專利名稱：無(wú)干擾地分析糖疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有細(xì)菌莢膜糖，特別是與載體相偶聯(lián)的糖的疫苗的分析和質(zhì)量控制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
含有與載體蛋白相偶聯(lián)的莢膜糖的免疫原為本領(lǐng)域所熟知。這種偶聯(lián)將T細(xì)胞不依賴性抗原轉(zhuǎn)化為T(mén)細(xì)胞依賴性抗原，從而提高了記憶應(yīng)答并產(chǎn)生保護(hù)性免疫力，原型偶聯(lián)物疫苗用于b型流感嗜血桿菌(Hib)[例如，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1的第14章]。自Hib疫苗以來(lái)，開(kāi)發(fā)了保護(hù)性的抗腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)(腦膜炎球菌)和肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)的偶聯(lián)糖疫苗。感興趣的偶聯(lián)疫苗涉及的其它微生物有無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B族鏈球菌)[2]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[3]和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[4]。
人用的腦膜炎奈瑟球菌血清群C的偶聯(lián)疫苗已獲批準(zhǔn)，包括MenjugateTM[5]、MeningitecTM和NeisVac-CTM?；旌系难迦篈、C、W135和Y中各種偶聯(lián)物已見(jiàn)報(bào)道[例如，參考文獻(xiàn)6-9]，包括MenactraTM產(chǎn)品。偶聯(lián)抗原的其它混合物包括(i)腦膜炎球菌A/C混合物[10，11]；(ii)含有7種肺炎球菌偶聯(lián)物的PrevNarTM產(chǎn)品[12]；(iii)混合的腦膜炎球菌和Hib偶聯(lián)物[13，14]；和(iv)混合的腦膜炎球菌、肺炎球菌和Hib偶聯(lián)物[15]。
偶聯(lián)物疫苗所面對(duì)的問(wèn)題包括穩(wěn)定性和批次之間的一致性。例如，在Hib疫苗中，糖的催化性解聚已見(jiàn)報(bào)道[16]，而腦膜炎球菌血清群A的莢膜的偶聯(lián)物易于水解[17]。偶聯(lián)物的不穩(wěn)定性不良地導(dǎo)致免疫原性偶聯(lián)物的有效劑量隨時(shí)間而降低，批次之間的差異和特性未知分解產(chǎn)物的水平增加。參考文獻(xiàn)18和19討論了Hib偶聯(lián)疫苗的穩(wěn)定性測(cè)試的有關(guān)問(wèn)題。
定量分析糖偶聯(lián)物一般包括第一步驟糖水解，然后根據(jù)所釋放的單糖進(jìn)行分析。然而該分析只是直接相對(duì)于一種偶聯(lián)物(例如，用陰離子交換層析方法分析Hib[20]和腦膜炎球菌血清群A[21]的水解偶聯(lián)物)，混合疫苗，特別是當(dāng)不同的糖均具有相同單糖單元時(shí)，情況更復(fù)雜。例如，腦膜炎球菌血清群C、W135和Y的莢膜糖均含有唾液酸，因此根據(jù)測(cè)定所釋放的唾液酸的任何方法不能區(qū)分這3種血清群。
本發(fā)明的目的是通過(guò)改進(jìn)對(duì)偶聯(lián)疫苗中糖的定量評(píng)估來(lái)評(píng)估其穩(wěn)定性和完整性。具體地說(shuō)，本發(fā)明的目的是提供可用于測(cè)定腦膜炎球菌混合偶聯(lián)疫苗中每種偶聯(lián)物的方法，從而改進(jìn)疫苗的質(zhì)量控制和一致性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于可分析腦膜炎球菌多種血清群的混合糖的方法，即使這些糖具有相同的單糖單元。因此，本發(fā)明提供一種分析組合物中糖含量的方法，其中(a)所述組合物含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖和以下一種或兩種莢膜糖(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖；和/或腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖；(b)所述方法包括分析組合物中唾液酸含量的步驟和(i)如果組合物含有血清群W135的糖，分析組合物中半乳糖含量的步驟；(ii)如果組合物含有血清群Y的糖，分析組合物中葡萄糖含量的步驟；(c)如果組合物含有血清群W135的糖，則根據(jù)步驟(b)的半乳糖分析結(jié)果測(cè)定組合物中血清群W135的糖含量。
(d)如果組合物含有血清群Y的糖，則根據(jù)步驟(b)的葡萄糖分析結(jié)果測(cè)定組合物中血清群Y的糖含量。
(e)通過(guò)比較唾液酸分析的結(jié)果與以下結(jié)果來(lái)測(cè)定組合物中血清群C的糖含量(i)如果組合物含有血清群W135的糖而不是血清群Y的糖，分析步驟(b)的半乳糖結(jié)果；(ii)如果組合物含有血清群Y的糖而不是血清群W135的糖，分析步驟(b)的葡萄糖結(jié)果；或(iii)如果組合物同時(shí)含有血清群W135的糖和血清群Y的糖，分析步驟(b)的葡萄糖和半乳糖聯(lián)合結(jié)果。
因此，當(dāng)聯(lián)用血清群C、W135和Y的糖時(shí)，本發(fā)明可以分析唾液酸、葡萄糖和半乳糖含量。利用葡萄糖和半乳糖的結(jié)果分別直接定量血清群Y和W135的糖，從唾液酸含量中減去葡萄糖和半乳糖含量之和來(lái)定量血清群C的糖。因此，可以分辨這三種血清群，即使它們的單糖含量重疊。本發(fā)明人有利地發(fā)現(xiàn)可對(duì)同一物質(zhì)進(jìn)行這三種不同的單糖分析，而單糖之間無(wú)干擾和與組合物中其它糖類物質(zhì)(例如，凍干穩(wěn)定劑)無(wú)干擾。該方法可用于分析偶聯(lián)疫苗中總糖和游離糖，簡(jiǎn)化含有多種血清群的莢膜糖的疫苗的質(zhì)量控制。
分析醛糖、氨基己糖和唾液酸混合物而無(wú)干擾的方法已有描述[22]，但該方法依賴于酶處理和化學(xué)衍生。相反，本發(fā)明的方法不需要這些步驟，因此能更快更易進(jìn)行。此外，參考文獻(xiàn)22所述的條件不會(huì)存在分辨具有相同單糖單元的不同糖的固有問(wèn)題。
本發(fā)明也提供了適用于執(zhí)行本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)設(shè)備。具體地說(shuō)本發(fā)明提供分析上述組合物中糖含量的計(jì)算機(jī)程序，包括用于以下操作的程序模塊(a)接受樣品的唾液酸含量、葡萄糖含量和/或半乳糖含量的數(shù)據(jù)；和(b)從這些數(shù)據(jù)計(jì)算血清群C和血清群W135和/或Y的莢膜糖含量。本發(fā)明也提供包括保存了本發(fā)明計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。
血清群C、W135和Y的莢膜糖本發(fā)明方法是用于腦膜炎球菌莢膜糖混合物。所述混合物包含(i)血清群C和(ii)血清群W135和Y的一種或兩種的莢膜糖，即C+W135、C+Y或C+W135+Y。也可以存在其它糖。
血清群C的莢膜糖是(α2→9)-連接唾液酸(N-乙酰基神經(jīng)氨酸或“NeuNAc”)的均聚物。大多數(shù)血清群C菌株在唾液酸殘基的C-7和/或C-8處含有O-乙?；?，但約15％的臨床分離物缺乏這些O-乙?；鵞23、24]。乙酰化似乎不影響其保護(hù)性效力(例如，與MenjugateTM產(chǎn)品不同，NeisVac-CTM產(chǎn)品利用脫-O-乙?；奶牵珒煞N疫苗均有效)。糖結(jié)構(gòu)如

圖13所示，寫(xiě)成→9)-Neu p NAc7/8OAc-(α2→。
血清群W135的糖是唾液酸-半乳糖二糖單元的均聚物。與血清群C的糖相似，它含有可變的O-乙酰化，但是在唾液酸7和9位[50]。其結(jié)構(gòu)如圖14所示，寫(xiě)成→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
血清群Y的糖與血清群W135的糖類似，除了二糖重復(fù)單元含葡萄糖而不是半乳糖(參見(jiàn)圖16)。與血清群W135的糖相似，它在唾液酸7和9位含有可變化的O-乙酰化[25]。血清群Y(糖)的結(jié)構(gòu)如圖15所示，寫(xiě)成→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
因此，在含有血清群C、W135和Y莢膜糖的組合物中有三種不同的構(gòu)成單體(葡萄糖、半乳糖和唾液酸)，這三種單體存在于水解后的混合物中。這種混合物中葡萄糖單體的含量與原初組合物中血清群Y糖的含量直接相關(guān)，半乳糖單體的含量與W135糖的含量直接相關(guān)。然而，對(duì)于血清群C情況更復(fù)雜唾液酸是可用于定量血清群C糖的唯一單體，但測(cè)定的混合物中唾液酸含量將包括血清群W135和Y的糖產(chǎn)生的單體。本發(fā)明通過(guò)以下方法克服了該分析的復(fù)雜性先測(cè)定混合物中半乳糖、葡萄糖和唾液酸各自的含量(分開(kāi)和/或同時(shí)測(cè)定)，然后(a)利用半乳糖含量來(lái)定量水解前血清群W135的含量；(b)利用葡萄糖含量來(lái)定量水解前血清群Y的含量；(b)利用唾液酸含量與葡萄糖半乳糖含量之和的差異來(lái)定量水解前血清群C的含量，即根據(jù)唾液酸的摩爾量減去(葡萄糖+半乳糖)的摩爾量來(lái)計(jì)算血清群C的摩爾量。從唾液酸的摩爾含量中減去葡萄糖和半乳糖的摩爾含量糾正了血清群W135和Y的干擾，只得到血清群C的唾液酸(含量)。
本發(fā)明可用于分析長(zhǎng)度不同的莢膜糖。例如，MenjugateTM和MeningitecTM含有全長(zhǎng)血清群C的多糖的按分子大小選擇的片段(寡糖)，而NeisVac-CTM利用全長(zhǎng)多糖。寡糖和/或全長(zhǎng)的多糖均可利用本發(fā)明(測(cè)定)。寡糖的聚合程度(DP)低于細(xì)菌中存在的天然莢膜多糖所發(fā)現(xiàn)的程度，其平均值可以是DP＜30，例如10-25之間。DP不難通過(guò)離子交換層析或比色試驗(yàn)測(cè)定[26]。
分析單糖含量本發(fā)明的方法包括分析唾液酸、半乳糖(如果存在血清群W135)和葡萄糖(如果存在血清群Y)含量的步驟。如果某種方法可用于監(jiān)測(cè)組合物中單糖單元的存在(例如，簡(jiǎn)單地監(jiān)測(cè)生產(chǎn)早期殘留的單糖，或監(jiān)測(cè)偶聯(lián)物中可能水解釋放的單體)，則可直接應(yīng)用于該組合物。然而，該方法一般用于檢測(cè)組合物中糖的總含量，所以在分析前要水解組合物為單糖。因此，本發(fā)明方法通常包括處理組合物以解聚莢膜糖從而得到它們的組成單糖的步驟。然后分析解聚混合物所釋放的單糖的唾液酸含量和半乳糖和/或葡萄糖含量。
將莢膜糖解聚為它們的組成單糖的條件為本領(lǐng)域所知。例如，可用100mMHCl 80℃處理2小時(shí)來(lái)水解血清群C的糖分析糖的總含量[27]。利用三氟乙酸(TFA)進(jìn)行酸水解可用于水解所有的血清群C、W135和Y，就血清群C而言，培育溫度應(yīng)稍低以免其唾液酸降解(90℃而非100℃)。典型的TFA處理包括將TFA加入至終濃度2M，然后加熱至90-100℃，持續(xù)90分鐘。解聚后，可干燥糖水解物，例如利用真空干燥器。
解聚后，組合物含有血清群C和W135和/或Y的混合單糖?；旌衔镏羞@些單糖的含量與水解前原初組合物中這些糖的含量直接相關(guān)，所以可如上所述測(cè)定原始糖的含量?？筛鶕?jù)分子、質(zhì)量、比例或濃度的數(shù)量(例如，摩爾量)來(lái)測(cè)定含量。一般以摩爾量進(jìn)行(測(cè)定)，因?yàn)橥僖核崤c葡萄糖/半乳糖的分子量不同，但可利用和互換這些量度來(lái)評(píng)估混合物中的糖含量。為定量檢測(cè)，可將分析結(jié)果與某具體糖含量已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。
優(yōu)選將解聚的混合物完全水解為單糖。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有時(shí)會(huì)發(fā)生不完全水解，得到的混合物中存在二糖片段(即，MenW135的Gal-NeuNAc和MenY的Glc-NeuNAc)。然而，單糖以正確的理論比例釋放，二糖不會(huì)干擾單糖的分析，所以它們的存在不會(huì)造成麻煩。
可通過(guò)用已知技術(shù)，例如NMR、質(zhì)譜等檢測(cè)混合物的聚合程度(DP)來(lái)核查解聚的進(jìn)程(例如核查全部水解為單糖而非部分水解為寡糖)。
定量葡萄糖、半乳糖和唾液酸單糖的方法為本領(lǐng)域所熟知。這些方法可以是直接或間接的(例如，這些方法可包括衍生單糖，然后分析與原初單糖含量的相關(guān)性)。這些方法可包括使兩種/三種不同的單糖互相分離，然后分別分析，在這種情況下，由于分離導(dǎo)致了特異性，單糖含量的實(shí)際測(cè)定在每種情況中可以相同。然而，優(yōu)選采用在有其它單糖存在時(shí)能分析某單糖的方法，因此這些方法無(wú)需在分解前將這些糖相互分開(kāi)。此外，這些方法可用于偶聯(lián)糖，其中在解聚后無(wú)需將載體與糖分開(kāi)。一種優(yōu)選的方法是陰離子層析，特別是高效陰離子交換層析(HPAEC)，通常聯(lián)用脈沖電流分析檢測(cè)(PAD)[28，29]。HPAEC-PAD系統(tǒng)由DionexTMCorporation(Sunnyvale，CA)提供，例如BioLCTM系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用諸如PA1[直徑10μm的聚苯乙烯基質(zhì)，與二乙烯基苯交聯(lián)度為2％，與500nm MicroBead季銨功能化的乳膠凝聚(交聯(lián)度5％)]或PA10[直徑10μm的乙基乙烯基苯基質(zhì)，與二乙烯基苯交聯(lián)度為55％，與460nm MicroBead雙功能季銨離子凝聚(交聯(lián)度5％)]柱。這些系統(tǒng)能定量分析混合物中的每種糖而無(wú)需衍生或在分析前分離。就糖類分析而言，在加入柱前需要濾去其它化合物，DionexTM生產(chǎn)了用于此目的的預(yù)柱捕獲器和保護(hù)裝置(guard)，例如用于除去氨基酸的氨基酸捕獲裝置和硼酸鹽捕獲器等。
定量測(cè)定解聚混合物中葡萄糖、半乳糖和唾液酸單糖的另一方法是核磁共振法(NMR)。然而，為便于使用和高靈敏度起見(jiàn)，優(yōu)選本發(fā)明的層析方法。
唾液酸含量和葡萄糖和/或半乳糖含量測(cè)定后，簡(jiǎn)單地比較混合物中每種單糖的摩爾量，即可計(jì)算出原初組合物中莢膜糖的含量。
本發(fā)明的方法一般是破壞性的。因此，不能對(duì)全部組合物實(shí)施該方法，更通常是從感興趣的組合物中取一樣品，然后分析該樣品。
偶聯(lián)物本發(fā)明可用于分析疫苗，特別是含有偶聯(lián)糖的疫苗中糖的含量。共價(jià)偶聯(lián)可通過(guò)將糖從T-細(xì)胞不依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)-細(xì)胞依賴性抗原、引發(fā)免疫記憶而提高了糖的免疫原性。偶聯(lián)對(duì)兒科疫苗特別有用，它是熟知的技術(shù)[例如，參考文獻(xiàn)30-39所總結(jié)的]。糖可直接與載體相連[40，41]，但通常利用接頭或間隔臂，例如脂肪酸、β-丙酰胺[42]、硝基苯基-乙胺[43]、鹵代酰鹵(haloacylhalide)[44]、糖苷鍵[45]、6-氨基己酸[46]、ADH[47]、C4-C12組分[48]等。
偶聯(lián)物中的運(yùn)載體蛋白通常是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。CRM197白喉毒素衍生物[49-51]是MenjugateTM和MeningitecTM中的載體蛋白，而破傷風(fēng)類毒素用于NeisVacTM中。白喉類毒素用作MenactraTM中的載體。其它已知的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[52]、合成的肽[53，54]、熱激蛋白[55，56]、百日咳蛋白[57，58]、細(xì)胞因子[59]、淋巴因子[59]、激素[59]、生長(zhǎng)因子[59]、含各種病原體衍生抗原的多種人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白[60]、流感嗜血桿菌的D蛋白[61，62]、肺炎球菌表面蛋白PsPA[63]、鐵攝取蛋白[64]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[65]等。組合物可利用多種載體蛋白以降低載體抑制的風(fēng)險(xiǎn)，一種載體蛋白可攜帶多種糖抗原[66]。偶聯(lián)物的糖∶蛋白之比(w/w)一般在1∶5(即，蛋白過(guò)量)和5∶1(即糖過(guò)量)之間。除偶聯(lián)物之外，組合物還可含有游離載體蛋白[67]。
總體上，可用本發(fā)明的兩種方式分析含有偶聯(lián)糖的組合物。第一，可測(cè)定組合物中每種血清群糖的總濃度，例如測(cè)定疫苗釋放前(出于調(diào)節(jié)或質(zhì)量控制目的)，或者核查偶聯(lián)物混合后的濃度。第二，可測(cè)定組合物中游離的未偶聯(lián)糖，例如核查不完全偶聯(lián)(的情況)，或通過(guò)監(jiān)測(cè)游離糖隨時(shí)間的增加來(lái)跟蹤偶聯(lián)物水解。通過(guò)進(jìn)行此兩類分析，可估計(jì)每種血清群的游離糖與總糖含量之比，該比例可用于調(diào)節(jié)或質(zhì)量控制目的?？傮w上，需要保證疫苗所含每種游離形式的糖＜25％(例如＜20％、＜15％、＜10％等)。游離糖水平高意味著偶聯(lián)物的免疫原性劑量較低。
因此，本發(fā)明提供一種分析組合物的方法，其中(a)所述組合物含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖的偶聯(lián)物和以下一種或兩種(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖的偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖的偶聯(lián)物；(b)所述組合物可含有未偶聯(lián)形式的莢膜糖；(c)通過(guò)上述本發(fā)明方法測(cè)定任何未偶聯(lián)的莢膜糖的含量；(d)通過(guò)上述本發(fā)明方法測(cè)定偶聯(lián)的莢膜糖的含量；和，任選的(e)計(jì)算一種或多種莢膜糖的偶聯(lián)未偶聯(lián)糖之比。
步驟(c)和(d)可以任一順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。
本發(fā)明也提供一種釋放醫(yī)生所用疫苗的方法，包括以下步驟(a)制備含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖的偶聯(lián)物和以下一種或兩種(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖的偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖的偶聯(lián)物；(b)分析疫苗中每種所述莢膜糖的偶聯(lián)和/或未偶聯(lián)糖含量；和如果步驟(b)的結(jié)果表明糖含量可為臨床應(yīng)用所接受，則(c)釋放醫(yī)生所用的疫苗。步驟(b)包括評(píng)價(jià)最低糖濃度(例如，每種血清群1-20μg的總糖濃度之間)，評(píng)價(jià)未偶聯(lián)偶聯(lián)糖之比(例如，以重量計(jì)未偶聯(lián)糖≤20％，優(yōu)選≤10％或≤5％)等。可對(duì)包裝好的疫苗，或者包裝前的散裝疫苗實(shí)施步驟(b)。
為分別評(píng)估偶聯(lián)與未偶聯(lián)的糖，必須將它們分開(kāi)?？梢愿鞣N方法將水相組合物中的游離(即，未偶聯(lián)的)糖與偶聯(lián)糖分開(kāi)。偶聯(lián)反應(yīng)改變了糖的各種化學(xué)和物理參數(shù)，可利用這些差異來(lái)分離糖。例如，可利用分子大小分離游離和偶聯(lián)糖，因?yàn)榕悸?lián)物質(zhì)因載體蛋白而具有較大分子量。超濾是優(yōu)選的分子大小分離方法，可使游離糖通過(guò)具有合適截?cái)嘀?例如，CRM197載體為30kDa)的超濾膜，而保留偶聯(lián)物。另一方法是利用可保留偶聯(lián)物而游離糖可通過(guò)成為洗脫液流出的柱或膜的固相提取法(SPE)。SPE更為快速且一致，但分子大小分離應(yīng)用得更普遍。另一方法是，如果將偶聯(lián)物吸附到輔佐劑上，則可離心分離吸附的偶聯(lián)物(沉淀物)與水解后解吸的游離糖(上清液)。
因此，可將游離的糖與總糖分開(kāi)而分別分析，從而可測(cè)定組合物中非偶聯(lián)物質(zhì)的含量。比較游離(糖)含量與總(糖)含量比分別分析分離后兩種(糖)合并物要容易，特別是如果在分離期間偶聯(lián)物質(zhì)能保留在支持物上。
其它莢膜糖組分本發(fā)明能分析含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C和W135和/或Y的莢膜糖的組合物。本發(fā)明也可用于分析含有其它莢膜糖，例如腦膜炎奈瑟球菌血清群A的莢膜糖、b型流感嗜血桿菌莢膜糖等的組合物。
腦膜炎球菌血清群A的莢膜糖是在C3和C4位部分O-乙?；?α1→6)-連接的N-乙?；?D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物(圖17)?？捎梅忾]基團(tuán)取代乙?；苑浪鈁17]，這種修飾的糖仍然是本發(fā)明意義中的血清群A糖。如以上其它血清群所述，血清群A的莢膜糖的解聚條件已知[21]，例如用TFA在100℃水解。另一方法包括Dowex 50H+，然后在100℃加熱1小時(shí)[68]。所釋放的甘露糖胺磷酸單體可用例如HPAEC-PAD與葡萄糖、半乳糖和唾液酸平行分析[21]。
Hib莢膜糖是核糖、核糖醇和磷酸酯的聚合物。該糖稱為“PRP”(聚-3-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)，如圖18所示。將PRP解聚為單糖用于HPAEC-PAD或31P-NMR分析的方法已知，例如室溫與NaOH溫育過(guò)夜[20]。所釋放的核糖與核糖醇可與葡萄糖、半乳糖和唾液酸平行分析。
血清群C莢膜多糖是(α2→9)-連接的唾液酸的均聚物(也稱為多聚乙酰神經(jīng)氨酸)。本發(fā)明所分析的組合物優(yōu)選不含有任何其它的唾液酸均聚物，例如腦膜炎球菌血清群B的莢膜糖(α2→8連接的唾液酸)或大腸桿菌K12的莢膜糖(α2→8和α2→9連接)。一般地說(shuō)，如果待分析的組合物包含含有葡萄糖、半乳糖或唾液酸單體的莢膜糖，為了有助于混合(物)的分析，此種莢膜糖優(yōu)選也含有只有該糖才有的其它單體(混合物內(nèi))。甚至當(dāng)這些糖之間具有相同的單體時(shí)，存在獨(dú)特的單體使得可用與分辨腦膜炎球菌血清群C、W135和Y的所述相同的原理來(lái)平行分析不同的糖。
非莢膜糖組分當(dāng)本發(fā)明依賴得自待分析組合物的混合物的單糖分析時(shí)，該組合物優(yōu)選不含有游離形式的該單糖(除了得自莢膜糖水解的任何背景單糖外)。例如，待分析組合物中含有游離的唾液酸會(huì)過(guò)高估計(jì)血清群C的含量。如果含有二糖等，然后水解，也適用同樣的原理，例如存在蔗糖(葡萄糖+果糖)，或麥芽糖或海藻糖(均是兩個(gè)葡萄糖)時(shí)會(huì)過(guò)高估計(jì)血清群Y的含量，存在乳糖(葡萄糖+半乳糖)時(shí)會(huì)過(guò)高估計(jì)W135和Y(以及過(guò)低估計(jì)血清群C)。
然而，這些糖是疫苗制劑中常用的(例如，作為穩(wěn)定劑[69，70])，最大程度降低或避免這些干擾問(wèn)題主要有兩種方法。第一，可以測(cè)定這些成分的初始水平，然后從解聚混合物的測(cè)定水平中扣除。第二，可在分析前從組合物中除去這些組分，例如通過(guò)過(guò)濾或透析?？衫贸瑸V膜來(lái)除去低分子量組分，例如用1K膜除去蔗糖(分子量360)。
待分析莢膜糖中也未發(fā)現(xiàn)的單糖的存在通常不導(dǎo)致干擾問(wèn)題。例如，疫苗中可能存在作為凍干穩(wěn)定劑的糖醇[71]，但HPAEC-AED能區(qū)分樣品單糖和相應(yīng)的多元醇單糖，例如甘露糖(產(chǎn)氣桿菌(Aerobacter aerogenes)莢膜中發(fā)現(xiàn)[72])和甘露醇(穩(wěn)定劑)單糖以及核糖與核糖醇[73]。
非糖成分的分析該方法可包括對(duì)其它組分或性質(zhì)的分析，例如重量克分子滲透濃度、pH、每種糖或偶聯(lián)物的聚合程度、蛋白質(zhì)含量(特別是運(yùn)載體蛋白)、鋁含量、洗滌劑含量、防腐劑含量等，以及組合物中糖含量的分析。
本發(fā)明提供制備疫苗組合物的方法，包括分析本發(fā)明組合物的步驟，包括測(cè)定pH的步驟，然后將組合物的pH調(diào)節(jié)至所需值的步驟，例如6-8之間，或約7。
本發(fā)明提供包裝疫苗的方法，包括以下步驟(a)制備含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖偶聯(lián)物和一種或兩種以下偶聯(lián)物的散裝疫苗(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖偶聯(lián)物；(b)分析散裝疫苗中每種所述莢膜糖的偶聯(lián)和/或未偶聯(lián)糖的含量；(c)任選分析散裝疫苗的pH和/或其它性質(zhì)；和如果步驟(b)和(c)的結(jié)果表明散裝疫苗可為臨床應(yīng)用所接受，則(d)將散裝疫苗制備并包裝為人用疫苗。步驟(c)包括(見(jiàn)上文)評(píng)價(jià)最低糖濃度，評(píng)價(jià)未偶聯(lián)偶聯(lián)糖之比等。步驟(d)可包括包裝成單位劑型或多劑型，例如裝入小瓶或注射器中。用于注射的典型人用劑量體積是0.5ml。
在步驟(c)和/或(d)之前將散裝疫苗與一種或多種其它抗原混合，例如與以下抗原混合-腦膜炎奈瑟球菌血清群A的莢膜糖抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群B的蛋白質(zhì)抗原。
-腦膜炎奈瑟球菌血清群B的微泡囊[74]、“天然OMV”[75]、細(xì)胞泡或外膜泡囊[例如，參考文獻(xiàn)76到81等]的制劑。
-b型流感嗜血桿菌糖抗原。
-肺炎鏈球菌抗原，例如多價(jià)偶聯(lián)的糖抗原[例如，參考文獻(xiàn)82到84]。
-甲肝病毒抗原，例如滅活的病毒[例如，85，86]。
-乙肝病毒抗原，例如表面和/或核心抗原[例如，86，87]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)抗原，例如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(“FHA”)，任選與pertactin和/或凝集原2和3聯(lián)用[例如，參考文獻(xiàn)88和89]?？梢岳冒偃湛燃?xì)胞抗原。
-白喉抗原，例如白喉類毒素[參考文獻(xiàn)1的第13章]，例如CRM197突變體[例如，90]。
-破傷風(fēng)抗原，例如破傷風(fēng)類毒素[參考文獻(xiàn)1的第27章]。
-脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如，91，92]，例如IPV。
這類抗原可以吸附到鋁鹽佐劑上(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)。優(yōu)選含有任何其它糖抗原作為偶聯(lián)物。
批次的一致性就人用疫苗制備而言，偶聯(lián)的糖在偶聯(lián)前(例如，糖和載體蛋白)、偶聯(lián)后、配制后與混合后應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制。腦膜炎球菌血清群C、W135和Y的莢膜糖在混合后，基于單糖分析的現(xiàn)有技術(shù)方法不能用于區(qū)分它們，因?yàn)槎喾N來(lái)源的唾液酸可導(dǎo)致干擾。然而，本發(fā)明的單糖分析方法可用于分析混合的偶聯(lián)物。此外，本發(fā)明的方法可靠而一致，從而可正確比較不同批次的混合偶聯(lián)物，而這利用現(xiàn)有技術(shù)方法不可能。因此，可制備、檢驗(yàn)不同批次的混合偶聯(lián)疫苗，然后選擇最一致的批次用于釋放和應(yīng)用，而棄去異常的批次。
本發(fā)明提供定量測(cè)定腦膜炎球菌至少兩種不同血清群的莢膜糖(組分)混合物中每種血清群糖的方法，其中(a)所述不同血清群包括血清群C和一種或兩種以下血清群(i)血清群W135和/或(ii)血清群Y；(b)所述方法包括解聚混合物中的莢膜糖得到解聚混合物的步驟；和(c)通過(guò)比較所述解聚混合物中單糖的組成來(lái)定量測(cè)定不同血清群(糖)。
本發(fā)明也提供n批疫苗，其中(a)所述n批疫苗中的每批含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖的偶聯(lián)物和一種或兩種以下偶聯(lián)物(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖偶聯(lián)物；(b)第一批中血清群C偶聯(lián)糖的濃度是C1；(c)第二批中血清群C偶聯(lián)糖的濃度是C2；如果適用，(d)第一批中血清群W135偶聯(lián)糖的濃度是W1；如果適用，(e)第二批中血清群W135偶聯(lián)糖的濃度是W2；如果適用，(f)第一批中血清群Y偶聯(lián)糖的濃度是Y1；如果適用，(g)第二批中血清群Y偶聯(lián)糖的濃度是Y2；(h)C1/C2、W1/W2和Y1/Y2的各自比例在0.90和1.10之間，優(yōu)選各自比例在0.95和1.05之間；和(i)n的值是2或以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大)。
(h)中所述比例可以根據(jù)受比較每批的一份樣品，但通常是根據(jù)每批的多份樣品的平均值(例如平均值)而定。因此，對(duì)n批中的每批可取多個(gè)樣品，可多次檢測(cè)每份樣品的C1、C2、W1、W2、Y1和Y2，然后計(jì)算出每批的平均值，用該平均值計(jì)算所需比例。
每批(或每組)疫苗可分開(kāi)制備。例如，可通過(guò)不同地混合同一種散裝偶聯(lián)物或通過(guò)混合不同制備的一種散裝偶聯(lián)物來(lái)制備不同的兩批。同一散裝混合物的不同樣品不是不同的批次，因?yàn)檫@些樣品不會(huì)發(fā)生制備不同偶聯(lián)物的混合物時(shí)所產(chǎn)生的差異而致的批次之間差異。
除了上述(a)到(i)所述的特征外。所述n批(疫苗)的特征還在于(j)第一批中未偶聯(lián)的血清群C糖的濃度是C3；(k)第二批中血清群C未偶聯(lián)糖的濃度是C4；如果適用，(l)第一批中血清群W135未偶聯(lián)糖的濃度是W3；如果適用，(m)第二批中血清群W135未偶聯(lián)糖的濃度是W4；如果適用，(n)第一批中血清群Y未偶聯(lián)糖的濃度是Y3；如果適用，(o)第二批中血清群Y未偶聯(lián)糖的濃度是Y4；(p)C3/C4、W3/W4和Y3/Y4的各自比例在0.90和1.10之間，優(yōu)選各自比例在0.95和1.05之間。這些批次的特征也在于(q)C3/C1、C4/C2、W3/W1、W4/W2、Y3/Y1和Y4/Y2的比例各自小于0.20(例如，＜0.15、＜0.10、＜0.05、＜0.02、0)。
通用術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)“含有”包括“包括”以及“包含”，例如“含有”X的組合物可排他性地由X組成或者可以包括其它的物質(zhì)，例如X+Y。
詞“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可以完全不含Y。如果需要，詞“基本上”可從本發(fā)明的定義中省去。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”表示，例如x±10％。
應(yīng)該理解糖環(huán)可存在開(kāi)環(huán)和閉環(huán)形式，雖然本文的結(jié)構(gòu)式顯示了閉環(huán)形式，本發(fā)明也包括開(kāi)環(huán)形式。
附圖簡(jiǎn)述圖1和2顯示了對(duì)采用甘露醇穩(wěn)定劑凍干的腦膜炎球菌血清群A的偶聯(lián)物的HPAEC-PAD分析(結(jié)果)。圖3和4顯示了采用蔗糖作為穩(wěn)定劑的物質(zhì)的類似分析(結(jié)果)。
圖5和6顯示了對(duì)未凍干的血清群Y偶聯(lián)物的類似分析(結(jié)果)，圖7和8顯示了對(duì)血清群W135偶聯(lián)物的相同分析(結(jié)果)。
圖9到12顯示了對(duì)血清群C、W135和Y混合偶聯(lián)物的HPAEC-PAD分析(結(jié)果)。
圖13到15顯示了腦膜炎球菌血清群C(13)、W135(14)和Y(15)的莢膜糖的結(jié)構(gòu)式。圖16顯示了血清群W135和Y之間的差異。
圖17顯示了腦膜炎球菌血清群A的莢膜糖的結(jié)構(gòu)式。
圖18顯示了b型流感嗜血桿菌莢膜糖的結(jié)構(gòu)式。
圖19顯示了在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)血清群C(◆)、W135(■)和Y(▲)混合偶聯(lián)物中游離糖的變化。
本發(fā)明的實(shí)施方式偶聯(lián)物制備和層析方法如參考文獻(xiàn)7所述制備了腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和Y的莢膜糖抗原并與CRM197偶聯(lián)。
混合這四種偶聯(lián)物得到水溶性“MenACWY”組合物。
另外在蔗糖或甘露醇存在時(shí)凍干血清群A偶聯(lián)物和制備血清群C、W135和Y偶聯(lián)物的混合物(“MenCWY”)。
根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，在DionexTMHPAEC-PAD層析系統(tǒng)上分析糖含量。該儀器具有梯度泵組件(GP40或GP50)、脈沖電流分析檢測(cè)器(ED40或ED50)和自動(dòng)進(jìn)樣器(AS3500或AS50)。通過(guò)測(cè)定糖在金工作電極(以Ag/AgCl為參比電極)表面氧化所產(chǎn)生的電流來(lái)檢測(cè)糖。采用以下設(shè)置施加三相-電位波形E1＝0.05V；t1＝400ms；E2＝0.75V；t2＝200ms；E3＝-0.15V；t3＝400ms)。在施加E1期間對(duì)200到400ms進(jìn)行積分。利用PeakNet 6.4數(shù)據(jù)還原軟件積分并處理層析數(shù)據(jù)。
血清群A將血清群A糖的甘露醇凍干制劑在4℃保存3個(gè)月后用HPAEC-PAD檢驗(yàn)。用C4固相提取(SPE)柱分離含偶聯(lián)物的組合物與游離糖。用TFA在100℃酸水解含游離糖的溶液2小時(shí)。然后用PA1防護(hù)裝置、將混合物加入DionexTMCarboPac PA1柱上進(jìn)行梯度洗脫和PAD檢測(cè)來(lái)檢測(cè)甘露糖胺-6-磷酸。結(jié)果見(jiàn)圖1。
進(jìn)行相同的分析，但不用SPE分離游離的糖。該分析結(jié)果見(jiàn)圖2。鑒于圖1分析采用了1∶2的稀釋液而圖2分析采用了1∶5的稀釋液，圖1和2的比較顯示圖1中甘露糖胺-6-磷酸峰遠(yuǎn)低(于圖2的)，表明該組合物中游離糖的水平低。定量分析顯示每個(gè)小瓶有10.7μg的總糖，其中有3.7％為游離糖。
每瓶用600μl水重建后，以同一方法分析蔗糖凍干的偶聯(lián)物，然后合并樣品，每次分析采用2-3ml。在SPE C4之前，用1K膜超濾該組合物(用2ml水洗滌、加入2ml樣品溶液、每次用2ml水洗滌3輪、回收滲余物并將體積調(diào)節(jié)至1ml，按1∶1稀釋得到最終NaCl濃度為0.9％的溶液用于SPE上樣)。圖3顯示該組合物中游離糖可忽略不計(jì)，但大峰對(duì)應(yīng)于偶聯(lián)糖(圖4)。
血清群W135和Y在與其它偶聯(lián)物混合前分析散裝的血清群Y偶聯(lián)物。用30kDa超濾膜分離偶聯(lián)物與游離糖。用TFA100℃水解待分析的物質(zhì)，然后根據(jù)生產(chǎn)商使用說(shuō)明，用CarboPac PA1柱、氨基酸捕獲裝置、等度洗脫和再生步驟、和PAD檢測(cè)在DionexTM儀器上定量分析葡萄糖。將水解物加到柱上之前無(wú)需除去CRM197載體?？蓹z測(cè)到未偶聯(lián)糖(圖5)，但其豐度低于總葡萄糖(圖6)?？紤]到稀釋度不同，解析這些圖譜得出游離糖組分占1.8％。以相同的方法處理并分析散裝的血清群W135糖，但檢測(cè)的是半乳糖而非葡萄糖(圖7和8)?？紤]到稀釋度不同，解析這些圖譜得出游離糖組分占6％。
組合的偶聯(lián)物如參考文獻(xiàn)7所述，組合血清群A、C、W135和Y偶聯(lián)物與磷酸鋁佐劑。將在4℃保存2周的MenCWY偶聯(lián)物組合用于重建凍干的MenA偶聯(lián)物，48小時(shí)后離心分離佐劑與偶聯(lián)物進(jìn)行分析。用30kDa膜兩輪超濾分離組合的偶聯(lián)物與游離糖。第二輪降低了有時(shí)見(jiàn)于進(jìn)入第一輪滲透液的糖偶聯(lián)物的污染。用TFA90℃/100℃酸水解檢驗(yàn)超濾前后的糖，然后用DionexTMCarboPac PA1柱分別進(jìn)行兩次HPAEC-PAD分析。
就血清群C分析而言，該柱具有CarboPac PA1防護(hù)裝置并采用梯度洗脫。該柱運(yùn)行模式不能分辨葡萄糖和半乳糖，因?yàn)檫@樣更快。結(jié)果見(jiàn)圖9和10。就血清群W135和Y而言，該柱具有氨基酸捕獲裝置并采用等度洗脫和再生，可分辨葡萄糖和半乳糖。結(jié)果見(jiàn)圖11和12。
為計(jì)算每種不同糖的含量，通過(guò)扣除葡萄糖和半乳糖的合并含量來(lái)糾正圖9/10分析中對(duì)唾液酸含量的干擾。該值給出了MenC濃度。然后利用圖11/12分析中半乳糖和葡萄糖的含量來(lái)定量血清群W135和Y。如上所述，圖11/12中葡萄糖和半乳糖的合并含量可能因?yàn)樗獠煌耆c得自圖9/10的含量不匹配，但這些差異不會(huì)影響總的分析。通過(guò)與含有已知量葡萄糖、半乳糖和唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)品比較來(lái)計(jì)算含量。
對(duì)偶聯(lián)物中總的和游離的MenC糖的典型一式兩份分析得到以下結(jié)果

↑即，血清群C糖的濃度因此，盡管對(duì)血清群C糖缺乏獨(dú)特的糖來(lái)定量，但本發(fā)明可以血清群W135和Y糖為背景定量檢驗(yàn)該物質(zhì)。
圖9和11的類似分析揭示了MenACWY組合物中每種游離糖的含量，游離糖以占組合物總糖的百分比表示。對(duì)于配制成含10μg/劑(即，20μg/ml)每種糖的MenCWY組合物，在1年時(shí)期的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了該項(xiàng)分析。結(jié)果為


SD＝標(biāo)準(zhǔn)偏差CV＝差異系數(shù)，即(SD/平均值)×100％圖19顯示了在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)游離糖％的差異。
在第二系列的實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于先前工作將疫苗配制半劑量(每劑含5μg每種糖)和四分之一劑量(每劑含2.5μg每種糖)。用本發(fā)明方法分辨該組合物中不同的糖，結(jié)果如下


應(yīng)該理解本發(fā)明只是經(jīng)由實(shí)施例得到了描述，可以作出改進(jìn)形式而仍屬于本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種分析組合物的糖含量的方法，其中(a)該組合物含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖和一種或兩種以下莢膜糖(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖；和/或腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖；(b)所述方法包括分析該組合物中唾液酸含量的步驟，和以下步驟(i)如果該組合物含有血清群W135的糖，分析該組合物中半乳糖含量的步驟；(ii)如果該組合物含有血清群Y的糖，分析該組合物中葡萄糖含量的步驟；(c)如果該組合物含有血清群W135的糖，根據(jù)步驟(b)的半乳糖分析結(jié)果確定該組合物中血清群W135的糖的含量；(d)如果該組合物含有血清群Y的糖，根據(jù)步驟(b)的葡萄糖分析結(jié)果確定該組合物中血清群Y的糖的含量；(e)比較唾液酸分析的結(jié)果與以下結(jié)果來(lái)確定該組合物中血清群C的糖的含量(i)如果該組合物含有血清群W135的糖但不含血清群Y糖，步驟(b)的半乳糖分析結(jié)果；(ii)如果該組合物含有血清群Y的糖但不含血清群W135的糖，步驟(b)的葡萄糖分析結(jié)果；或(iii)如果該組合物同時(shí)含有血清群W135的糖和血清群Y的糖，合并步驟(b)的葡萄糖和半乳糖分析結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合物含腦膜炎奈瑟球菌所有三科響清群C、W135和Y的莢膜糖。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述組合物含有一種或多種其它莢膜糖。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述一種或多種其它莢膜糖選自腦膜炎奈瑟球菌血清群A的莢膜糖；和b型流感嗜血桿菌莢膜糖。
5.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，包括處理所述組合物以解聚莢膜糖而得到它們的組成單糖的步驟。
6.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，通過(guò)任選聯(lián)用脈沖電流分析檢測(cè)的高效陰離子交換層析檢測(cè)唾液酸含量、葡萄糖含量和/或半乳糖含量。
7.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，該方法還包括對(duì)一種或多種以下組分或性質(zhì)進(jìn)行分析重量克分子滲透濃度、pH、每種糖或偶聯(lián)物的聚合程度、蛋白質(zhì)含量、鋁含量、洗滌劑含量和防腐劑含量。
8.如以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述莢膜糖得自糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述偶聯(lián)物中的蛋白質(zhì)是細(xì)菌毒素或類毒素。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述毒素或類毒素選自白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、CRM197白喉毒素衍生物和流感嗜血桿菌的D蛋白。
11.一種分析組合物的方法，其中(a)所述組合物含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖偶聯(lián)物和一種或兩種以下偶聯(lián)物(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135的莢膜糖偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y的莢膜糖偶聯(lián)物；(b)所述組合物可含有未偶聯(lián)形式的莢膜糖；(c)用權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法測(cè)定任何未偶聯(lián)莢膜糖的含量；(d)用權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法測(cè)定偶聯(lián)莢膜糖的含量；和，任選的(e)計(jì)算所述組合物中一種或多種莢膜糖的偶聯(lián)未偶聯(lián)糖之比。
12.一種定量測(cè)定至少兩種不同腦膜炎球菌血清群的莢膜糖混合物中每種血清群的糖的方法，其中(a)所述不同血清群包括血清群C和以下一種或兩種血清群(i)血清群W135和/或(ii)血清群Y；(b)所述方法包括解聚混合物中的莢膜糖得到解聚混合物的步驟；和(c)比較解聚混合物的單糖組成定量測(cè)定不同血清群。
13.一種發(fā)放醫(yī)生所用疫苗的方法，包括以下步驟(a)制備含腦膜炎奈瑟球菌血清群C莢膜糖的偶聯(lián)物和一種或兩種以下偶聯(lián)物的疫苗(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135莢膜糖的偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y莢膜糖的偶聯(lián)物；(b)分析疫苗中每種莢膜糖的偶聯(lián)和/或未偶聯(lián)糖的含量；和如果步驟(b)的結(jié)果表明糖含量可為臨床應(yīng)用所接受，則(c)發(fā)放醫(yī)生所用的疫苗。
14.兩批次疫苗，其中(a)每批疫苗含有腦膜炎奈瑟球菌血清群C的莢膜糖偶聯(lián)物和一種或兩種以下偶聯(lián)物(i)腦膜炎奈瑟球菌血清群W135莢膜糖偶聯(lián)物；和/或(ii)腦膜炎奈瑟球菌血清群Y莢膜糖偶聯(lián)物；(b)第一批中血清群C偶聯(lián)糖的濃度是C1；(c)第二批中偶聯(lián)的血清群C糖的濃度是C2；如果適用，(d)第一批中血清群W135偶聯(lián)糖的濃度是W1；如果適用，(e)第二批中血清群W135偶聯(lián)糖的濃度是W2；如果適用，(f)第一批中血清群Y偶聯(lián)糖的濃度是Y1；如果適用，(g)第二批中血清群Y偶聯(lián)糖的濃度是Y2；和其中，(h)C1/C2、W1/W2和Y1/Y2的各自比例在0.90和1.10之間。
15.如權(quán)利要求14所述的疫苗批次，其特征在于(i)第一批中未偶聯(lián)的血清群C的糖的濃度是C3；(j)第二批中未偶聯(lián)的血清群C的糖的濃度是C4；如果適用，(k)第一批中未偶聯(lián)的血清群W135的糖的濃度是W3；如果適用，(l)第二批中未偶聯(lián)的血清群W135的糖的濃度是W4；如果適用，(m)第一批中未偶聯(lián)的血清群Y的糖的濃度是Y3；如果適用，(n)第二批中未偶聯(lián)的血清群Y的糖的濃度是Y4；(o)C3/C4、W3/W4和Y3/Y4的各自比例在0.90和1.10之間，優(yōu)選各自比例在0.95和1.05之間。
16.如權(quán)利要求15所述的疫苗批次，其特征在于(p)C3/C1、C4/C2、W3/W1、W4/W2、Y3/Y1和Y4/Y2的各自比例小于0.20。
17.一種適用于執(zhí)行權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述方法的計(jì)算機(jī)設(shè)備。
18.一種分析如權(quán)利要求1所定義的組合物中糖的含量的計(jì)算機(jī)程序，包括用于以下操作的程序模塊(a)接收關(guān)于某樣品的唾液酸含量、葡萄糖含量和/或半乳糖含量的數(shù)據(jù)；和(b)從這些數(shù)據(jù)計(jì)算出血清群C和血清群W135和/或Y的莢膜糖含量。
全文摘要
本發(fā)明以分析多種血清群腦膜炎球菌混合糖的方法為基礎(chǔ)，即使這些糖具有相同的單糖單元。本發(fā)明分析了血清群C、W135和Y的糖的組合物中的唾液酸、葡萄糖和半乳糖含量。葡萄糖和半乳糖結(jié)果可分別用于直接定量血清群Y和W135的糖，從唾液酸含量中扣除葡萄糖和半乳糖的合并含量而定量血清群C的糖。因此，可分辨這三種血清群，即使它們的單糖含量重疊?？煞治鐾晃镔|(zhì)中的三種不同單糖而不受單糖之間的干擾和該組合物中任何其它糖物質(zhì)(例如，凍干穩(wěn)定劑)的干擾。本方法可用于分析偶聯(lián)疫苗中的全部糖和游離糖并簡(jiǎn)化了對(duì)含有多種血清群莢膜糖疫苗的質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)G01N33/66GK1981195SQ200580015039
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月17日
發(fā)明者A·巴多蒂, D·普羅蒂, S·里奇 申請(qǐng)人:啟龍有限公司