賴氨酸、4，4′，4″-三氨基三苯基甲烷或triamterene)發(fā)生反應(yīng)，在不與基質(zhì)結(jié)合的末端引入一個(gè)氨基。
此外，如果在溶液中進(jìn)行反應(yīng)將能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)引入帶有靜電層的基質(zhì)中(例如通過用二羧酸或者多價(jià)羧酸引入羧基)，優(yōu)選在將基質(zhì)浸入上述含未取代或者單取代氨基的化合物的溶液之后引入能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。上述溶液的溶劑可以例如為水、N-甲基吡咯烷酮和乙醇。
如果使用二羧酸或多價(jià)羧酸向帶有靜電層的基質(zhì)引入羧基，優(yōu)選事先使用N-羥基丁二酰亞胺和/或碳二亞胺將其活化，或者在N-羥基丁二酰亞胺和/或碳二亞胺的存在下進(jìn)行反應(yīng)。
如果將基質(zhì)浸入到具有未取代氨基或者單取代氨基的化合物的溶液中而形成靜電層，當(dāng)使用聚芳胺作為含氨基的化合物時(shí)，與基質(zhì)的附著度非常好，并且固定化的核酸分子的量將會(huì)增加。
靜電層的厚度最好是1納米到500微米。
如上所述，帶有靜電層的基質(zhì)表面進(jìn)行化學(xué)修飾以引入能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
上述功能基團(tuán)包括羧基、活性酯基、鹵代甲?；⒘u基、硫酸基、腈基、硝基、硫醇基和氨基。
可以引入羧基作為功能基團(tuán)的化合物包括羧鹵酸，用通式X-R1-COOH表示(其中X代表鹵原子，R1代表含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán))，例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、或4-氯苯甲酸；二羧酸，用通式HOOC-R2-COOH表示(其中R2代表單鍵或含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán))，例如草酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、鄰苯二甲酸；多價(jià)羧酸，例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三甲酸或者丁烷四羧酸；酮酸或者醛酸，用通式R3-CO-R4-COOH表示(其中R3代表氫原子或者含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán)，而R4代表含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán))；二羧酸的單酰鹵，用通式X-OC-R5-COOH表示(其中X代表鹵原子而R5代表單鍵或者含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán))，例如丁二酸單酰氯或丙二酸單酰氯；酸酐，例如鄰苯二甲酸酐、丁二酸酐、草酸酐、順丁烯二酸酐或者丁烷四羧酸酐。
對于上面提到的被引入的羧基，可以使用脫水縮合劑，如氨腈或者碳二亞胺(如1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺或者如N-羥基丁二酰亞胺的化合物對其進(jìn)行活性酯化。
用于引入鹵代甲酰基作為功能基團(tuán)的化合物包括二羧酸的二鹵化物，用通式X-CO-R6-CO-X表示(其中X代表鹵原子，且R6代表單鍵或者含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán))，例如丁二酰氯或者丙二酰氯。
用于引入羥基作為功能基團(tuán)的化合物包括羥基酸或酚酸，用通式HO-R7-COOH表示(其中R7代表含有1-12個(gè)碳原子的二價(jià)烴基基團(tuán))。
用于引入氨基作為功能基團(tuán)的化合物包括氨基酸。
在靜電層中上述化合物通過羧基和氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成酰胺鍵。
在上述的化合物中，多價(jià)羧酸例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三甲酸或者丁烷四羧酸還可以增加疏水性。
本發(fā)明中的固體支持物上可以固定DNA或者RNA兩種核酸分子。DNA或RNA的堿基數(shù)目一般是1到200，最好是5到150。此外，對于DNA，可以固定單鏈或雙鏈的DNA。
本發(fā)明的固體支持物可以用于核酸分子例如DNA的延伸反應(yīng)。此時(shí)，首先一個(gè)引物被固定到固體支持物上，然后雜交上一個(gè)單鏈或者雙鏈DNA。此后，DNA延伸反應(yīng)使得與引物雜交的DNA互補(bǔ)的DNA得以延伸。
可以使用長度和序列已知的雙鏈或者單鏈核酸作為引物。長度沒有特別的限制，但是優(yōu)選5到200個(gè)堿基，10到100個(gè)堿基更優(yōu)選。固定引物的方法沒有特別限制，例如可以采用以下方法將引物溶解于緩沖液中制成溶液，將本發(fā)明中的固體支持物浸入該溶液中，這樣引物就可以被固定到固體支持物的表面上。固定引物時(shí)，浸入溶液的溫度一般是0-98攝氏度，最好是4-50攝氏度；浸入時(shí)間一般是1分鐘到24小時(shí)，最好是10分鐘到1小時(shí)。在浸入到溶液中一段預(yù)定的時(shí)間之后，漂洗固體支持物，去掉不能被固定的引物。此外通過使用一種被稱為點(diǎn)樣儀的裝置，可以在固體支持物的表面固定多種不同的引物。在使用點(diǎn)樣儀將引物溶液點(diǎn)到固體支持物上之后，把固體支持物放到烘箱內(nèi)烘烤一段預(yù)定的時(shí)間，然后再進(jìn)行漂洗，去掉不能被固定的引物。通過使用點(diǎn)樣儀可以在固體支持物上的不同區(qū)域固定多種不同的引物，這樣就可以一次進(jìn)行大量的檢測分析。因此對于需要大量檢測分析的核酸檢測領(lǐng)域，點(diǎn)樣儀具有優(yōu)勢。
對于通常的固體支持物，有時(shí)在延伸反應(yīng)中，加熱處理會(huì)使引物脫離。而對于本發(fā)明中的固體支持物，即使加熱引物也不會(huì)脫離，可以在引物被固定到固體支持物表面的狀態(tài)下進(jìn)行延伸反應(yīng)。
在這個(gè)延伸反應(yīng)中，摻入標(biāo)記的核酸，在延伸反應(yīng)之后讀取標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)，就可以檢測出一個(gè)特異的DNA是否與引物雜交上，延伸反應(yīng)是否進(jìn)行了。因此可以確定在被檢測的樣品中是否含有能夠與在支持物表面固定的引物發(fā)生雜交的DNA。這在研究和醫(yī)療實(shí)踐中是一種有用的檢測手段。
對于標(biāo)記物沒有特別的限制，只要其能夠摻入到核酸分子中，例如熒光標(biāo)記(Cy染料如Cy3和Cy5，F(xiàn)ITC，RITC，羅達(dá)明、德克薩斯紅、TET、TAMRA、FAM、HEX、ROX等等)，放射性標(biāo)記(α-32P、γ-32P、35S等)等。如果使用熒光標(biāo)記核酸，可以在延伸反應(yīng)之后對固體支持物進(jìn)行熒光照相。
本發(fā)明的固體支持物可以在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中使用。如果用PCR擴(kuò)增DNA，首先將正向引物固定在固體支持物表面，然后雜交上單鏈或者雙鏈的DNA，再通過酶反應(yīng)使互補(bǔ)鏈DNA得以延伸。然后，通過連續(xù)進(jìn)行以下步驟(1)退火(2)雜交和(3)延伸，所謂的PCR反應(yīng)得以進(jìn)行。
在通常的固體支持物上，進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)的問題是由于熱處理使引物脫離，或者不能很好地進(jìn)行熱循環(huán)的控制。但是在本發(fā)明的固體支持物中，即使加熱引物也不會(huì)脫離。而且由于反應(yīng)不是在容器內(nèi)進(jìn)行，而是在DNA被固定到固體支持物上的狀態(tài)下進(jìn)行的，PCR反應(yīng)的溫度可以被準(zhǔn)確地控制，幾乎不可能影響到被擴(kuò)增核酸序列的準(zhǔn)確性，或者幾乎不可能復(fù)制非目標(biāo)DNA。因此DNA可以被有效擴(kuò)增。
通過上述PCR用本發(fā)明的固體支持物進(jìn)行DNA擴(kuò)增時(shí)，固體支持物的熱傳導(dǎo)率優(yōu)選≥0.1W/cm·K，較優(yōu)選≥0.5W/cm·K，最優(yōu)選≥1W/cm·K。理由是，如果固體支持物的熱傳導(dǎo)率高，在進(jìn)行PCR反應(yīng)或類似反應(yīng)時(shí)接下來的加熱和冷卻性質(zhì)也是良好的。
特別地，考慮到熱傳導(dǎo)率時(shí)，最優(yōu)選金剛石或者具有金剛石等物質(zhì)涂層的物質(zhì)作為表面處理薄層，用于許多不同基質(zhì)的表面。
此外將上述的用標(biāo)記核酸檢測與PCR擴(kuò)增相結(jié)合，即使在一個(gè)樣品中只有少量的DNA能夠與固定在固體支持物上的引物雜交時(shí)，DNA仍可以按照上述方式被復(fù)制。結(jié)果是，大量的DNA與固定在固體支持物上的引物雜交，互補(bǔ)鏈被延伸，從而提高了檢測的靈敏度。
或者，在選擇延伸反應(yīng)中使用的酶時(shí)，使用鏈取代DNA聚合酶并加入反向引物，這樣DNA可以在恒定的溫度下在固體支持物上被擴(kuò)增出來而不需要進(jìn)行熱循環(huán)。鏈取代DNA聚合酶是一種DNA合酶，在合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈的過程中，在延伸的方向中如果存在雙鏈DNA區(qū)域，它可以通過打開雙鏈區(qū)域連續(xù)地合成互補(bǔ)鏈。
對于鏈取代DNA聚合酶沒有特別的限制，例如可以包括BCA BESTDNA聚合酶(Takara Bio)，Phi29 DNA聚合酶(Amersham Bioscience)等等。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用從mRNA合成的cDNA作為目標(biāo)，使RNA也可以成為擴(kuò)增目標(biāo)，盡管它不是直接的目標(biāo)。
這時(shí)，使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從mRNA得到cDNA，而在得到cDNA時(shí)可以同時(shí)將其固定到固體支持物上。首先，將逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到固體支持物經(jīng)過化學(xué)修飾的區(qū)域上。一般使用寡聚dT引物，它與特異的核酸序列互補(bǔ)；或者使用隨機(jī)的六堿基引物。但是最好使用寡聚dT引物，其中含有大約10到20個(gè)連續(xù)的胸腺嘧啶，這與RNA 5′末端的poly(A)序列互補(bǔ)。
如果使用寡聚dT引物，將作為模板的RNA 5′末端的poly(A)區(qū)域退火。使用逆轉(zhuǎn)錄酶作用于該區(qū)域，與模板RNA互補(bǔ)的dNTP在引物的3′末端被一個(gè)接一個(gè)地聚合在一起，由此cDNA按照從5′到3′的方向被合成。在這個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，引物的結(jié)合、退火和在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下互補(bǔ)鏈的聚合可以按照一般的方法，用控制溫度(熱循環(huán))的方法進(jìn)行。
如上所述，在固體支持物上的固定可以與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，因此根據(jù)本發(fā)明的方法可以有效地進(jìn)行所謂的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)。因此本發(fā)明也可以用于對mRNA定量。
使用本發(fā)明的支持物將一個(gè)寡聚核苷酸的末端堿基通過氫鍵固定到末端羥基或者末端羧基上，進(jìn)一步再固定具有與該寡聚核苷酸互補(bǔ)堿基序列的DNA，得到的產(chǎn)物可以用作DNA文庫芯片。此外，通過固定核苷酸、寡聚核苷酸、DNA片段或者非DNA的類似物得到的產(chǎn)物可以用作文庫。
使用本發(fā)明中的固體支持物進(jìn)行以上描述的檢測，還可以進(jìn)行疾病的診斷。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例來闡述本發(fā)明，但是本發(fā)明并不止限于這些實(shí)施例。
〔例1〕在向基質(zhì)上添加表面處理薄層時(shí)，向小室內(nèi)引入含有氨基的化合物(1)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在載玻片(寬25毫米，長75毫米，厚1毫米)上通過離子化沉積形成10納米厚的DLC薄層，加速電壓是0.5千伏。然后使用甲烷作為載體氣體，通過15攝氏度保溫的二乙胺，以每分鐘5立方厘米的速率被引入小室。工作壓力為2帕，加速電壓是0.5千伏，使用甲烷和二乙胺作為原材料，形成厚度為10納米的含有碳、氮和氫的薄層。
之后，使多價(jià)羧酸——丁烷四羧酸酸酐與用甲烷和二乙胺作為原材料形成的厚度為10納米的含碳、氮和氫表面處理薄層中的氨基發(fā)生縮合后，將薄層浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)300毫升中30分鐘，使其活化。
然后用微陣列合成儀將大約1納升500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用濃度0.1微克/微升制備的lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)點(diǎn)在基質(zhì)上。之后將基質(zhì)在80攝氏度爐中烘烤3小時(shí)，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，測量被點(diǎn)樣DNA的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果熒光強(qiáng)度是36,050。在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后測量熒光強(qiáng)度是35,540，幾乎沒有減弱。
作為對照，將載玻片浸入含有2％(w/w)3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中10分鐘后取出，用乙醇漂洗，在110攝氏度干燥10分鐘。然后將引入氨基的該基質(zhì)與丁二酸酸酐縮合，將基質(zhì)浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6))中30分鐘。用同樣的方法將500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)固定在這樣得到的基質(zhì)上，用2×SSC/0.2％SDS漂洗基質(zhì)。結(jié)果熒光強(qiáng)度是23,500。在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后測量熒光強(qiáng)度是23,000，幾乎沒有減弱。
換言之，使用共價(jià)鍵類型的幾乎沒有靜電層的基質(zhì)，盡管可以通過共價(jià)鍵更加牢固地固定DNA，熒光信號(hào)地強(qiáng)度卻沒有增加。
而且，用同樣的方法將500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)固定在沒有靜電層的基質(zhì)上(載玻片上用5％聚丙烯酸水溶液處理玻片之后干燥，用紫外線輻射60分鐘使其不溶。然后浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6))中30分鐘進(jìn)行活化)，基質(zhì)用2×SSC/0.2％SDS漂洗。結(jié)果盡管聚丙烯酸層脫離，在薄層被保留區(qū)域熒光強(qiáng)度為26,220。在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗使聚丙烯酸層完全脫離。例2為基質(zhì)增加表面處理薄層時(shí)向小室內(nèi)引入含氨基化合物(2)向載玻片(寬25毫米，長75毫米，厚1毫米)上通過離子化沉積方法，使用甲烷作為載體氣體，通過15攝氏度保溫的二乙胺，以每分鐘5立方厘米的速率將其引入小室。工作壓力為2帕，加速電壓是0.5千伏，使用甲烷和二乙胺作為原材料，形成厚度為20納米的含有碳、氮和氫的薄層。
之后，將多價(jià)羧酸——聚丙烯酸，與由甲烷和二乙胺構(gòu)成的表面處理薄層中的氨基在0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺存在下發(fā)生縮合。然后浸入到活化溶液(300毫升，含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6))中30分鐘進(jìn)行活化。
然后，用微陣列合成儀將大約1納升500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用制備成濃度為0.1微克/微升的lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)點(diǎn)在基質(zhì)上。之后將基質(zhì)在80攝氏度爐中烘烤3小時(shí)，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，測量被點(diǎn)樣DNA的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果熒光強(qiáng)度是34,050。在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后測量熒光強(qiáng)度是33,500，幾乎沒有減弱。
作為對比用同樣的方法將500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)固定在商品化的靜電吸引類基質(zhì)(Matsunami Glass.，LTD.制造；是經(jīng)過氨基硅烷(一種硅烷偶聯(lián)試劑)處理的基質(zhì))上，用2×SSC/0.2％SDS漂洗。結(jié)果熒光強(qiáng)度是35,460。在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后測量熒光強(qiáng)度，減弱到26,210。
而且，用同樣的方法將500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)固定在沒有靜電層的基質(zhì)上(載玻片上用5％聚丙烯酸溶液處理之后干燥，用紫外線輻射60分鐘使其不溶。然后浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6))中30分鐘進(jìn)行活化)，基質(zhì)用2×SSC/0.2％SDS漂洗。結(jié)果盡管聚丙烯酸層脫離，在薄層被保留處熒光強(qiáng)度為26,220。而且，在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗使聚丙烯酸層完全脫離。
例3通過后處理形成靜電層使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在載玻片(寬25毫米，長75毫米，厚1毫米)上通過離子化沉積形成10納米厚的DLC薄層，加速電壓是0.5千伏。
然后，在氯氣中用紫外線照射對基質(zhì)進(jìn)行氯化。再將基質(zhì)浸入到聚丙烯酰氨溶液(0.1g/L)中形成靜電層。
之后，將多價(jià)羧酸——聚丙烯酸與靜電層中的氨基在0.1M1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺存在的條件下發(fā)生縮合后，將其浸入到300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘，使其活化。
然后，用微陣列合成儀將大約1納升500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用制備的濃度為0.1微克/微升的lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)點(diǎn)在基質(zhì)上。之后將基質(zhì)在80攝氏度爐中烘烤3小時(shí)，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，測量被點(diǎn)樣的DNA的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果熒光強(qiáng)度是35,000。在95攝氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后測量熒光強(qiáng)度是34,500，幾乎沒有減弱。
作為對比，用5％聚丙烯酸水溶液處理其上形成有10納米DLC薄層的載玻片并干燥后，用紫外線照射處理60分鐘使其不溶。然后浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6))中30分鐘進(jìn)行活化。用同樣的方法將500bp長的Cy3標(biāo)記的雙鏈DNA(使用lambdaDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增出來)固定在基質(zhì)上，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，聚丙烯酸薄層完全脫離。
例4使用浸漬法固定引物(1)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在切割成3毫米見方小塊的硅基質(zhì)上形成厚度為100納米的DLC薄層，加速電壓為0.5千伏。然后用氨氣氛代替甲烷和氫氣，并用等離子體方法進(jìn)行胺化作用10分鐘。
之后，將多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)與表面處理薄層中引入的氨基發(fā)生縮合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
之后，將固體支持物浸入到用無菌水制備的0.1微克/微升500bp的lambdaDNA的正向引物(22bp)溶液中，室溫浸漬1小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
已經(jīng)固定有正向引物的固體支持物浸入到500bplambdaDNA溶液中(該DNA與固定的引物互補(bǔ)，濃度為0.025微克/微升，緩沖液為5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98攝氏度保溫5分鐘后，再在42攝氏度保溫12小時(shí)。反應(yīng)之后用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
雜交之后的固體支持物浸入到反應(yīng)溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，并在42攝氏度保溫6小時(shí)。反應(yīng)之后用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到了延伸反應(yīng)的熒光信號(hào)。
例5用點(diǎn)樣法固定引物(1)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在切割成3毫米見方小塊的硅基質(zhì)上形成厚度為100納米的DLC薄層，加速電壓為0.5千伏。然后用氨氣氛代替甲烷和氫氣，并用等離子體方法進(jìn)行胺化作用10分鐘。
之后，將多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)與表面處理薄層中引入的氨基發(fā)生縮合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
然后，使用點(diǎn)樣儀，將用20％DMSO制備的0.1微克/微升的500bp的lambdaDNA正向引物(22bp，10個(gè)樣品)溶液點(diǎn)到固體支持物上。在80攝氏度爐中烘烤1小時(shí)之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
將已經(jīng)固定有正向引物的固體支持物浸入到500bp單鏈lambdaDNA溶液中(該DNA與固定的引物互補(bǔ)，濃度為0.025微克/微升，緩沖液為5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98攝氏度保溫5分鐘后，再在42攝氏度保溫12小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
雜交之后將固體支持物浸入到反應(yīng)溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，在42攝氏度保溫6小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到了延伸反應(yīng)的熒光信號(hào)。
例6用點(diǎn)樣法固定引物(2)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在載玻片(寬25毫米，長75毫米，厚1毫米)上通過離子化沉積形成10納米厚的DLC薄層，加速電壓是0.5千伏。然后用氨氣氛代替甲烷和氫氣，并用等離子體方法進(jìn)行胺化作用10分鐘。
之后，將多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)與表面處理薄層中引入的氨基發(fā)生縮合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
然后使用點(diǎn)樣儀，將用20％DMSO制備的濃度0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp，10個(gè)樣品)溶液點(diǎn)到固體支持物上。在80攝氏度爐中烘烤1小時(shí)之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
向固體支持物表面加15微升與被固定的引物互補(bǔ)的500bplambdaDNA溶液(DNA濃度為0.025微克/微升，緩沖液為5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)，用蓋玻片蓋上。在42攝氏度保溫5小時(shí)，進(jìn)行雜交反應(yīng)。之后用0.1×SSC洗去蓋玻片，固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
雜交之后在固體支持物表面加15微升反應(yīng)溶液(1×Exbuffer/0.025mM Cy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)，用蓋玻片蓋上。在42攝氏度保溫5小時(shí)，進(jìn)行延伸反應(yīng)。之后用0.1×SSC洗去蓋玻片，固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到了延伸反應(yīng)的熒光信號(hào)。
例7退火、雜交和延伸反應(yīng)(1)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在切割成3毫米見方小塊的硅基質(zhì)上形成厚度為100納米的DLC薄層，加速電壓為0.5千伏。然后用氨氣氛代替甲烷和氫氣，并用等離子體方法進(jìn)行胺化作用10分鐘。
之后，使用多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)與表面處理薄層中引入的氨基發(fā)生縮合，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
然后使用點(diǎn)樣儀，將用20％DMSO制備的0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp，10個(gè)樣品)溶液點(diǎn)到固體支持物上。80攝氏度烘烤1小時(shí)之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
在反應(yīng)溶液(1×Exbuffer/0.025mM Cy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中加入與其中一個(gè)被固定的引物互補(bǔ)的500bplambdaDNA，使其終濃度為0.025微克/微升。
將反應(yīng)溶液置于一個(gè)PCR小管內(nèi)，并加入一個(gè)反向引物。將固定了所述引物的固體支持物浸入到反應(yīng)溶液中，并進(jìn)行30次下面的循環(huán)退火(94攝氏度1分鐘)、雜交(60攝氏度1分鐘)和延伸(72攝氏度1分鐘)。反應(yīng)之后，固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到的熒光信號(hào)比在恒定溫度下進(jìn)行反應(yīng)檢測到的更強(qiáng)。
進(jìn)一步，將已經(jīng)進(jìn)行過延伸反應(yīng)的固體支持物置于PCR反應(yīng)溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增500bp的lambda DNA，用電泳證實(shí)500bp區(qū)域被擴(kuò)增出來。
例8使用鏈取代DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在切割成3毫米見方小塊的硅基質(zhì)上形成厚度為100納米的DLC薄層，加速電壓為0.5千伏。然后用氨氣氛代替甲烷和氫氣，并用等離子體方法進(jìn)行10分鐘胺化作用。
之后，將多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)與表面處理薄層中引入的氨基發(fā)生縮合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
然后，使用點(diǎn)樣儀將用20％DMSO制備的0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp，10個(gè)樣品)溶液點(diǎn)到固體支持物上。在80攝氏度爐中烘烤1小時(shí)之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
已經(jīng)固定所述引物的固體支持物浸入到500bp的lambdaDNA溶液中(該DNA與固定的引物互補(bǔ)，濃度為0.025微克/微升，緩沖液為5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98攝氏度保溫5分鐘后，再在42攝氏度保溫12小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
雜交之后固體支持物浸入到已經(jīng)加入了反向引物的反應(yīng)溶液(BcaBEST DNA聚合酶/20mM Tris/10mM氯化鎂)中，在60攝氏度保溫6小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。這里使用的酶是鏈取代DNA聚合酶(Takara制造)。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到了延伸反應(yīng)的熒光信號(hào)。
進(jìn)一步將已經(jīng)進(jìn)行過延伸反應(yīng)的固體支持物置于PCR反應(yīng)溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增500bp lambdaDNA，并用電泳證實(shí)500bp區(qū)域被擴(kuò)增出來。
例9退火、雜交和延伸反應(yīng)(2)使用95％甲烷和5％氫氣(體積比)的混和氣體作為原材料，在切割成3毫米見方小塊的硅基質(zhì)上形成厚度為100納米的DLC薄層，加速電壓為0.5千伏。然后用氨氣氛代替甲烷和氫氣，用等離子體方法進(jìn)行10分鐘胺化作用。
之后，將多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)，與表面處理薄層中引入的氨基發(fā)生縮合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
然后，使用點(diǎn)樣儀將用20％DMSO中的0.1微克/微升正向引物(5′-GATGAGTTGTGTCCGTACAACT-3′，參見序列表中的第一個(gè)序列，22bp)溶液、0.1微克/微升正向引物(5′-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3′，參見序列表中的第二個(gè)序列，20％DMSO)溶液和0.05微克/微升正向引物+反向引物溶液(20％DMSO)點(diǎn)在固體支持物上。然后在80攝氏度爐中烘烤1小時(shí)之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
將反應(yīng)溶液1(0.025微克/微升lambdaDNA/1皮摩爾/微升反向引物/1×Exbuffer/0.025mM Cy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)加入到PCR小管中，并將固定有引物的固體支持物浸入到反應(yīng)溶液中，進(jìn)行30次下面的循環(huán)退火(94攝氏度30秒)、雜交和延伸(68攝氏度30秒)。反應(yīng)之后，固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到的熒光信號(hào)比在恒定溫度下進(jìn)行反應(yīng)檢測到的更強(qiáng)。
進(jìn)一步將已經(jīng)進(jìn)行過延伸反應(yīng)的固體支持物置于反應(yīng)溶液2(1皮摩爾/微升正向引物/1皮摩爾/微升反向引物/1×Exbuffer/1.25mMdNTP/0.25U ExTaq)中，進(jìn)行30次下面的循環(huán)退火(94攝氏度30秒)、雜交和延伸(68攝氏度30秒)。電泳證實(shí)500bp區(qū)域的DNA片段被擴(kuò)增出來。
例10通過浸漬法固定引物(2)將切割成3毫米見方的載玻片浸入到調(diào)至0.1％的聚丙烯酰胺水溶液中之后，使多價(jià)羧酸(聚丙烯酸)與基質(zhì)表面中引入的氨基發(fā)生縮合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺和20mM的N-羥基丁二酰亞胺的0.1M磷酸緩沖液(pH6)中30分鐘進(jìn)行活化。
然后將固體支持物浸入到用無菌水制備的濃度為0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp)溶液中，在室溫下進(jìn)行固定反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
已經(jīng)固定有正向引物的固體支持物浸入到500bp lambdaDNA溶液中(該DNA與固定的引物互補(bǔ)，濃度為0.025微克/微升，緩沖液為5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98攝氏度保溫5分鐘后，再在42攝氏度保溫12小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
雜交后的固體支持物浸入反應(yīng)溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，在42攝氏度保溫6小時(shí)。反應(yīng)之后固體支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察固體支持物，檢測到了延伸反應(yīng)的熒光信號(hào)。
比較實(shí)施例切割成3毫米見方的玻璃基質(zhì)浸入到調(diào)至4％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液(有95％的乙醇)。在100攝氏度爐中烘烤20分鐘使表面胺化。
然后，將基質(zhì)浸入到用無菌水制備的濃度為0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp)溶液中室溫作用1小時(shí)，通過靜電結(jié)合進(jìn)行固定反應(yīng)。反應(yīng)之后用基質(zhì)洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。此外再制備一個(gè)基質(zhì)，其浸入到熒光標(biāo)記的該500bp的lambdaDNA的正向引物(22bp)溶液中。
已經(jīng)固定有正向引物的基質(zhì)浸入到500bplambdaDNA溶液中(該DNA與固定的引物互補(bǔ)，濃度為0.025微克/微升，緩沖液為5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98攝氏度保溫5分鐘后，再在42攝氏度保溫12小時(shí)。反應(yīng)之后基質(zhì)用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
雜交后的基質(zhì)浸入反應(yīng)溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，在42攝氏度保溫6小時(shí)。反應(yīng)之后基質(zhì)用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗兩遍，再用無菌水潤洗。
漂洗之后用熒光成像掃描儀觀察基質(zhì)，完全不能檢測到延伸反應(yīng)的熒光信號(hào)。
至于已經(jīng)固定有由熒光標(biāo)記的500bp的lambdaDNA的正向引物(22bp)的基質(zhì)，盡管在固定反應(yīng)之后可以觀察到微弱的熒光信號(hào)，但是在同樣的步驟進(jìn)行完以后，用熒光成像觀察時(shí)根本不能檢測到熒光信號(hào)。這表明在基質(zhì)上固定的引物在試驗(yàn)過程中已經(jīng)脫離。
使用熒光成像掃描儀測量的前述例4到例10中的熒光強(qiáng)度歸納于表1。
表1例4到例10中的熒光信號(hào)強(qiáng)度

工業(yè)可應(yīng)用性與傳統(tǒng)的固體支持物相比，在本發(fā)明的固體支持物上可以固定更大量的核酸分子，而且核酸可以通過共價(jià)鍵被牢固地固定。因此，曾經(jīng)是傳統(tǒng)DNA陣列問題的檢測靈敏度和可信度可被改進(jìn)。而且，由于延伸反應(yīng)可以在核酸分子已經(jīng)被固定時(shí)進(jìn)行，或者核酸分子可以通過PCR反應(yīng)被擴(kuò)增，所以使DNA陣列很有可能被推廣。
序列表<110>Toyo Kohan Co.，Ltd.
<120>具有靜電層的固體支持物及其用途<130>2037PCT<150>JP2002-207886<151>2002-07-17<150>JP2002-275797<151>2002-09-20<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1gatgagttgt gtccgtacaa ct22<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 2權(quán)利要求
1.固體支持物，該支持物在基質(zhì)上具有用于靜電吸引核酸分子的靜電層和能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的固體支持物，其基質(zhì)的表面用至少一種選自金剛石、軟金剛石、含碳物質(zhì)和碳化物的物質(zhì)進(jìn)行表面處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的固體支持物，其靜電層含有不與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的含氨基化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的固體支持物，其靜電層由與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的含氨基化合物組成，并且該含氨基化合物在其不與基質(zhì)結(jié)合的末端有氨基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的固體支持物，該支持物是這樣得到的將含未取代氨基或者單取代氨基的化合物和碳化合物沉積在基質(zhì)上，并且再引入能夠與核酸分子共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的固體支持物，該支持物是這樣得到的將基質(zhì)浸入到含未取代氨基或者單取代氨基的化合物的溶液中，并且再引入能夠與核酸分子共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的固體支持物，其中含未取代氨基或者單取代氨基的化合物是聚丙烯酰胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的固體支持物，其中的核酸分子是DNA。
9.固定化的核酸分子，其含有固定在根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的固體支持物上的核酸分子。
10.生產(chǎn)固體支持物的方法，其特征在于將含未取代氨基或者單取代氨基的化合物和碳化合物沉積在基質(zhì)上，并且再引入能夠與核酸分子共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。
11.生產(chǎn)固體支持物的方法，其特征在于將基質(zhì)浸入到含未取代氨基或者單取代氨基的化合物的溶液中，并且再引入能夠與核酸分子共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。
12.下述方法，在根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的固體支持物上固定引物，使核酸分子與引物雜交，由此使與該核酸分子互補(bǔ)的核酸分子延伸。
13.檢測核酸分子的方法，它包括以下步驟將引物固定在根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的固體支持物上，使核酸分子與引物雜交，在標(biāo)記的核酸存在下使與該核酸分子互補(bǔ)的核酸分子延伸，并且讀取由整合入互補(bǔ)核酸分子中的標(biāo)記核酸產(chǎn)生的信號(hào)。
14.擴(kuò)增核酸分子的方法，包括將引物固定在根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的固體支持物上，使核酸分子與引物雜交，然后對核酸分子進(jìn)行PCR反應(yīng)。
15.擴(kuò)增DNA的方法，包括將引物固定在根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的固體支持物上，使核酸分子與引物雜交，然后使用鏈取代DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，它還包括在核酸分子與引物雜交之后擴(kuò)增核酸分子的步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供能夠固定大量核酸分子的固體支持物，核酸分子與之結(jié)合具有高的鍵強(qiáng)。該固體支持物含有基質(zhì)，以及在基質(zhì)上提供的用于靜電吸引核酸分子的靜電層和能夠共價(jià)結(jié)合核酸分子的功能基團(tuán)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1668742SQ0381695
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月17日
發(fā)明者岡村浩, 丹花通文, 山野博文, 大場光芳, 龜井修一, 市原輝久 申請人:東洋鋼鈑株式會(huì)社