專利名稱：人抗cd20抗體的測定法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測針對抗體或拮抗劑的中和型抗體的測定法，以及所述測定法的用途。
背景技術(shù)：
淋巴細胞是骨髓造血過程中產(chǎn)生的多種白細胞的一種。存在兩種重要的淋巴細胞群B淋巴細胞(B細胞)和T淋巴細胞(T細胞)。這里對淋巴細胞中的B細胞尤其有興趣。
B細胞在骨髓中成熟，離開骨髓時在其細胞表面表達與抗原結(jié)合的抗體。當天然B細胞首次與其膜結(jié)合抗體特異的抗原相遇時，細胞開始迅速分裂，其子代分化成記憶B細胞和稱為“漿細胞”的效應(yīng)細胞。記憶B細胞壽命很長，并繼續(xù)表達與其原始親代細胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細胞不產(chǎn)生膜結(jié)合抗體，而代之產(chǎn)生可分泌型的抗體，可分泌的抗體是體液免疫的重要效應(yīng)分子。
CD20抗原(也稱為人B淋巴細胞限制性分化抗原Bp35)是前B細胞和成熟B淋巴細胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大約35kD(Valentine等生物學(xué)化學(xué)雜志264(19)11282-11287(1989)；和Einfeld等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志7(3)711-717(1988))。該抗原也在大于90％的B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(Anderson等，血液63(6)1424-1433(1984))，但在造血干細胞，原B細胞，正常漿細胞或其它正常組織中未發(fā)現(xiàn)(Tedder等，免疫學(xué)雜志135(2)973-979，1985)。CD20在細胞周期啟動和分化的活化過程早期階段起調(diào)節(jié)作用(Tedder等，同上)，并可能發(fā)揮鈣離子通道的功能。(Tedder等，細胞生物學(xué)雜志14D195(1990))
由于CD20在B細胞淋巴瘤中表達，這一抗原可作為用于“靶向”這類淋巴瘤的候選者。實質(zhì)上，這種靶向可如下歸納給予患者B細胞表面抗原CD20的特異性抗體。這些抗CD20抗體與正常和惡性B細胞(表面的)CD20抗原特異結(jié)合；與表面抗原CD20結(jié)合的抗體可引起腫瘤性B細胞的破壞和耗竭。此外，具有破壞腫瘤潛力的化學(xué)制劑或放射活性標記能與抗CD20抗體偶聯(lián)，從而將所述制劑特異性“運送”至腫瘤性B細胞。不管用什么方法，一個主要目的是破壞腫瘤；可根據(jù)所使用的具體抗CD20抗體確定具體方法，因此，靶向CD20抗原的現(xiàn)有方法很多。
CD19是B細胞系細胞表面表達的另一種抗原。象CD20一樣，發(fā)現(xiàn)CD19在從干細胞階段到快要最終分化為漿細胞之前的整個分化過程中均位于細胞上(Nadler，L.淋巴細胞分型II23-37和Appendix，Renling等，編(1986)Spring Verlag出版)。然而與CD20不同，與CD19結(jié)合的抗體引起CD19抗原的內(nèi)在化。在多種抗體中使用HD237-CD19抗體(也稱為B4抗體)可鑒定CD19抗原(Kiesel等，白血病研究II，121119(1987))。CD19抗原存在于4-8％的外周血單個核細胞及大于90％的分離自外周血，脾臟，淋巴結(jié)或扁桃體的B細胞。在外周血T細胞，單核細胞或粒細胞中未檢出CD19。實際上，所有的非T細胞急性淋巴母細胞白血病(ALL)，B細胞慢性淋巴細胞白血病(CLL)和B細胞淋巴瘤均表達可被B4抗體檢測的CD19(Nadler等，免疫學(xué)雜志131244(1983)；和Nadler等，血液學(xué)進展，Vol.XIIpp.187-206.Brown，E.編(1981)Grune&Stratton公司出版)。
由B細胞系的細胞所表達的能識別分化階段特異性抗原的其它抗體已得到鑒定。其中有抗CD21抗原的B2抗體；抗CD22抗原的B3抗體；抗CD10抗原的J5抗體(也稱為CALLA)。見1997年1月21日授權(quán)的美國專利5,595,721號(Kaminski等)。
美羅華(RITUXAN)抗體是一種遺傳工程化鼠/人嵌合單克隆抗CD20抗體。美羅華在1998年4月7日授權(quán)的美國專利5,736,137號(Anderson等)中稱為“C2B8”的抗體。RITUXAN被指示用于治療復(fù)發(fā)或難治的低級或濾泡性CD20陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤。在體外對作用機制的研究顯示RITUXAN與人補體結(jié)合，并通過補體依賴性細胞毒作用(CDC)裂解淋巴樣B細胞系(Reff等，血液83(2)435-445(1994))。此外，在抗體依賴的細胞性細胞毒作用(ADCC)試驗中有顯著活性。最近，RITUXAN在氚標胸腺嘧啶摻入實驗中顯示抗增殖效應(yīng)并直接誘導(dǎo)凋亡，而其它抗CD19和抗CD20的抗體則不能(Maloney等，血液88(10)637a(1996))。在實驗中觀察到RITUXAN與化療和毒素有協(xié)同作用。尤其是RITUXAN使耐藥性人B細胞淋巴瘤細胞系對阿霉素，CDDP，VP-16，白喉毒素和蓖麻毒蛋白的細胞毒效應(yīng)敏感(Demidem等，癌癥化療及放射性藥物(Cancer Chemotherapy &Radiopharmaceuticals)12(3)177-186(1997))。體內(nèi)臨床前研究顯示RITUXIMAB耗竭來源于彌猴(cynomolgus)外周血，淋巴結(jié)和骨髓的B細胞，推測是通過補體和細胞介導(dǎo)的過程(Reff等，血液83(2)435-445(1994))。
涉及CD20抗體的專利以及專利出版物包括美國專利5,776,456，5,736,137，6,399,061，和5,843,439，以及美國專利申請US 2002/0197255A1和US 2003/0021781A1(Anderson et al.)；美國專利6,455,043B1和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO00/27428(Grillo-Lopez and White)；WO00/27433(Grillo-Lopez and Leonard)；WO00/44788(Braslawsky et al.)；WO01/10462(Rastetter，W.)；WO01/10461(Rastetter and White)；WO01/10460(White and Grillo-Lopez)；美國專利申請US2002/0006404和WO02/04021(Hanna and Hariharan)；美國專利申請US2002/0012665 A1和WO01/74388(Hanna，N.)；美國專利申請US2002/0009444A1，和WO01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO01/97858(White，C.)；美國專利申請US2002/0128488A1和WO02/34790(Reff，M.)；WO02/060955(Braslawsky etal.)；WO2/096948(Braslawsky et al.)；WO02/079255(Reff and Davies)；美國專利6,171,586B1，和WO98/56418(Lam et al.)；WO98/58964(Raju，S.)；WO99/22764(Raju，S.)；WO99/51642，美國專利6,194,551B1，美國專利6,242,195B1，美國專利6,528,624B1 and美國專利6,538,124(Idusogie et al.)；WO00/42072(Presta，L.)；WO00/67796(Curd et al.)；WO01/03734(Grillo-Lopez et al.)；美國專利申請US 2002/0004587A1和WO01/77342(Miller and Presta)；美國專利申請US2002/0197256(Grewal，I.)；美國專利6,090,365B1，6,287,537B1，6,015,542，5,843,398，和5,595,721，(Kaminski etal.)；美國專利5,500,362，5,677,180，5,721,108，和6,120,767(Robinson et al.)；美國專利6,410,391B1(Raubitschek et al.)；美國專利6,224,866B1和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO00/67795(Goldenberg)；WO00/74718(Goldenberg and Hansen)；WO00/76542(Golay et al.)；WO01/72333(Wolin and Rosenblatt)；美國專利6,368,596B1(Ghetie et al.)；美國專利申請US2002/0041847A1，(Goldenberg，D.)；美國專利申請US2003/0026801A1(Weiner and Hartmann)；WO02/102312(Engleman，E.)，每篇文獻均包含在本文作為參考。也參見，美國專利5,849,898和EP申請330,191(Seed et al.)；美國專利4,861,579和EP332,865A2(Meyer and Weiss)；和WO95/03770(Bhat et al.)。
涉及美羅華的公開出版物包括Perotta and Abuel“Response of chronicrelapsing ITP of 10 years duration to Rituximab”Abstract #3360 Blood10(1)(part 1-2)p.88B(1998)；Stashi et al.“Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathicthrombocytopenic purpura”Blood 98(4)952-957(2001)；Matthews，R.“MedicalHeretics”New Scientist(7 April，2001)；Leandro et al.“Clinical outcome in 22patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion”AnnRheum Dis 61833-888(2002)；Leandro et al.“Lymphocyte depletion inrheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and dose response.Arthritis and Rheumatism 44(9)S370(2001)；Leandro et al.“An open study ofB lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthritis &Rheumatisn 46(1)2673-2677(2002)；Edwards and Cambridge“Sustainedimprovement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete Blymphocytes”Rhematology 40205-211(2001)；Edwards et al.“B-lymphocytedepletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders”Biochem.Soc.Trans.30(4)824-828(2002)；Edwards et al.“Efficacy and safetyof Rituximab，a B-cell targeted chimeric monoclonal antibodyA randomized，placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis andRheumatism 46(9)S197(2002)；Levine and Pestronk“IgM antibody-relatedpolyneuropathiesB-cell depletion chemotherapy using Rituximab”Neurology521701-1704(1999)；DeVita et al.“Efficacy of selective B cell blockade in thetreatment of rheumatoid arthritis”Arthritis & Rheum 462029-2033(2002)；Hidashida et al.“Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis withrituximab.”Presented at the Annual Scientific Meeting of the American Collegeof Rheumatology；Oct 24-29；Ne Orleans，LA 2002；Tuscano，J.“Successfultreatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab”Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology；Oct 24-29；New Orleans，LA 2002。
美國專利申請2003/0068664(Albitar et al.)描述了ELISA測定法，用于測定針對美羅華的人抗嵌合抗體(HACA)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實施例1描述了對于補體依賴性細胞毒(CDC)試驗的開發(fā)，其用于檢測針對結(jié)合B細胞表面標記即CD20抗原的中和型抗體。所述CDC活性通過將CD20陽性細胞與人補體在缺乏或存在不同濃度的CD20抗體的條件下進行測定。細胞毒通過定量存活細胞測定。檢測對試驗效果的血清基質(zhì)效應(yīng)。血清可達40％而不產(chǎn)生明顯的EC50值改變。具有抗體反應(yīng)(HACA)的CD20抗體治療的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血清樣品隨后得以檢測。CD20抗體的CDC活性可被HACA血清完全或部分阻斷，表明被處理的樣品中的中和活性。相比而言，在CD20抗體處理以前獲得的血清樣品沒有顯示中和活性。該測定法的特征在于任何抗藥物抗體反應(yīng)的性質(zhì)；因此其對于評估藥物安全性和有效性是有價值的。
因此，本發(fā)明提供了用于評估結(jié)合CD20的抗體的效力的方法，包括測定獲自用CD20抗體處理患者的生物樣品阻斷CD20抗體的生物活性的能力。
本發(fā)明還提供了免疫治療的方法，包括將結(jié)合CD20的抗體給藥患者；并測定來自患者的生物樣品阻斷CD20抗體的生物活性的能力。
另一方面，本發(fā)明涉及檢測針對治療性抗體的中和型抗體的方法，包括將表達表達結(jié)合治療性抗體的抗原的細胞暴露于補體，所述暴露的條件是存在治療性抗體以及來自用該抗體治療的患者的生物樣品；和測定所述治療性抗體的補體依賴性細胞毒(CDC)活性，其中CDC活性的降低表明所述生物樣品中存在中和型抗體。
此外，提供評估結(jié)合B細胞表面標記的拮抗劑的效力的方法，包括檢測來自用所述拮抗劑處理的患者的生物樣品阻斷所述拮抗劑的生物活性的能力。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及免疫治療方法，包括將結(jié)合B細胞表面標記的抗體給予患者；和測定患者的生物樣品阻斷抗體的生物活性的能力。
優(yōu)選實施方案詳述I.定義除非另有說明，本發(fā)明的“生物樣品“指獲自本發(fā)明所述患者的樣品。所述樣品可包括結(jié)合用于治療患者的抗體和藥物的抗體，諸如人抗鼠抗體(HAMA)，人抗嵌合抗體(HACA)和人抗人抗體(HAHA)。生物樣品可為例如血清，收獲自患者的抗體，血漿，細胞裂解物，乳汁，唾液和其它分泌物，但優(yōu)選血清。
術(shù)語“生物活性”指本文所述抗體或拮抗劑的可測定的功能。涉及各種活性并且包括，但不限于，補體依賴性細胞毒(CDC)，抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(ADCC)，凋亡，抑制細胞(例如腫瘤細胞)生長，等。
生物樣品(或患者針對目的藥物產(chǎn)生的抗體)“阻斷”拮抗劑或抗體的生物活性的能力指部分以及完全阻斷所述活性。
本文中“B細胞表面標志”是一種表達于B細胞表面的抗原，可作為與之結(jié)合的拮抗劑或抗體的靶。B細胞表面標志有CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD40，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白細胞表面標志。有特別興趣的B細胞表面標志是優(yōu)先表達在B細胞表面而不是其它非B細胞組織表面，并且在前B細胞和成熟B細胞上都可表達的一種標志。在一個具體實施方案中，所述標志，如CD19或CD20，是在B細胞系由干細胞階段到最終分化至漿細胞之前的整個階段在B細胞上發(fā)現(xiàn)的一種標志。這里優(yōu)先的B細胞表面標志是CD20。
“CD20”抗原是在90％以上來自外周血或淋巴器官的B細胞表面發(fā)現(xiàn)的一種～35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B細胞發(fā)育階段表達，并保持到漿細胞分化。CD20在正常B細胞和惡性B細胞上均可發(fā)現(xiàn)。文獻中CD20亦稱為“B淋巴細胞限制性抗原”或“Bp35”。例如CD20抗原在Clark等，PNAS(USA)821766(1985)中被描述。
本文術(shù)語″B細胞消耗″指藥物或抗體治療后動物或人中B細胞水平與治療前的水平相比而言降低。B細胞水平可利用已知的技術(shù)測定，諸如Reffet al.，Blood 83435-445(1994)，或美國專利5,736,137(Anderson et al.)中所述的技術(shù)。例如，哺乳動物(例如正常靈長類)可利用各種劑量的抗體或拮抗劑治療，并可測定外周B細胞濃度，例如通過計數(shù)B細胞的FACS方法。。
“B細胞惡性疾病”是涉及B細胞的惡性疾病。實例包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)，包括淋巴細胞優(yōu)勢型霍奇金病(lymphocytepredominant Hodgkin’s disease)(LPHD)；非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)(NHL)；濾泡中心細胞淋巴瘤(follicular center cell(FCC)lymphoma)；急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia(ALL))；慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia(CLL))；毛細胞白血病(hairycell leukemia)；漿細胞樣淋巴細胞淋巴瘤(plasmacytoid lymphocyticlymphoma)；套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)；AIDS和HIV-相關(guān)的淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(central nervoussystem(CNS)lymphoma)；移植后淋巴增生性疾病(post-transplantlymphoproliferative disorder)(PTLD)；Waldenstrom′s巨球蛋白血癥(macroglobulinemia)(淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma))；粘膜相關(guān)的淋巴樣組織淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue(MALT)lymphoma)；以及邊緣區(qū)淋巴瘤/白血病(marginal zone lymphoma/leukemia)。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括，但不限于低級/濾泡(low grade/follicularNHL)，復(fù)發(fā)型和難治性(relapsed or refractory)NHL，前線低級(front line lowgrade)NHL，III/IV期NHL，化療抗性(chemotherapy resistant)NHL，小淋巴細胞性(small lymphocytic)(SL)NHL，中間級/濾泡(intermediategrade/follicular)NHL，中間級彌漫型(intermediate grade diffuse)NHL，彌漫型大細胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma)，進展性(aggressive)NHL(包括進展性前線NHL和進展性復(fù)發(fā)型NHL)，自體干細胞移植后的NHL復(fù)發(fā)或自體干細胞移植難治性NHL(relapsing after or refractory to autologousstem cell transplantation)，高級免疫母細胞性(high grade immunoblastic)NHL，高級淋巴母細胞性(high grade lymphoblastic)NHL，高級小非凹陷的細胞(high grade small non-cleaved cell)NHL，bulky病NHL等。
“自身免疫病”在本文中是指因個體的自身組織引起并且針對自身組織的疾病。自身免疫病的實例包括但不限于，關(guān)節(jié)炎(arthritis)(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)，幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(juvenile rheumatoid arthritis)，骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)，銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis)，銀屑病(psoriasis)，皮炎(dermatitis)，多肌炎(polymyositis)/皮肌炎(dermatomyositis)，中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis)，系統(tǒng)性硬皮病和系統(tǒng)性硬化(systemic scleroderma and sclerosis)，與炎性腸疾病有關(guān)的反應(yīng)(responsesassociated with inflammatory bowel disease)，克隆氏病(Crohn′s disease)，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)，呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome)，成人呼吸窘迫綜合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)，腦膜炎(meningitis)，腦炎(encephalitis)，葡萄膜炎(uveitis)，結(jié)腸炎(colitis)，腎小球腎炎(glomerulonephritis)，變態(tài)反應(yīng)疾病(allergic conditions)，濕疹(eczema)，哮喘(asthma)，與T細胞浸潤和慢性炎癥性應(yīng)答有關(guān)的情況(conditionsinvolving infiltration of T cells and chronic inflammatory responses)，動脈粥樣硬化(atherosclerosis)，自身免疫性心肌炎(autoimmune myocarditis)，白細胞粘附缺陷(leukocyte adhesion deficiency)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuserythematosus，SLE)，幼年型糖尿病(juvenile onset diabetes)，多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)，變應(yīng)性腦脊髓炎(allergic encephalomyelitis)，與細胞因子和T細胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)相伴的免疫應(yīng)答(immune responsesassociated with acute and delayed hypersensitivity mediated by cytokines andT-lymphocytes)，結(jié)核(tuberculosis)，結(jié)節(jié)病(sarcoidosis)，肉芽腫病(granulomatosis)包括韋格納肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)，粒細胞缺乏(agranulocytosis)，脈管炎(vasculitis)(包括ANCA)，再生障礙性貧血(aplastic anemia)，戴-布貧血(Diamond Blackfan anemia)，免疫溶血性貧血(immune hemolytic anemia)包括自身免疫溶血性貧血(autoimmune hemolyticanemia，AIHA)，惡性貧血(pernicious anemia)，純紅細胞再生障礙(pure redcell aplasia，PRCA)，因子VIII缺陷(Factor VIII deficiency)，血友病A(hemophilia A)，自身免疫性中性粒細胞減少癥(autoimmune neutropenia)，全血細胞減少癥(pancytopenia)，白細胞減少(leucopenia)，與白細胞滲出有關(guān)的疾病(diseases involving leukocyte diapedesis)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病，多器官損傷綜合征(multiple organ injury syndrome)，重癥肌無力(mysathenia gravis)，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗-腎小球基底膜疾病(抗-glomerular basement membrane disease)，抗磷脂抗體綜合征(anti-phospholipid antibody syndrome)，變態(tài)反應(yīng)性神經(jīng)炎(allergic neuritis)，白塞疾病，Castleman綜合征，Goodpasture綜合征，蘭-伊肌無力綜合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)，雷諾綜合征，干燥綜合征(Sjorgen′ssyndrome)，斯-約綜合征(Stevens-Johnson syndrome)，實體器官移植排斥(solid organ transplant rejection)，移植物抗宿主疾病(graft versus host disease，GVHD)，天皰瘡樣大皰(pemphigoid bullous)，天皰瘡(pemphigus)，自身免疫性多內(nèi)分泌腺病(autoimmune polyendocrinopathies)，賴特爾病(Reiter′sdisease)，僵人綜合征(stiff-man syndrome)，巨細胞動脈炎(giant cell arteritis)，免疫復(fù)合物腎炎(immune complex nephritis)，IgA腎病(nephropathy)，IgM多發(fā)性神經(jīng)病(polyneuropathies)或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，特發(fā)性血小板減少性紫癲(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)，包括氟達拉濱相關(guān)的ITP，血栓性血小板減少性紫癲(thrombotic throbocytopenic purpura，TTP)，自身免疫性血小板減少(autoimmune thrombocytopenia)，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎(including autoimune orchitis and oophoritis)，原發(fā)性甲狀腺功能減退(primary hypothyroidism)；自身免疫性內(nèi)分泌病包括自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis)，慢性甲狀腺炎(chronic thyroiditis)(橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis))，亞急性淋巴細胞性甲狀腺炎(subacute thyroiditis)，特發(fā)性甲狀腺功能減退(idiopathic hypothyroidism)，艾迪生病(Addison’s disease)，格雷夫斯病(Grave′s disease)，自身免疫性多腺體綜合征(autoimmune polyglandular syndromes)或多腺體內(nèi)分泌病綜合征(polyglandular endocrinopathy syndromes)，I型糖尿病也稱胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和希恩綜合征(Sheehan’s syndrome)；自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis)，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(lymphoid interstitial pneumonitis)(HIV)，閉塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans)(非-移植型(non-transplant))相對于NSIP，吉-巴綜合征(Guillain-Barre’syndrome)，大血管血管炎(large vesselvasculitis)(包括風(fēng)濕性多肌痛(polymyalgia rheumatica)和巨細胞(Takayasu’s)動脈炎)，中血管血管炎(medium vessel vasculitis)(包括川崎病(Kawasaki’sdisease)和結(jié)節(jié)性多動脈炎(polyarteritis nodosa))，強直性脊椎炎(ankylosingspondylitis)，貝格爾病(Berger’s disease)(IgA腎病)，急進性腎小球腎炎(rapidly progressive glomerulonephritis)，原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliarycirrhosis)，乳糜瀉(Celiac sprue)(麩質(zhì)性腸病(gluten enteropathy))，冷球蛋白血癥(cryoglobulinemia)，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，冠狀動脈病(coronary artery disease)等。
“拮抗劑”是通過與B細胞表面標志結(jié)合能破壞或耗竭哺乳動物中的B細胞和/或例如通過減少或阻止B細胞所激發(fā)的體液應(yīng)答而干擾B細胞的一或多種功能的分子。拮抗劑優(yōu)選能耗竭所治療的哺乳動物中的B細胞。這種耗竭可通過多種機制獲得，如抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒作用(CDC)，對B細胞增殖的抑制和/或?qū)細胞死亡的誘導(dǎo)(即通過凋亡)。本發(fā)明的拮抗劑包括與B細胞標志結(jié)合的抗體、合成序列肽或天然序列肽，免疫粘附素以及小分子拮抗劑，可任選偶聯(lián)或融合于一種細胞毒制劑。優(yōu)選拮抗劑包含抗體。
“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用”和“ADCC”指一種細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞，和巨噬細胞)識別靶細胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細胞的裂解。介導(dǎo)ADCC的主要細胞即NK細胞僅表達FcγR III，而單核細胞表達FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)，464頁的表3中總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。為評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC試驗，如美國專利5,500,362號或5,821,337號中所述。這類試驗中有用的效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。選擇性地，或附加地，目的分子的ADCC活性可在體內(nèi)評估，例如采用Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)中公開的動物模型。
“人效應(yīng)細胞”是表達一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)物的功能的白細胞。優(yōu)選所述細胞表達至少FcγR III并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物的功能。例如可介導(dǎo)ADCC的人白細胞包括人外周血單個核細胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒T細胞和中性粒細胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細胞。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是人FcR的天然序列。而且，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的受體(γ受體)，其包括FcγR I，F(xiàn)cγR II和FcγR III亞型，以及這些受體的等位基因變體以及可替換的剪接形式。FcγR II受體包括FcγR IIA(“活化型受體”)和FcγR IIB(“抑制型受體”)，二者的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在其胞漿結(jié)構(gòu)域?；罨褪荏wFcγR IIA在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含一個基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγR IIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域包含一個基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見Daeron，免疫學(xué)年鑒15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫學(xué)年鑒9457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫學(xué)方法)425-34(1994)；和de Haas等，實驗室及臨床醫(yī)學(xué)雜志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中對FcR進行了綜述。其它FcR，包括將來被確定的，均被包含在術(shù)語“FcR”中。該術(shù)語也包括新生受體，F(xiàn)cRn，其負責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)運至胎兒(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志24249(1994))。本文的FcR包括多態(tài)性，諸如編碼FcγRIIIa的基因中的遺傳二態(tài)性，導(dǎo)致位于氨基酸位置158的苯丙氨酸或纈氨酸，其位于結(jié)合IgG1的受體的區(qū)域中。相對于純合苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或雜合(FcγRIIIa-158F/V)受體，純合纈氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)已經(jīng)對人IgG1顯示了較高親和性并介導(dǎo)增加的體外ADCC。
“補體依賴性細胞毒作用”或“CDC”是指在補體存在時分子裂解靶細胞的能力。補體活化途徑由補體系統(tǒng)第一個成分(C1q)結(jié)合至一個與同源抗原形成復(fù)合物的分子(如抗體)來啟動。為評價補體活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫學(xué)方法雜志202163(1996)所述進行CDC試驗。
“生長抑制”拮抗劑是指那些阻止或減少可與拮抗劑結(jié)合之抗原的表達細胞增殖的拮抗劑。例如拮抗劑可在體內(nèi)或體外阻止或減少B細胞的增殖。
“誘導(dǎo)凋亡”的拮抗劑或抗體是指那些可誘導(dǎo)例如，B細胞程序性細胞死亡的拮抗劑，所述凋亡可通過標準凋亡試驗，如annexin V的結(jié)合，DNA片段化，細胞皺縮，內(nèi)織網(wǎng)膨脹，細胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)形成確定。
這里的術(shù)語“抗體”用其最廣泛的意義，尤其包含完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及能顯示所需生物學(xué)活性的任何抗體片段。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，和Fv片段；二價抗體；線性化抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段構(gòu)成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，免疫球蛋白不同種型的重鏈中二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個重鏈在其一個端有可變區(qū)(VH)，緊接著多個恒定區(qū)。每個輕鏈端有變區(qū)(VL)，而另一端有恒定區(qū)；輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域并列，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)并列。認為輕鏈和重鏈的可變區(qū)有特定氨基酸形成一個界面。
術(shù)語“可變的”是指不同抗體的可變區(qū)特定部分序列差異很大，且這些部分在每種抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性中有用。然而在抗體整個可變區(qū)中可變性的分布并不均等。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個被稱為高變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)的更高度保守部分被稱為框架區(qū)(FR)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)分別包含四個FR，它們大多采用β片層構(gòu)象，通過三個高變區(qū)相連，這些高變區(qū)與β片層結(jié)構(gòu)形成環(huán)狀，有時形成部分環(huán)狀。每條鏈的高變區(qū)通過FR連接至十分接近，并與其他鏈的高變區(qū)共同形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體對抗原的結(jié)合，但顯示多種效應(yīng)功能，如使抗體參與抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)。
抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的稱為“Fab”的抗原結(jié)合片段和一個殘余“Fc”片段，每個Fab片段具有單個抗原結(jié)合位點，F(xiàn)c的名稱反映了其容易形成結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab’)2片段，它有兩個抗原結(jié)合位點并仍能與抗原交叉結(jié)合。
“Fv”是最小抗體片段，包含一個完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點。這個區(qū)域是由一條重鏈和一個輕鏈可變區(qū)緊密、非共價結(jié)合成的二聚體。在VH-VL二聚體表面，每個可變區(qū)的三個高變區(qū)在構(gòu)型上相互作用，從而限定抗原結(jié)合位點。六個高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特性。但即使單個可變區(qū)(或Fv中僅包含三個抗原特異性高變區(qū)的那一半)也能識別并結(jié)合抗原，只是比完整結(jié)合位點的親和力低。
Fab片段還包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’不同于Fab片段之處在于，其重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端添加了數(shù)個殘基，其中包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一或多個半胱氨酸。本文中Fab’-SH指一種Fab’，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基有至少一個游離巰基。F(ab’)2抗體片段最初是作為Fab’片段對且它們之間有鉸鏈區(qū)半胱氨酸的形式產(chǎn)生的?？贵w片段的其它化學(xué)連接也是已知的。
脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以是兩種完全不同的型(κ和λ)之一，型別區(qū)分的依據(jù)是其恒定區(qū)氨基酸序列。
抗體依據(jù)其重鏈恒定區(qū)氨基酸序列分為不同的類。完整抗體有五大類IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾種能進一步分為亞型(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別被稱為α，δ，ε，γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞單位和三維構(gòu)型是已知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個多肽接頭，它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學(xué)》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“二價抗體(diabodies)”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個重鏈可變區(qū)(VH)和一個輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，906444-6448(1993)中有對二價抗體的更詳細描述。
本文中術(shù)語“單克隆抗體”指從實質(zhì)上均一的抗體群獲得的抗體，即包含該群體的單個抗體除了可能自然發(fā)生的很少量突變以外都相同。單克隆抗體均以高度特異性直接針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的傳統(tǒng)(多克隆)抗體制劑相比，每種單克隆抗體直接針對抗原上的單個決定簇。單克隆抗體除了具有特異性，其優(yōu)勢還在于，它們是通過雜交瘤培養(yǎng)而合成的，無其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆的”指抗體獲自實質(zhì)上均一的抗體群的特征，不應(yīng)理解為限定由任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制備，或用重組DNA法(如美國專利4,816,567)來制備。“單克隆抗體”還可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991)所述技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離得到。
本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，只要它們展示所需生物學(xué)活性，其中所述嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分等同于或同源于來自特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列，鏈的其余部分等同于或同源于來自其它物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列(見美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，816851-6855(1984))。本文的目標嵌合抗體包括“靈長類化(primatized)”抗體，其包含源于非人靈長類可變區(qū)的抗原結(jié)合序列(如Old World Monkey，如狒狒，獼猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定區(qū)序列(美國專利5,693,780)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗體是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在多數(shù)情況下，人源化抗體是下述人免疫球蛋白(接收(recipient)抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類(供者(donor)抗體)的具有所需特異性、親和力和能力(capacity)的高變區(qū)的殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且人源化抗體可包含未在受者抗體或供者抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進一步細化抗體的功能。一般情況下，人源化抗體基本上包含至少一個、通常兩個可變區(qū)的全部，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗體任選還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)、通常為人免疫球蛋白的至少一部分。祥見Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
本文中術(shù)語“高變區(qū)”是指抗體中負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)含有“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))。“框架區(qū)”或“FR”殘基是除本文所定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“結(jié)合”目的抗原如B細胞表面標志或CD20的拮抗劑或抗體是下述拮抗劑，其能以足夠的親和力結(jié)合該抗原因而其可作為靶向表達該抗原的細胞的治療劑。
為本發(fā)明的目的，“免疫治療”指用抗體治療動物(優(yōu)選人類患者)的方法，其中所述抗體可為偶聯(lián)的或“裸露的”抗體，或所述抗體可偶聯(lián)或融合于異源分子或試劑，諸如一或多種細胞毒劑，由此產(chǎn)生“免疫偶聯(lián)物”。
本文“治療性抗體”是可有效治療患有或易患某種疾病或病癥中的所述疾病或病癥的抗體。示例性治療性抗體包括抗-HER2抗體，包括rhuMAb4D5(HERCEPTIN)(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992)，美國專利5,725,856)；抗-CD20抗體(見下文)；抗-IL-8(St John et al.，Chest，103932(1993)，以及國際公開WO 95/23865)；抗-VEGF抗體，包括人源化的和/或親和力成熟的抗-VEGF抗體，諸如人源化的抗-VEGF抗體huA4.6.1 AVASTINTM(Kim et al.，Growth Factors，753-64(1992)，國際公開WO 96/30046，和WO 98/45331，公開于1998-10-15)；抗-PSCA抗體(WO01/40309)；抗-CD40抗體，包括S2C6及其人源化變體(WO00/75348)；抗-CD11a抗體包括RaptivaTM(美國專利5,622,700，WO 98/23761，Steppe etal.，Transplant Intl.43-7(1991)，和Hourmant et al.，Transplantation58377-380(1994))；抗-IgE抗體(Presta et al.，J.Immunol.1512623-2632(1993)，和國際公開WO 95/19181；美國專利5,714,338，公開于1998-2-3，或1992-2-25公開的美國專利5,091,313，1993-3-4公開的WO93/04173，或1998-6-30提交的國際公開PCT/US98/13410，美國專利5,714,338)；抗-CD18抗體(美國專利5,622,700，1997-4-22公開，或1997-7-31公開的WO 97/26912)；抗-Apo-2受體抗體抗體(WO 98/51793，公開于1998-11-19)；抗-TNF-α抗體包括cA2(REMICADE)，CDP571和MAK-195(見，美國專利5,672,347，公開于1997-9-30，Lorenz et al.J.Immunol.156(4)1646-1653(1996)，和Dhainaut et al.Crit.Care Med.23(9)1461-1469(1995))；抗-組織因子(TF)抗體(歐洲專利0 420 937 B1，1994-11-9授權(quán))；抗-人α4-β7整聯(lián)蛋白抗體(WO 98/06248，公開于1998-2-19)；抗-EGFR抗體(嵌合的或人源化的225抗體，如1996-11-19公開的WO 96/40210所述)；抗-CD3抗體諸如OKT3(美國專利4,515,893，公開于1985-5-7)；抗-CD25或抗-Tac抗體諸如CHI-621(SIMULECT)和ZENAPAX(見1997-12-2公開的美國專利5,693,762)；抗-CD4抗體諸如cM-7412抗體(Choy et al.Arthritis Rheum 39(1)52-56(1996))；抗-CD52抗體諸如CAMPATH-1H(Riechmann et al.Nature 332323-337(1988)；抗-Fc受體抗體諸如針對FcγRI的M22抗體，如Graziano et al.J.Immunol.155(10)4996-5002(1995)所述；抗-癌胚抗原(CEA)抗體諸如hMN-14(Sharkey et al.Cancer Res.55(23Suppl)5935s-5945s(1995)；針對乳腺上皮細胞的抗體，包括huBrE-3，hu-Mc 3和CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23)5852s-5856s(1995)；和Richman et al.Cancer Res.55(23 Supp)5916s-5920s(1995))；結(jié)合結(jié)腸癌細胞的抗體，諸如C242(Litton et al.Eur J.Immunol.26(1)1-9(1996))；抗-CD38抗體，例如AT 13/5(Ellis et al.J.Immunol.155(2)925-937(1995))；抗-CD33抗體諸如Hu M195(Jurcic et al.Cancer Res55(23 Suppl)5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗體諸如LL2或LymphoCide(Juweid et al.Cancer Res 55(23 Suppl)5899s-5907s(1995)；抗-EpCAM抗體諸如17-1A(PANOREX)；抗-GpIIb/IIIa抗體諸如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO)；抗-RSV抗體諸如MEDI-493(SYNAGIS)；抗-CMV抗體諸如PROTOVIR；抗-HIV抗體諸如PRO542；抗-肝炎抗體諸如抗-Hep B抗體OSTAVIR；抗-CA 125抗體OvaRex；抗-獨特型GD3表位抗體BEC2；抗-αvβ3抗體VITAXIN；抗-人腎細胞癌抗體諸如ch-G250；ING-1；抗-人17-1A抗體(3622W94)；抗-人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(A33)；抗-人黑素瘤抗體R24，其針對GD3神經(jīng)節(jié)苷脂；抗-人鱗狀細胞癌(SF-25)；和抗-人白細胞抗原(HLA)抗體諸如Smart ID10和抗-HLA DR抗體Oncolym(Lym-1)。
與CD20抗原結(jié)合的抗體有“C2B8”，現(xiàn)在被稱為“美羅華”(″RITUXAN″)(美國專利5,736,137，引入作為參考)；釔-[90]-標記的2B8鼠抗體“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”ZEVALIN(美國專利5,736,137，引入作為參考)；任選用131I標記鼠IgG2a“B1”(也稱“Tositumomab”)產(chǎn)生“131I-B1”抗體(碘131托西莫單抗(tositumomab)BEXXARTM)(美國專利5,595,721，引入作為參考)；鼠單克隆抗體“IF5”(Press等Blood69(2))584-591(1987))；鼠2H7和“嵌合2H7”抗體(美國專利5,677,180，引入作為參考)；人源化的2H7，包括“人源化的2H7v16″(見下文)；huMax-CD20(Genmab，Denmark)；AME-133(Applied Molecular Evolution)；和可從國際白細胞分型小組(International Leukocyte Typing Workshop)獲得的單克隆抗體L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentine等，在《白細胞分型III》(McMichael編，第440頁，Oxford University Press(1987))。
與CD19抗原結(jié)合的抗體包括Hekman等，癌癥免疫學(xué)和免疫方法(Cancer Immunol.Immunother.)32364-372(1991)和Vlasveld等，癌癥免疫學(xué)和免疫方法4037-47(1995)中所述抗CD19抗體；和在Kiesel等，白血病研究II，121119(1987)中所述B4抗體。
本文中術(shù)語“美羅華”或“RITUXAN”指經(jīng)遺傳工程改造的、針對CD20抗原的嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國專利5,736,137(引入作為參考)中命名為“C2B8”。該抗體是含小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)序列及人的恒定區(qū)序列的IgG1κ型免疫球蛋白。美羅華結(jié)合CD20的親和力為約8.0nM。
完全為了本發(fā)明的目的，“人源化的2H7″指包含以下所示可變輕鏈序列和可變重鏈序列的抗體DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO1)hu2H7v16的可變重鏈區(qū)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO2)。
優(yōu)選人源化的2H7v16包含輕鏈氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO3)；和重鏈氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLY
LQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO4)。
“分離”的拮抗劑或抗體是已經(jīng)從其自然環(huán)境組分中鑒定并分離和/或回收的拮抗劑或抗體。其自然環(huán)境中的污染成分有，可干擾該拮抗劑的診斷和治療應(yīng)用的礦物質(zhì)，可能還包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，，該拮抗劑的純度應(yīng)達到(1)經(jīng)Lowery法確定的拮抗劑重量的95％以上，最優(yōu)選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉(zhuǎn)杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色、優(yōu)選銀染所證實的均質(zhì)性。分離的拮抗劑或抗體包括重組細胞內(nèi)的原位拮抗劑或抗體，因為該拮抗劑或抗體的自然環(huán)境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的拮抗劑或抗體可通過至少一個純化步驟來制備。
需要治療的“哺乳動物”是指歸為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農(nóng)場動物，以及動物園里的動物、參與運動項目的動物或?qū)櫸锶绻贰ⅠR、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動物為人類。
“治療”是指治療方法和預(yù)防措施。需要治療者包括已經(jīng)患病者，以及需要對疾病進行預(yù)防者。因此，哺乳動物可能被診斷為已患病或?qū)λ黾膊∫赘小?br> “治療有效量”是指能有效阻止，改善或治療目標自身免疫病的拮抗劑的量。
本文用于輔助治療的術(shù)語“免疫抑制劑”是指能抑制或掩蓋所治哺乳動物的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這將包括能抑制細胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)或抑制自身抗原的表達，或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。這些制劑的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利4,665,077，其全文引入本文作參考)；非甾體類抗炎藥(NSAID)；硫唑嘌呤(azathioprine)；環(huán)磷酰胺；溴麥角環(huán)肽(bromocryptine)；達那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(它們掩蓋MHC抗原，如美國專利4,120,649所述)；抗MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A；類固醇如糖皮質(zhì)激素，例如強的松，甲基強的松龍，地塞米松和氫化可的松；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑包括抗IFN-γ，-β或-α抗體，抗TNF-α抗體(infliximab或adalimumab)，抗TNF-α免疫粘附素(etanercept)，抗TNF-β抗體，抗IL-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a和抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；pan-T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；包含LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶性肽(公開于7/26/90的WO90/08187)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；源于宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；雷帕霉素；T細胞受體(Cohen等，美國專利5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等，科學(xué)，251430-432(1991))；WO90/11294；Ianeway，自然，341482(1989)；和WO 91/01133)；和T細胞受體抗體(EP 340,109)例如T10B9。
本文中術(shù)語“細胞毒制劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32和镥的放射性同位素)，化療制劑，毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或它們的片段。
“化療制劑”是在腫瘤治療中使用的化學(xué)化合物。化療制劑實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如benaodopa，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，道諾紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；elliptinium acetate；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；nitracrine；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine)；navelbine；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。
術(shù)語“細胞因子”是由一個細胞群釋放的、作為細胞間介質(zhì)作用于另一細胞的蛋白的總稱。這類細胞因子有淋巴因子，單核因子，和傳統(tǒng)的多肽激素。包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；苗勒管(mullerian)-抑制物；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細胞生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本發(fā)明使用的術(shù)語“前體藥物”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)換成更具活性的親本形式。例見Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”Biochemical Society Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運送的化學(xué)方法”定向藥物運送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，可轉(zhuǎn)化為更具細胞毒活性的游離藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可衍生為本發(fā)明所用前體藥物形式細胞毒藥物包括，但不限于上述化療試劑。
“外來抗原”是指針對暴露于它的哺乳動物來說是非內(nèi)源性的或非天然的分子。外來抗原可以引發(fā)哺乳動物體內(nèi)的免疫應(yīng)答，例如，體液和/或T細胞介導(dǎo)的反應(yīng)。一般情況下，外來抗原可以誘導(dǎo)針對它們的抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明關(guān)注的外來抗原的實例包括具備免疫原性的治療劑，例如，抗體等蛋白，尤其是包含非人的氨基酸殘基的抗體(例如嚙齒類，嵌合/人源化，和靈長類的抗體)；毒素(任選與靶向分子如抗體偶聯(lián)，其中該靶向分子可能也具有免疫原性)；基因治療病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒；移植物；感染因子(例如細菌和病毒)；同種異體抗原(即同一種群中一些成員具有而其它成員不具有的抗原)例如血型抗原、人淋巴細胞抗原(HLA)、血小板抗原、表達在移植器官上的抗原、血液成分、妊娠抗原(Rh)和血友病因子(例如因子VIII和因子IX)的不同。
“阻斷針對外來抗原的免疫應(yīng)答”是指降低或阻止因暴露于外來抗原引起的至少一種免疫應(yīng)答。例如，可以減弱對外來抗原的體液反應(yīng)，即，通過阻止或減少哺乳動物體內(nèi)針對該抗原的抗體的產(chǎn)生?；蛘?，或另外可抑制獨特型；“減弱(pacify)”對同種異型抗體覆蓋的細胞的消除；和/或通過損耗抗原提呈細胞而影響同種異體抗原的提呈。
本發(fā)明所用的術(shù)語“移植物”是指來源于向受體進行移植的供體的生物物質(zhì)。移植物包括多種多樣的物質(zhì)，例如，分離的細胞例如胰島細胞；組織例如新生兒的羊膜，骨髓，造血祖細胞，和眼組織如角膜組織；器官如皮膚，心臟，肝臟，脾臟，胰腺，甲狀腺小葉，肺，腎臟，管狀器官(如腸道，血管或食管)，等等。管狀器官能用來代替食管、血管或膽管的損傷部分。皮膚移植物不但可用于燒傷，還可用作損傷腸管的被膜或用來修補某些缺損例如隔疝。移植物來源于任何哺乳動物，包括人，無論生死。優(yōu)選移植物是骨髓或者器官如心臟，并且移植物的供體和宿主的HLA II類抗原是相匹配的。
此處所用術(shù)語“哺乳動物宿主”是指任何相容的移植接受者。“相容的”是指將接受移植物的哺乳動物宿主。宿主優(yōu)選是人。如果移植物的供體和宿主都是人，為提高組織相容性，優(yōu)選他們的HLA II類抗原相匹配。
此處所用術(shù)語“供體”是指提供移植物的死或活的哺乳動物。優(yōu)選，供體是人。人供體優(yōu)選自愿的有血緣關(guān)系同時體檢正常的供體，而且供體和受體有相同的主要ABO血型，因為跨越主要血型的障礙可能不利于同種異體移植物的存活。但是，移植在某些情況下是可能的，例如，O型供體的腎臟可移植給A、B或AB型的接受者。
術(shù)語“移植”和它的變稱是指移植物進入到宿主體內(nèi)，無論是同基因移植(syngeneic)(供體和接受者遺傳背景相同)、同種異體移植(供體和接受者遺傳背景不同但屬同一物種)或異種移植(供體和接受者來自不同物種)。所以，在典型的實施過程中，宿主是人，移植物是同基因移植物，來源于具有相同或不同遺傳背景的人。在另一種情況下，移植物來自與移植接受者不同的另一物種，例如將狒狒的心臟移植給人類宿主，并且包括從種系發(fā)生方面相隔很遠的動物，例如，將豬心瓣膜，或者動物β胰島細胞或神經(jīng)細胞移植給人宿主。
“基因治療”是指將核酸導(dǎo)入待治療的哺乳動物體內(nèi)的常規(guī)方法。核酸可以編碼目的多肽或者反意核酸?；蛑委熭d體或組合物的一個或多個成分在用它們治療的哺乳動物體內(nèi)可能存在免疫原性。例如，病毒載體(如腺病毒、I型單純皰疹病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)；脂質(zhì)；和/或組合物中的靶向分子可能誘導(dǎo)用它們治療的哺乳動物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。
“使等待移植的哺乳動物脫敏”的表述是指在對哺乳動物進行移植之前降低或去除對移植物的過敏(allergic)敏感性或反應(yīng)性。這可以通過任何機制獲得，例如減少脫敏哺乳動物體內(nèi)的抗供體抗體，如當這些抗供體抗體針對人淋巴細胞抗原(HLA)時。
本文的“中和型抗體”指不僅結(jié)合目的抗原(例如治療型抗體諸如CD20抗體)，而且還在一定程度顯示抗原的生物活性的抗體。
II.中和型抗體測定法本發(fā)明至少部分涉及用于檢測治療性抗體的中和型抗體，或結(jié)合B細胞表面標記(例如結(jié)合與CD20結(jié)合的抗體)的拮抗劑的測定法。所述測定法確定用所述抗體或拮抗劑治療的患者的生物樣品阻斷該抗體或拮抗劑的生物活性的能力。阻斷活性可表示抗體或拮抗劑的有效性降低。
所述樣品通常在用所述抗體或拮抗劑處理患者之前和/或之后獲自該患者。通常生物樣品在一系列時間點獲自該患者，例如從預(yù)處理到治療循環(huán)。為了避免藥物干擾測定法的性能，生物樣品通常在藥物清除出現(xiàn)時獲取。例如，可檢測基線，3、6和9個月的樣品。如果患者在隨后的時間再次接受處理，可針對來自基線以及3和6個月的樣品檢測中和型抗體。
所述生物樣品可包含結(jié)合用于處理患者的抗體或拮抗劑的抗體，諸如人抗鼠抗體(HAMA)，人抗嵌合抗體(HACA)和人抗人抗體(HAHA)。HAHA可針對人源化的或人的治療性抗體。一個實施方案中，樣品是已經(jīng)被測定含有所述抗體的樣品。例如，在下文實施例1的整個ELISA測定法或美國專利申請2003/0068664(Albitar et al.)中，發(fā)現(xiàn)來自患者的血清包含目的藥物的抗體。
用于該測定法的生物樣品可以是血清，血漿，細胞裂解物，乳汁，唾液或其它分泌物，以及回收自所述生物樣品的任何一或多種樣品的抗體。優(yōu)選，來自患者的血清接受本發(fā)明所述測定法。
中和型抗體可降低輸注的藥物的預(yù)期藥物學(xué)水平，由此降低效力或使得反應(yīng)的可能性更可變。中和型抗體可與再次治療導(dǎo)致的血清疾病或免疫復(fù)合物疾病相關(guān)。例如，如果發(fā)現(xiàn)中和型抗體反應(yīng)，所述治療可停止或推遲，或可增加劑量，或可給予患者其它的藥劑，其可改善抗體或拮抗劑的效力，和/或降低針對其的任何免疫反應(yīng)。各種可與所述治療聯(lián)合以降低免疫反應(yīng)(其中觀察到中和型抗體反應(yīng))的免疫抑制劑，是已知的且作為本發(fā)明所述藥物的實例。
除了利用臨床醫(yī)師在患者治療中的試驗結(jié)果，抗藥物抗體的中和特性，聯(lián)合HAMA，HACA，或HAHA數(shù)據(jù)，證實了免疫原性，或免疫原性的傾向，以及抗體或拮抗劑的免疫原性的性質(zhì)。該信息可用于評估藥物安全性并預(yù)測患者對治療的潛在免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的試驗代表了相對于US 2003/0068664(Albitar et al.)中的ELISA測定法的改進，其提供了對目的藥物的任何抗體反應(yīng)是否可實際上中和(至少在一定程度上)藥物的生物活性，所述藥物是否是B細胞表面標記的抗體或拮抗劑的評估。因此，所述信息可用于測定用于治療所述患者的抗體或拮抗劑的效力。在CD20抗體或其它結(jié)合B細胞表面標記的拮抗劑的背景中，所述測定法被認為具體可用于以下情況利用其的治療導(dǎo)致部分B細胞耗竭，出現(xiàn)B細胞過度活化(例如在SLE中)，或疾病癥狀持續(xù)存在數(shù)年(例如在SLE和RA中)。
該測定法對于用抗體或拮抗劑治療患者以治療自身免疫疾病而言是尤其需要的。各種自身免疫疾病在本發(fā)明描述，但示例性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，韋格納氏病(Wegener’s disease)，炎性腸病(inflammatory bowel disease)，特發(fā)性或免疫性血小板減少性紫癜(idiopathic or immune thrombocytopenic purpura)(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)(TTP)，自身免疫性血小板減少癥(autoimmune thrombocytopenia)，多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)(MS)，銀屑病(psoriasis)，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病，重癥肌無力(myasthenia gravis)，血管炎(vasculitis)，糖尿病(diabetes mellitus)，雷諾綜合征(Reynaud’s syndrome)，干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)，腎小球腎炎(glomerulonephritis)，自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)等。
如果所述拮抗劑或抗體結(jié)合B細胞表面標記，諸如CD20抗原，所述患者可患有自身免疫病，B細胞惡性疾病，或所述拮抗劑或抗體可用于阻斷對外來抗原的免疫反應(yīng)(例如當所述外來抗原是免疫治療劑或移植物的情況)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，生物活性測定法包括基于細胞的功能測定，諸如確定補體依賴性細胞毒(CDC)，抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(ADCC)，凋亡，或細胞生長抑制的測定法。
優(yōu)選，所述測定法研究CDC活性。根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，表達抗體或拮抗劑所結(jié)合的抗原(例如B細胞表面標記諸如CD20)的細胞可在存在或(缺乏)所述抗體或拮抗劑以及用所述抗體或拮抗劑治療的患者的生物樣品的條件下暴露于補體(優(yōu)選人補體)。本發(fā)明涉及將四種組分(細胞，補體，抗體或拮抗劑，以及生物樣品)同時或依次以任何順序進行暴露；所有這些可能性包含在術(shù)語“在存在治療性抗體以及來自用其治療的患者的生物樣品的條件下將表達與所述治療性抗體結(jié)合的抗原的細胞暴露于補體”中。然而根據(jù)本發(fā)明但優(yōu)選實施方案，所述生物樣品(例如血清)與所述抗體或拮抗劑結(jié)合以允許中和抗體或拮抗劑的活性，并隨后將細胞和補體加入該混合物。
暴露步驟以后，測定CDC活性，優(yōu)選通過評估細胞存活力(即通過定量活細胞)。各種方法可用于測定細胞生存力，包括測定膜完整性的喪失，其可通過以下方法來評估相對于未經(jīng)處理的細胞而言對碘化丙啶(PI)，臺盼藍(見Moore et al.Cytotechnology 171-11(1995))，annexin V，或7AAD的吸收，本文所述的AlamarBlueTM測定法等。抗體或拮抗劑介導(dǎo)CDC的能力降低可表明中和型抗體存在所述生物樣品中。
對于基于細胞的測定法，通常使用表達所述抗體或拮抗劑結(jié)合的抗原的細胞系。對于CD20抗原的情況，各種細胞均可用，包括WIL2-S細胞(ATCC CRL 8885，美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，或表達CD20的淋巴母細胞樣B細胞系。利用CD20陽性細胞的CDC測定法在Idusogie et al.，J.Immunol.1644178-4184(2000)；Idusogie et al.，J.Immunol.1662571-2575(2001)；Reffet al.Blood 83(2)435-445(1994)；美國專利6,194,551 B1(Idusogie et al.)；和美國專利5,736,137(Anderson et al.)中描述。
如果所述測定法用于評估ACDD，可檢測所述抗體或拮抗劑介導(dǎo)自然殺傷細胞(NK細胞)和/或外周血單核細胞(PBMC)裂解表達與所述治療性抗體結(jié)合的抗原的細胞的能力。對于CD20抗原，可使用WIL2-S細胞，Shields et al.，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001)和WO00/42072(Presta，L.)描述了利用所述細胞的示例性ADCC。也參見Clynes et al.Nature Medicine6443-6(2000)。美國專利5,736,137(Anderson et al.)也描述了利用CD20陽性細胞的ADCC測定法。
凋亡指程序性細胞死亡，例如B細胞的凋亡，并可通過多種不同測定法確定，諸如annexin V的結(jié)合，DNA的片段化，細胞皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴大，細胞片段化和/或膜小泡(稱為凋亡小體)的形成。測定抗體(例如美羅華)誘導(dǎo)凋亡的能力的測定法在例如Shan et al.Cancer Immunol Immunther 48673-83(2000)；Pedersen et al.Blood 991314-9(2002)；Demidem et al.CancerChemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3)177-186(1997)中描述。
拮抗劑或抗體抑制細胞生長，例如抑制表達所述拮抗劑或抗體結(jié)合的抗原的癌性B細胞的生長的能力可通過多種不同測定法測定。Taji et al.JpnJ.Cancer Res 89748-56(1998)描述了如何測定CD20抗體對CD20陽性B淋巴細胞系的生長抑制。
利用本發(fā)明所述的中和型抗體，可測定抗體或拮抗劑(例如結(jié)合CD20的那種)的效力，所述測定通過測定用所述抗體或拮抗劑處理的患者生物樣品阻斷所述抗體或拮抗劑的生物活性的能力來進行，其中生物活性相對于對照樣品的降低表明所述患者激發(fā)了針對目的抗體或拮抗劑的抗體和/或這種抗體可至少在一定程度上中和所述抗體或拮抗劑的生物活性。明顯地的反應(yīng)導(dǎo)致中和抗體開發(fā)產(chǎn)生的相關(guān)安全性問題和/或響應(yīng)于改變的藥物清除改變的一級藥物劑量改變的需要。例如，與相同量的預(yù)處理部分相比(例如HAMA，HACA，和HAHA陰性)，中和給定濃度的所述抗體或拮抗劑藥物的活性的大約20％或更高(例如約20％-約100％)的樣品，可被認為對于中和針對所述抗體或拮抗劑的抗體而言是陽性的。
III.拮抗劑或抗體的制備本發(fā)明的方法和制品使用，或摻入了一種能結(jié)合B細胞表面標志的拮抗劑。相應(yīng)地，本文還描述了產(chǎn)生這類拮抗劑或抗體的方法。
用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑或抗體的抗原可以是，如抗原的可溶形式或其一部分，包括所需表位。或者，或此外，在表面表達所述抗原的細胞可用于產(chǎn)生或篩選拮抗劑或抗體?？捎糜诋a(chǎn)生拮抗劑或抗體的其它形式的抗原為本領(lǐng)域所顯而易見。優(yōu)選所述抗原是B細胞表面標志，諸如CD20抗原。
雖然優(yōu)選的拮抗劑是抗體，但除抗體以外的其它拮抗劑也包括在此。例如，拮抗劑可含有任選融合至或偶聯(lián)于細胞毒試劑(如本文所公開的那些)的小分子。可在小分子文庫中篩選本文的目標B細胞表面標志，以便鑒定能與該抗原結(jié)合的小分子。還可進一步篩選小分子的拮抗特性和/或使其與細胞毒試劑偶聯(lián)。
拮抗劑也可以是經(jīng)合理設(shè)計或噬菌體展示(例見WO98/35036，1998年8月13日公開)。在一個具體實施方案中，所選的分子可以是“CDR類似物”或基于抗體CDR而設(shè)計的抗體類似物。盡管所述肽本身可能就有拮抗性，但任選將此肽與細胞毒制劑融合，以便添加或增強此肽的拮抗性。
另一個實施方案中，所述拮抗劑是包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫粘附素，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如結(jié)合B細胞表面標志諸如融合于免疫球蛋白(例如免疫球蛋白Fc區(qū))的CD20的肽或蛋白。
以下為本發(fā)明所用抗體拮抗劑的產(chǎn)生技術(shù)舉例。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過多次給動物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。將所述相關(guān)抗原與針對所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來酰亞氨苯甲酰基硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，進行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內(nèi)注射該溶液。1個月后，多位點皮內(nèi)注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑的偶聯(lián)物來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物的加強免疫直到效價達到平臺期為止。優(yōu)選給動物加強注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動物如倉鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細胞。另外，可體外免疫淋巴細胞。然后用適當融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細胞接種至適當培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。
優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細胞和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))可在含有生長的雜交瘤細胞培養(yǎng)基中分析直接針對所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來測定。
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可作為腹水中腫瘤的形式在動物體內(nèi)生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述見Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來分離克隆抗體。
DNA也可通過用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來修飾(美國專利4,816,567；Morrison等，美國國家科學(xué)院學(xué)報816851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合來修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個抗原結(jié)合點的可變區(qū)，形成二價嵌合抗體，其中一個抗原結(jié)合位點特異于一種抗原而另一個抗原結(jié)合位點特異于另一種抗原。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已有關(guān)于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優(yōu)選人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
對用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)包括重鏈和輕鏈的選擇，對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)”方法，針對已知人類可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計算機程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加?？傊咦儏^(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原結(jié)合的影響。
(iv)人類抗體除了進行人源化以外還可制備人類抗體。例如現(xiàn)在已能產(chǎn)生如下轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，它們通過免疫能產(chǎn)生人類抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類的抗體產(chǎn)生。見Jakobovits等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.733(1993)；和美國專利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點進行的選擇也導(dǎo)致對顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進行選擇。因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行；這些綜述見Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因的隨機組合小文庫中分離了抗-唑酮(oxazolone)抗體的一個多樣性陣列。可基本如Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構(gòu)建未免疫人類供者的V基因所有組成，并分離針對抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見美國專利5565332和5573905。
人類抗體也可通過體外激活的B細胞而產(chǎn)生(見美國專利5,567,610和5,229,275)。
(v)抗體片段已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458。抗體片段也可以是“線性化抗體”，如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。如雙特異性抗體可以與B細胞表面標志物的兩種不同表位結(jié)合。其它這類抗體可以結(jié)合第一個B細胞表面標志并再結(jié)合第二個B細胞表面標志?；蛘撸蓪⒖笲細胞標志物的結(jié)合臂與結(jié)合白細胞上引發(fā)分子的臂結(jié)合，從而集中針對B細胞的細胞防御機制，所述引發(fā)分子如T細胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγR I(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細胞毒制劑定位至B細胞。這些抗體具有B細胞標志物結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(quadroma)可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構(gòu)建的實施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)，見Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。根據(jù)美國專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點認為，這類抗體可用于將免疫細胞導(dǎo)向不想要的細胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過任何適當?shù)慕宦?lián)方法制備。適當?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國專利4676980號中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。
直接從重組細胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，906444-6448(1993))描述的“二價抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結(jié)構(gòu)域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點。此外還報道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
IV.偶聯(lián)以及對拮抗劑或抗體的其它修飾本文方法或制品中提到的拮抗劑或抗體可任選與細胞毒制劑偶聯(lián)。
可用于制備這些拮抗劑或抗體-細胞毒制劑偶聯(lián)物的化療試劑如上述。
本文還涉及拮抗劑或抗體與一或多種小分子毒素，如加利車霉素，美登素(美國專利5,208,020)，單端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個實施方案中，使拮抗劑與一或多個美登素分子偶聯(lián)(如每個拮抗劑分子與約1-10個美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉(zhuǎn)化成May-SS-Me，然后還原成May-SH3，并與修飾過的拮抗劑或抗體反應(yīng)(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))產(chǎn)生美登木素生物堿-拮抗劑或抗體偶聯(lián)物。
另外，拮抗劑或抗體可以與一或多個加利車霉素分子結(jié)合。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素結(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG以及θ1I(Hinmam等，癌癥研究533336-3342(1993)和Lode等，癌癥研究582925-2928(1998))。
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發(fā)明還涉及與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)的拮抗劑或抗體。
多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的拮抗劑或抗體，實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
拮抗劑或抗體與細胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至拮抗劑或抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。這種接頭可能是有利于細胞毒藥物在細胞內(nèi)釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
或者，可通過重組技術(shù)或肽合成來獲得拮抗劑或抗體與細胞毒制劑的融合蛋白。
本發(fā)明的拮抗劑或抗體還可與前體藥物活化酶相結(jié)合，該酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。見WO88/07378和美國專利4,975,278。
這些偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為活性更強的細胞毒形式的任何酶。
本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；能將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙?；D(zhuǎn)化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘撸捎帽绢I(lǐng)域稱為“抗體酶”的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見Massey，自然328457-458(1987))。可如本文所述制備拮抗劑-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運送至腫瘤細胞群。
本發(fā)明的酶可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與拮抗劑或抗體共價結(jié)合。或者，可以通過本領(lǐng)域已知的DNA重組技術(shù)(如Neuberger等，自然，312604-608(1984))構(gòu)建含至少本發(fā)明拮抗劑或抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，所述拮抗劑或抗體與本發(fā)明酶的至少一個功能活性部分連接。
本文還涉及對拮抗劑或抗體的其它修飾。例如，拮抗劑或抗體可與一種非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物連接。
本文公開的拮抗劑或抗體還可配成脂質(zhì)體。含拮抗劑或抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，美國國家科學(xué)院學(xué)報823688(1985)；Hwang等，美國國家科學(xué)院學(xué)報774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國專利5,013,566中公開了循環(huán)壽命增加了的脂質(zhì)體。
特別有效的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過一定孔徑大小的濾膜而擠出后獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，生物學(xué)化學(xué)雜志，257286-288(1982)所述，經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)?？扇芜x在所述脂質(zhì)體中包含一種化療制劑。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
本發(fā)明還涉及對本文所述蛋白質(zhì)或肽類拮抗劑或抗體的氨基酸序列修飾。例如，可需要改進拮抗劑或抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。拮抗劑或抗體的氨基酸序列變體可通過在拮抗劑或抗體的核酸中導(dǎo)入適當?shù)暮塑账岣淖?，或通過肽合成法來制備。所述修飾包括，如該拮抗劑或抗體的氨基酸序列中的殘基缺失，和/或插入和/或取代。可對缺失、插入、和取代進行任意組合以獲得最終構(gòu)建體，只要該最終構(gòu)建體具有所需特性。氨基酸的變化還可改變拮抗劑或抗體的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。
一種鑒別拮抗劑或抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電的氨基酸取代(最優(yōu)屬模已被拿掉之后的高度之間的高度差)的量度。塌落流動對應(yīng)于混凝土錐在混凝土已塌落之后的底座直徑。

表3Gl.51＝Glenium51，Gl.27＝Glenium27鋪展值如上述DIN方法所述通過鋪展工作臺升起和碰撞10次振動而得到?！迩脫簟逅a(chǎn)生的剪切力造成混凝土的進一步鋪展?；炷溜炘凇迩脫簟逯g的直徑稱為鋪展值。如果現(xiàn)在針對參考物質(zhì)Glenium51和27和根據(jù)本發(fā)明的聚合物將塌落和鋪展值進行比較，顯然在相當?shù)乃渲迪潞笳咴诨旌?0min)之后立刻具有較大鋪展值(實施例C.2，C.3，C.5，C.6，C.7，C.8，C.9，C.12，C.13，C.15，C.16，C.17，C.18，C.20)。如果在60和90分鐘之后將塌落值與相應(yīng)的鋪展值比較，該差異甚至更明顯。在90分鐘后，Glenium51具有塌落值16.5cm和鋪展值49cm。如果實施例C.1，C.6，C.8，C.10，C.11，C.12，C.15和C.22用于對比，超過49cm的鋪展值顯然甚至可在低于10cm的非常低的塌落值

對拮抗劑或抗體的生物學(xué)特性的實質(zhì)性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
與維持拮抗劑或抗體正確構(gòu)象有關(guān)的任何半胱氨酸殘基也可被取代，如被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在拮抗劑或抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當拮抗劑為抗體片段如FV片段時)。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體高變區(qū)的一或多個殘基。通常，所選用于進一步開發(fā)的變體相對于其親本抗體應(yīng)具有改進的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結(jié)合作出主要貢獻的高變區(qū)殘基。此外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗原與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進行取代的候選位點。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對它們?nèi)窟M行篩選，選出在一或多個相關(guān)實驗中具有優(yōu)勢特性的抗體以便進一步開發(fā)。
拮抗劑或抗體的另一種氨基酸變體改變了拮抗劑或抗體原來的糖基化模式。所謂改變就是去掉拮抗劑或抗體中的一或多個碳水化合物部分，和/或添加一或多個原本不存在于該拮抗劑或抗體中的糖基化位點。
多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在拮抗劑或抗體分子中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個上述三肽序列(在N-連接糖基化位點的情況下)而實現(xiàn)。這種改變也可通過在原始的拮抗劑或抗體序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(xiàn)(在O-連接的糖基化位點的情況下)。
編碼拮抗劑或抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對早期制備的拮抗劑或抗體的變體或未變異的拮抗劑或抗體進行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點)誘變，PCR誘變和盒式誘變來制備。
也可預(yù)期修飾拮抗劑或抗體的效應(yīng)物功能，如以此增強拮抗劑或抗體的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒作用(CDC)。這可以通過在抗體拮抗劑FC區(qū)引入一或多個氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強補體介導(dǎo)的細胞殺傷作用和ADCC。見Caron等，實驗醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備。或者，可通過工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強的補體裂解效應(yīng)及ADCC能力的抗體。見Stevenson等，抗癌藥物的設(shè)計(抗-Cancer drug design)3219-230(1989)。具有改變的(增強的或減弱的)C1q結(jié)合和/或CDC活性的抗體描述于美國專利6,194,551B1和6,538,124B1(Idusogie et al.)，包含在本文作為參考。具有改變的FcR結(jié)合和/或ADCC活性的抗體描述于WO00/42072(Presta，L.)，包含在本文作為參考。
為了提高拮抗劑或抗體的血清半衰期，一種方法是在拮抗劑或抗體(尤其抗體片段)上摻入一個補救受體結(jié)合表位，如美國專利5,739,277所述。本文中術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負責(zé)延長該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位?？蛇x或此外，可通過改變抗體的Fc區(qū)的氨基酸序列產(chǎn)生FcRn結(jié)合改變的變體來增加，或降低血清半壽期。FcRn結(jié)合和/或血清半壽期改變的抗體描述于WO00/42072(Presta，L.)，包含在本文作為參考。
V.藥用制劑根據(jù)本發(fā)明使用的拮抗劑或抗體的藥用制劑通過將具有所需純度的拮抗劑或抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(xué)(Remington’sPharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存。可藥用載體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
抗CD20抗體制劑的實例如WO98/56418所述，其已引入本文作為參考。其描述了一種液體多劑量制劑，該制劑包含40mg/ml美羅華，25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酸酯(polysorbate)20，pH 5.0，在2-8℃至少可保存2年。另一種抗CD20目標制劑在9.0mg/ml氯化鈉，7.35mg/ml二水檸檬酸鈉，0.7mg/ml聚山梨酸酯80，注射用無菌水，pH6.5中包含10mg/ml美羅華。
適于皮下給藥的凍干劑見WO97/04801所述。這種凍干劑可用適當稀釋劑重新恢復(fù)至高蛋白濃度，所重建的制劑可皮下給藥至這里所治療的哺乳動物。
所述制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補活性但相互無負面影響的那些。例如，優(yōu)選還提供細胞毒試劑，化療試劑，細胞因子或免疫抑制劑(如作用于T細胞的那些，如環(huán)孢菌素或結(jié)合T細胞的抗體，如結(jié)合LFA-1的抗體)。所述其它試劑的有效量取決于該制劑中拮抗劑或抗體的量，疾病或病癥或治療的類型，及上述其它因素。通常應(yīng)用上文所述劑量和給藥方式，或迄今所用劑量的約1-99％。
活性成分也可容納在通過凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質(zhì)的藥物運送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見雷氏藥學(xué)，第16版Osol，A.編(1980)。
也可制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當實例包括含有拮抗劑或抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊?？蒯屩苿嵗ň埘ァ⑺z(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。
V.用拮抗劑或抗體進行治療本發(fā)明涉及利用抗體和拮抗劑治療各種疾病和病癥。如果所述抗體和拮抗劑結(jié)合B細胞表面標記，諸如CD20，待治療的病癥包括B細胞惡性疾病(見美國專利6,455,043B1，Grillo-Lopez，包含在此作為參考)，自身免疫疾病(見WO00/67796，Curd et al.，包含在此作為參考)。結(jié)合B細胞表面標記的拮抗劑或抗體也可用于阻斷對外來抗原的免疫反應(yīng)，例如所述外來抗原是免疫原性藥物或移植物的情況(見WO01/03734，Grillo-Lopez et al.，包含在此作為參考)。
對于本發(fā)明公開的各種指征，含一種與B細胞表面抗原結(jié)合的拮抗劑或抗體的組合物可根據(jù)常規(guī)醫(yī)療實踐進行配制、分劑量、并給藥。其中應(yīng)考慮的因素包括所治療的具體疾病或紊亂，所治療的具體哺乳動物，具體患者的臨床狀況，疾病或紊亂的病因，藥物的給藥部位，給藥方法，給藥時間表，和醫(yī)務(wù)人員已知的其它因素。拮抗劑或抗體的治療有效量將參考上述因素而給予。
作為常規(guī)建議，胃腸道外途徑每次給予拮抗劑或抗體的治療有效量的范圍是每天約0.1-20mg/kg患者體重，拮抗劑或抗體通常的起始劑量為約2-10mg/kg。
優(yōu)選的拮抗劑是抗體，如不與細胞毒制劑偶聯(lián)的RITUXAN。例如，非偶聯(lián)型抗體的適當劑量可以是約20mg/m2-約1000mg/m2。在一個具體實施方案中，抗體劑量不同于目前推薦的RITUXAN。例如，可給予患者一或多劑抗體，每劑基本上少于375mg/m2，每周×4或8；或1000mg×2(例如在第1和15天)。
但如上所述，應(yīng)在多種治療中謹慎考慮拮抗劑或抗體的這些建議劑量。其結(jié)果是選擇適當劑量和給藥時間表的關(guān)鍵因素，如上所示。例如治療進行性疾病和急性疾病可能需要相對較高的起始劑量。為針對疾病或紊亂獲得最有效的結(jié)果，應(yīng)盡可能在接近于疾病或紊亂的首次癥狀、診斷、表現(xiàn)、或發(fā)生時或在疾病或紊亂緩解期間給予拮抗劑或抗體。
拮抗劑或抗體可通過任何適當方式給藥，包括胃腸道外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、和鼻內(nèi)途徑，如需進行局部免疫抑制治療，可在病損內(nèi)給藥。胃腸道外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下給藥。此外，拮抗劑或抗體適于經(jīng)脈沖輸注給藥，如，使用劑量遞減的拮抗劑或抗體輸注。優(yōu)選經(jīng)注射給藥，最優(yōu)選靜脈注射或皮下注射，其取決于給藥是短期的還是長期的。
可與本文拮抗劑或抗體一起給予其它化合物，如細胞毒試劑、化療試劑、免疫抑制劑和/或細胞因子。組合給藥包括同時給藥各自的制劑或單一可藥用制劑，還包括以任何順序連續(xù)給藥，其中優(yōu)選有一段時間使兩種(或所有)活性試劑同時發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。
對于RA，以及其它自身免疫疾病，所述拮抗劑或抗體(例如CD20抗體)可與以下物質(zhì)聯(lián)用以上定義部分所列的任何一或多種免疫抑制劑、化療劑和/或細胞因子；任何一或多種改變疾病的抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)，諸如羥氯喹(hydroxycloroquine)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，甲氨喋呤(methotrexate)，來氟米特(leflunomide)，硫唑嘌呤(azathioprine)，D-青霉胺(penicillamine)，金(口服)，金(肌內(nèi))，米諾環(huán)素(minocycline)，環(huán)孢霉素(cyclosporine)，葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Staphylococcal protein Aimmunoadsorption)；靜脈內(nèi)免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin)(IVIG)；非類固醇抗炎藥物(nonsteroidal antiinflammatory drugs)(NSAIDs)；糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)(例如經(jīng)由關(guān)節(jié)注射)；皮質(zhì)類固醇(例如甲基強的松龍(methylprednisolone)和/或強的松(prednisone))；葉酸鹽/酯(folate)；抗腫瘤壞死因子(TNF)抗體，例如etanercept/ENBRELTM，infliximab/REMICADETM，D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech)；IL-1R拮抗劑(例如Kineret)；1L-10拮抗劑(例如Ilodecakin)；血凝調(diào)節(jié)物(例如WinRho)；IL-6拮抗劑/抗-TNF(CBP1011)；CD40拮抗劑(例如IDEC 131)；Ig-Fc受體拮抗劑(MDX33)；免疫調(diào)節(jié)物(例如沙利度胺(thalidomide)或ImmuDyn)；抗-CD5抗體(例如H5g1.1)；巨噬細胞抑制物(例如MDX 33)；共刺激阻斷物(例如BMS 188667或Tolerimab)；補體抑制物(例如h5G1.1，3E10或抗-衰減加速因子(DAF)抗體)；或IL-2拮抗劑(zxSMART)。
對于B細胞惡性疾病，所述拮抗或抗體(例如CD20抗體)可與以下物質(zhì)聯(lián)用化療劑；細胞因子，例如淋巴因子諸如IL-2，IL-12，或干擾素，諸如干擾素alpha-2a；其它抗體，例如放射標記的抗體諸如ibritumomab tiuxetan(ZEVALIN)，碘I131tositumomab(BEXXARTM)，131I Lym-1(ONCOLYMTM)，90Y-LYMPHOCIDETM；抗-CD52抗體，諸如alemtuzumab(CAMPATH-1HTM)，抗-HLA-DR-β抗體，諸如apolizumab，抗-CD80抗體(例如IDEC-114)，epratuzumab，Hu1D10(SMART 1D10TM)，CD19抗體，CD40抗體或CD22抗體；免疫調(diào)節(jié)物(例如沙利度胺或ImmuDyn)；血管生成抑制物(例如抗-血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體諸如AVASTINTM或沙利度胺)；獨特型疫苗(EPOCH)；ONCO-TCSTM；HSPPC-96(ONCOPHAGETM)；脂質(zhì)體治療(例如柔紅霉素檸檬酸酯脂質(zhì)體(daunorubicin citrate liposome))等。
與CD20抗體(或結(jié)合B細胞表面標記的拮抗劑)聯(lián)用的優(yōu)選的化療劑是烷化劑或基于蒽環(huán)類抗生素的化療劑或基于氟達拉濱(fludarabine)的化療劑；順鉑(cisplatin)，氟達拉濱，長春堿(vinblastine)，阿霉素(doxorubicin)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，和/或長春新堿(長春新堿)。對于CD20抗體或其它結(jié)合B細胞表面標記的抗體，具體是所需與抗體聯(lián)用的化療劑，包括但不限于環(huán)磷酰胺，阿霉素，長春新堿和強的松(CHOP)(Czuczman et al.JClin Oncol 17268-76(1999))；環(huán)磷酰胺，長春新堿，和強的松(CVP)；氟達拉濱(例如for treating CLL)；氟達拉濱，環(huán)磷酰胺，和米托蒽醌(mitoxantrone)(FCM)；或阿霉素，博來霉素，長春堿，和達卡巴嗪(dacarbazine)(ABVD)。
所述拮抗劑或抗體也可用于骨髓廢除性(myeloablative)方案。例如，所述拮抗劑或抗體可用于體內(nèi)洗滌然后進行干細胞收集，或移植后，用于清除最小殘余疾病。
除了將蛋白質(zhì)拮抗劑或抗體給予患者，本發(fā)明還涉及通過基因治療給藥拮抗劑或抗體。見，例如1996-3-14公開的WO96/07321，其涉及利用基因治療產(chǎn)生細胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法可將核酸(任選包含在載體中)引入患者細胞；體內(nèi)和離體(ex vivo)。體內(nèi)運送核酸指直接給病人注射，通常注射至需要拮抗劑或抗體的位點。離體治療是將患者細胞取出，將核酸引入這些分離的細胞，然后將這些已改變的細胞直接給予患者或裝入多孔膜中再植入患者體內(nèi)(見美國專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸引入活細胞。可根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的細胞，還是轉(zhuǎn)移至目標宿主的體內(nèi)細胞而使用不同方法。適于將核酸轉(zhuǎn)移至體外哺乳動物細胞的技術(shù)有脂質(zhì)體的應(yīng)用、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。常用于離體運送基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(如腺病毒，單純皰疹病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)型轉(zhuǎn)移的有效脂質(zhì)有DOTMA，DOPE和DC-Chol)。某些情況下，希望提供一種帶有能靶向靶細胞的試劑(如特異于細胞表面膜蛋白或靶細胞的抗體，針對靶細胞表面受體的配體，等)的核酸來源。當使用脂質(zhì)體時，可使用能結(jié)合胞吞作用相關(guān)性細胞表面膜蛋白的蛋白來靶向和/或促進對下述蛋白的吸收，所述蛋白如對特定細胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中進行內(nèi)在化的蛋白的抗體，靶向細胞內(nèi)定位和提高細胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)型胞吞作用的技術(shù)見Wu等，生物學(xué)化學(xué)雜志2624429-4432(1987)；和Wagner等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，873410-3414(1990)。有關(guān)目前已知的基因制備和基因治療方案的綜述見Anderson等，科學(xué)256808-813(1992)。亦參見WO93/25673。
本發(fā)明的更詳細內(nèi)容通過以下非限制性實施例舉例說明。本說明書中所引用的所有文獻均引入作為參考。
實施例1補體依賴性細胞毒測定法，用于檢測抗美羅華的中和型抗體美羅華通過抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(ADCC)和或補體依賴性細胞毒(CDC)來耗竭CD20+B細胞來顯示其生物功能。在體外，CDC活性可通過將CD20+WIL2-S淋巴瘤細胞與人補體在缺乏或存在不同濃度美羅華的條件下進行保溫來測定。細胞毒隨后可通過利用ALAMAR BLUE定量活細胞來測定(Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202 163-171(1997))。
該樣品中，鑒定來自用美羅華(其產(chǎn)生HACA)治療的患者的血清樣品。HACA陽性血清，其可通過免疫耗竭(immunodepletion)證實，隨后接受下述的中和型抗體試驗。HACA測定法與美羅華橋接，捕獲試劑和生物素化的美羅華作為檢測劑。所述測定法具有校準的標準曲線，其利用美羅華的多克隆山羊抗體制備。所述測定法中樣品的最小稀釋度是1/5，最低標準為1RU(相對單位)/mL。低于5RU/mL(相對于1/5稀釋因子校準的值)的樣品反應(yīng)被認為HACA陰性。
開發(fā)用于檢測抗美羅華的中和型抗體的測定法。所述中和型抗體測定法利用RPMI 1640培養(yǎng)基進行，所述培養(yǎng)基中補充了0.1％牛血清白蛋白(BSA)，20mM HEPES(pH 7.2-7.4)，和0.1mM慶大霉素。所述測定法被開發(fā)并利用親和力純化的多克隆山羊抗美羅華抗體校準。當在緩沖基質(zhì)中進行測定時，通常將1-10μL山羊抗-美羅華與50μL各種濃度的(0-10μg/mL)美羅華在平底96孔組織培養(yǎng)板中預(yù)保溫。在室溫預(yù)保溫1-2小時后，加入50μL在試驗培養(yǎng)基中稀釋的1/3人補體，50μL WIL2-S淋巴母細胞(106細胞/mL)的試驗培養(yǎng)基懸液，將混合物在37℃、5％CO2保溫2小時以促進補體介導(dǎo)的細胞裂解。隨后加入50μL未稀釋的AlamarBlueTM，并繼續(xù)保溫15-26小時。允許所述板通過震搖冷卻至室溫10分鐘，利用96孔熒光計以激發(fā)光530nm、發(fā)射光590nm讀取熒光。相對熒光單位(RFU)相對于美羅華濃度利用4參數(shù)曲線擬合程序(Softmax)作圖。通過比較進行和未進行抗體預(yù)保溫的兩條曲線，抗美羅華抗體的中和能力得以測定。如果抗美羅華抗體中和給定濃度的美羅華的20％或更高的活性，抗美羅華定義為中和能力陽性。這可通過測定中和1μg美羅華的抗美羅華量進一步定量。測定山羊抗美羅華多克隆抗體中和美羅華的摩爾比為大約3∶1。
由于大多數(shù)用于檢測的患者樣品是血清樣品，評估血清基質(zhì)對試驗性能的影響。在試驗培養(yǎng)基中包括5％和10％的正常人血清對于4參數(shù)擬合曲線具有最小的影響。上方的漸近線的信號抑制在血清濃度超過20％時觀察到。然而血清可達50％而IC50值沒有明顯移位。這些數(shù)據(jù)證實了利用CDC測定法用于檢測抗-美羅華抗體而不進一步操作患者的血清樣品的可行性。當檢測血清樣品時，達50μL的血清與50μL美羅華稀釋液保溫，然后加入補體和細胞懸液。其余的步驟與上述的相同。對于數(shù)據(jù)分析，美羅華處理的血清的中和能力單獨與預(yù)處理血清進行比較以確定中和活性。所述測定法在血清基質(zhì)中的敏感性/檢測限通過將親和力純化的山羊抗-美羅華摻入正常人血清來測定。利用目前的測定法模式，血清中的最低可檢測最低中和型抗體量為大約1μg/mL。
美羅華治療的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者樣品樣品具有抗體反應(yīng)(HACA+)通過上述ELISA測定法在中和型抗體測定法中檢測。基線血清和美羅華治療后的血清之間觀察到明顯差異。CDC活性用HACA+血清完全或部分阻斷，表明經(jīng)治療的樣品中的中和活性。相比而言，在美羅華治療之前獲得的血清樣品不顯示中和活性。
總之，本實施例描述了基于細胞的功能測定法，補體依賴性細胞毒(CDC)測定法，用于檢測美羅華治療的患者的血清中的中和活性。該測定法將大大有助于定性抗藥物抗體反應(yīng)；因此其對于評估藥物安全性和有效性而言有很大價值。
實施例2治療自身免疫疾病根據(jù)本發(fā)明所述的一個實施方案，本發(fā)明所述的測定法可用于患有自身免疫疾病的患者的治療方案。示例性自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，包括狼瘡腎炎，韋格納氏病，炎性腸病，特發(fā)性或血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，多發(fā)性硬化(MS)，銀屑病，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病，重癥肌無力，血管炎，糖尿病，雷諾綜合征，干燥綜合癥，腎小球腎炎和自身免疫性溶血性貧血等。
將結(jié)合CD20的抗體(例如美羅華或人源化的2H7)以有效治療目的自身免疫疾病的量給藥患者。例如，所述抗體的劑量可為375mg/m2每周一次、持續(xù)4或8周，或1000mg、第1和15天給藥。所述抗體可選與一或多種用于治療所述自身免疫疾病的其它藥物聯(lián)用，所述藥物諸如以上定義部分所列的任何一或多種免疫抑制劑、化療劑和/或細胞因子；任何一或多種改變疾病的抗風(fēng)濕藥物(DMARDs)，諸如羥氯喹，柳氮磺吡啶，甲氨喋呤，來氟米特，硫唑嘌呤，D-青霉胺，金(口服)，金(肌內(nèi))，米諾環(huán)素，環(huán)孢霉素，葡萄球菌蛋白A免疫吸附；靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)；非類固醇抗炎藥物(NSAID)；糖皮質(zhì)激素(例如經(jīng)由關(guān)節(jié)注射)；皮質(zhì)類固醇(例如甲基強的松龍和/或強的松)；葉酸鹽/酯；抗腫瘤壞死因子(TNF)抗體，例如etanercept/ENBRELTM，infliximab/REMICADETM，D2E7(Knoll)或CDP-870(Celltech)；IL-1R拮抗劑(例如Kineret)；1L-10拮抗劑(例如Ilodecakin)；血凝調(diào)節(jié)物(例如WinRho)；IL-6拮抗劑/抗-TNF(CBP 1011)；CD40拮抗劑(例如IDEC 131)；Ig-Fc受體拮抗劑(MDX33)；免疫調(diào)節(jié)物(例如沙利度胺或ImmuDyn)；抗-CD5抗體(例如H5g1.1)；巨噬細胞抑制物(例如MDX 33)；共刺激阻斷物(例如BMS 188667或Tolerimab)；補體抑制物(例如h5G1.1，3E10或抗-衰減加速因子(DAF)抗體)；或IL-2拮抗劑(zxSMART)。
包含HACA(針對美羅華)或HAHA(針對人源化的2H7)的血清生物樣品獲自基線、3、6和9個月的患者。對所述血清進行ELISA以確定HACA或HAHA是否存在。所述測定法在以上實施例1中描述。
所述檢測據(jù)證實含有HACA或HAHA的血清中的中和型抗體，如以上實施例1所述。與同樣量的預(yù)處理對應(yīng)部分(即，HACA和HAHA陰性)相比，中和給定濃度的美羅華或人源化的2H7的大約20％和更高的活性的樣品可被認為就針對美羅華或人源化的2H7的中和型抗體而言是陽性的。陽性結(jié)果表明在治療自身免疫疾病中，所述抗體的效力降低。
實施例3治療B細胞惡性疾病根據(jù)本實施例治療患有CD20陽性B細胞惡性疾病的患者，所述疾病諸如霍奇金病，包括淋巴細胞優(yōu)勢型霍奇金淋巴瘤(LPHD)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞白血病(ALL)；慢性淋巴細胞白血病(CLL)；毛細胞白血?。粷{細胞樣淋巴細胞淋巴瘤；套細胞淋巴瘤；AIDS和HIV-相關(guān)的淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤；移植后淋巴增生性疾病(PTLD)；Waldenstrom′s巨球蛋白血癥(淋巴漿細胞性淋巴瘤)；粘膜相關(guān)的淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤；以及邊緣區(qū)淋巴瘤/白血病。
結(jié)合CD20(例如美羅華或人源化的2H7)的抗體以有效治療目的B細胞惡性疾病的量給藥患者。例如，所述抗體的劑量可為375mg/m2每周一次、持續(xù)4或8周。
可選，CD20抗體與一或多種化療劑聯(lián)用。優(yōu)選與CD20抗體聯(lián)用的化療劑是烷化劑或基于蒽環(huán)類抗生素的化療劑或基于氟達拉濱(fludarabine)的化療劑；順鉑，氟達拉濱，長春堿，阿霉素，環(huán)磷酰胺，和/或長春新堿。具體所需用于與抗體聯(lián)用的化療劑包括，但不限于環(huán)磷酰胺，阿霉素，長春新堿和強的松(CHOP)(Czuczman et al.J Clin Oncol 17268-76(1999))；環(huán)磷酰胺，長春新堿，和強的松(CVP)；氟達拉濱(例如用于治療CLL)；氟達拉濱，環(huán)磷酰胺，和米托蒽醌(FCM)；或阿霉素，博來霉素，長春堿，和達卡巴嗪(ABVD)等。
包含HACA(針對美羅華)或HAHA(針對人源化的2H7)的血清生物樣品獲自基線、3、6和9個月的患者。對所述血清進行ELISA以確定HACA或HAHA是否存在。所述測定法在以上實施例1中描述。
隨后檢測據(jù)證實含有HACA或HAHA的血清中的中和型抗體，如以上實施例1所述。與同樣量的預(yù)處理對應(yīng)部分(即，HACA和HAHA陰性)相比，中和給定濃度的美羅華或人源化的2H7的大約20％和更高的活性的樣品可被認為就針對美羅華或人源化的2H7的中和型抗體而言是陽性的。陽性結(jié)果表明在治療B細胞惡性疾病中，所述中和型抗體的有效性降低。
實施例4阻斷對外來抗原的免疫反應(yīng)本實施例中，抗-CD20抗體用于阻斷對外來抗原諸如治療性蛋白(例如小鼠抗體或免疫毒素)，基因治療病毒載體，血液因子(例如因子VIII)，血小板或移植物等的免疫反應(yīng)。
CD20抗體的適宜劑量是375mg/m2，通過每周4或8次輸注給藥。CD20抗體的給藥將降低或消除患者中的免疫反應(yīng)，由此有利于成功的治療。
為阻斷對移植物的免疫反應(yīng)，CD20抗體可用作預(yù)防急性排斥的聯(lián)合免疫抑制方案的一部分。在該背景中，CD20抗體，諸如美羅華或人源化的2H7，在移植周圍期(peri-transplant period)作為連續(xù)聯(lián)用方案的一部分給藥，其包括針對T細胞的藥劑，諸如環(huán)孢素，皮質(zhì)類固醇，霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)，包含或不包含-IL2受體抗體。由此，CD20抗體可被認為是誘導(dǎo)方案的一部分，其用于與慢性免疫抑制療法聯(lián)用。CD20抗體可通過抑制同種異體抗體的產(chǎn)生和/或影響抗原呈遞細胞的耗竭過程中同種異體抗原的呈遞以有助于預(yù)防同種異體排斥反應(yīng)。
其它免疫抑制藥劑的劑量如下環(huán)孢素(5mg/kg/天)；皮質(zhì)類固醇(1mg/kg，逐漸減量)；霉酚酸酯(1g，每天給藥兩次)；和抗-IL2受體抗體(1mg/kg，每周給予5次輸注)。CD20抗體也可與其它免疫抑制藥物聯(lián)用，諸如多克隆抗淋巴細胞抗體或單克隆抗-CD3抗體；維持性免疫抑制藥物，諸如神經(jīng)鈣蛋白(calcineurin)抑制物(例如他克莫司(tacrolimus))和抗增殖藥劑(諸如硫唑嘌呤，來氟米特或西羅莫司)；或聯(lián)合方案，包括T細胞共刺激的阻斷，T細胞粘附分子的阻斷或T細胞輔助分子的阻斷。
除了預(yù)防急性排斥，CD20抗體可用于治療急性排斥。CD20的適宜劑量如上所述。CD20抗體可選與CD3單克隆抗體和/或皮質(zhì)類固醇在急性排斥的治療中聯(lián)用。
CD20抗體也可(a)在移植后期單獨使用，或與其它免疫抑制劑和/或共刺激阻斷劑聯(lián)用，以治療或預(yù)防“慢性”同種異體移植物排斥；(b)作為耐受性誘導(dǎo)方案的一部分；或(c)用于異種移植的背景中。
包含HACA(針對美羅華)或HAHA(針對人源化的2H7)的血清生物樣品獲自基線、3、6和9個月的患者。對所述血清進行ELISA以確定HACA或HAHA是否存在。所述測定法在以上實施例1中描述。
所述檢測據(jù)證實含有HACA或HAHA的血清中的中和型抗體，如以上實施例1所述。與同樣量的預(yù)處理對應(yīng)部分(即，HACA和HAHA陰性)相比，中和給定濃度的美羅華或人源化的2H7的大約20％和更高的活性的樣品可被認為就針對美羅華或人源化的2H7的中和型抗體而言是陽性的。陽性結(jié)果表明在治療B細胞惡性疾病中，所述中和型抗體的有效性降低。
隨后檢測被證實含有HACA或HAHA的血清的中和型抗體，如實施例1上述。與同樣量的預(yù)處理對應(yīng)部分(即，HACA和HAHA陰性)相比，中和給定濃度的美羅華或人源化的2H7的大約20％和更高的活性的樣品可被認為就針對美羅華或人源化的2H7的中和型抗體而言是陽性的。檢測到中和型抗體反應(yīng)的情況中，這表明所述抗體阻斷對目的外來抗原的免疫反應(yīng)的能力降低。
權(quán)利要求
1.評估結(jié)合CD20的抗體的效力的方法，包括測定來自用CD20抗體治療的患者的生物樣品阻斷CD20抗體的生物活性的能力。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物活性選自補體依賴性細胞毒(CDC)，抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒(ADCC)，凋亡以及細胞生長抑制組成的組。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物活性是補體依賴性細胞毒(CDC)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述CD20抗體是美羅華(rituximab)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述CD20抗體是人源化的2H7。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品包含來自所述患者的、與CD20抗體結(jié)合的抗體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述生物樣品已經(jīng)接受了下述測定，所述測定可確定來自所述患者的生物樣品中來自該患者的、與CD20抗體結(jié)合的抗體的存在。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物樣品包含來自患者的血清。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者患有自身免疫病。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述自身免疫疾病選自以下疾病組成的組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，韋格納氏病，炎性腸病，特發(fā)性或免疫性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，多發(fā)性硬化(MS)，銀屑病，IgA腎病，IgM多發(fā)性神經(jīng)病，重癥肌無力，血管炎，糖尿病，雷諾綜合征，干燥綜合癥，腎小球腎炎和自身免疫性溶血性貧血。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者患有B細胞惡性疾病。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述B細胞惡性疾病選自以下疾病組成的組霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，濾泡中心細胞(FCC)淋巴瘤，急性淋巴細胞白血病(ALL)，慢性淋巴細胞白血病(CLL)，毛細胞白血病，漿細胞樣淋巴細胞淋巴瘤，套細胞淋巴瘤，AIDS和HIV-相關(guān)的淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤，移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，Waldenstrom′s巨球蛋白血癥，粘膜相關(guān)的淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤，以及邊緣區(qū)淋巴瘤/白血病。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者用CD20抗體治療以阻斷對外來抗原的免疫反應(yīng)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述外來抗原包括治療劑。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述外來抗原選自以下物質(zhì)組成的組抗體，毒素，基因治療病毒載體，移植物，感染劑，和同種異體抗原。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述外來抗原是移植物。
17.權(quán)利要求3的方法，其中所述的測定包括在存在CD20抗體以及所述生物樣品的條件下，將CD20陽性細胞暴露于補體，然后測定暴露的細胞的存活力。
18.免疫治療的方法，包括將結(jié)合CD20的抗體給藥患者；和測定來自患者的生物樣品阻斷CD20抗體的生物活性的能力。
19.檢測治療性抗體的中和型抗體的方法，包括在存在所述治療性抗體以及來自用其治療的患者的生物樣品的條件下，將表達與所述治療性抗體結(jié)合的抗原的細胞暴露于補體；和測定所述治療性抗體的補體依賴性細胞毒(CDC)活性，其中CDC活性的降低表示中和型抗體在所述生物樣品中的存在。
20.評估結(jié)合B細胞表面標記的拮抗劑的效力的方法，包括測定來自用所述拮抗劑治療的患者的生物樣品阻斷所述拮抗劑的生物活性的能力。
21.免疫治療的方法，包括將結(jié)合B細胞表面標記的抗體給藥患者；和測定來自所述患者的生物樣品阻斷所述抗體的生物活性的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療性抗體諸如CD20抗體的中和型抗體的檢測法。所述測定法可用于測定免疫療法中抗體的效力。
文檔編號G01N33/574GK1860367SQ200480028080
公開日2006年11月8日 申請日期2004年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月29日
發(fā)明者莫林·貝雷西尼, 宋安 申請人:健泰科生物技術(shù)公司