專(zhuān)利名稱(chēng)：用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于評(píng)價(jià)患有乳腺癌，特別是早期階段乳腺癌的患者預(yù)后的方法和組合物。
背景技術(shù)：
乳腺癌在美國(guó)女性中是第二最常見(jiàn)的癌癥，通常僅低于皮膚癌。美國(guó)女性在其一生中發(fā)生乳腺癌的機(jī)會(huì)有八分之一，并且美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)今年在美國(guó)會(huì)報(bào)道250,000個(gè)以上的新乳腺癌病例。乳腺癌是女性中第二位的癌癥死亡的主要原因，在2004年預(yù)計(jì)有40,000個(gè)以上的美國(guó)人死于該病。
最近十年內(nèi)改進(jìn)的檢測(cè)方法、群體篩選檢查和治療上的進(jìn)展已經(jīng)顯著改善了診斷為乳腺癌的女性的前景。目前，約80％的乳腺癌病例在該病的早期階段得到診斷，此時(shí)其存活率最高。作為結(jié)果，約85％百分比的乳腺癌患者在診斷后至少存活5年。
盡管有了這些進(jìn)展，但是約20％診斷為早期階段乳腺癌的女性10年的效果差并且經(jīng)歷疾病的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或在該時(shí)間期限內(nèi)死亡。然而，剩余80％的在早期診斷的乳腺癌患者具有良好的10年預(yù)后并且不太可能需要或得益于額外的攻擊性輔助療法(例如化療)。當(dāng)前的臨床共識(shí)在于至少某些早期的瘤陰性乳腺癌患者應(yīng)接受輔助化療，但目前沒(méi)有對(duì)患者分級(jí)以進(jìn)行更具攻擊性的治療的廣泛使用的檢測(cè)法。由于大部分這些早期癌癥患者在手術(shù)和/或放療后，無(wú)需進(jìn)一步治療就可以享有長(zhǎng)期存活，所以可能不適合于對(duì)所有這些患者推薦具有攻擊性的輔助療法，特別是考慮到與癌癥化療劑相關(guān)的顯著副作用。能夠在最初診斷時(shí)將這些早期階段乳腺癌患者群體區(qū)分成良好和不良預(yù)后組的組合物和方法可以有助于臨床醫(yī)師選擇合適的療程。因此，需要用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者，特別是早期階段乳腺癌患者預(yù)后的方法。
重要的研究集中于鑒定用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后和預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的方法和因素(一般參見(jiàn)Ross和Hortobagyi，eds.(印刷中)MolecularOncology of Breast Cancer(Jones和Bartlett Publishers，Boston，MA)及其中引述的參考文獻(xiàn)，將所有這些文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考)。預(yù)后指示物包括更多常規(guī)因素，諸如腫瘤大小、瘤的狀態(tài)和組織學(xué)等級(jí)以及提供某些有關(guān)預(yù)后的信息和對(duì)具體治療可能的反應(yīng)的分子標(biāo)記。例如，測(cè)定雌激素(ER)和孕酮(PR)類(lèi)固醇激素受體狀態(tài)已經(jīng)成為評(píng)價(jià)乳腺癌患者中常規(guī)的程序。例如，參見(jiàn)Fitzgibbons等(2000)Arch.Pathol.Lab.Med.124966-978。激素受體陽(yáng)性的腫瘤更有可能對(duì)激素療法起反應(yīng)并且一般還以攻擊性較低的方式生長(zhǎng)，由此導(dǎo)致具有ER+/PR+腫瘤的患者良好的預(yù)后。
人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2/neu)，即跨膜酪氨酸激酶受體蛋白的超表達(dá)與乳腺癌預(yù)后差相關(guān)。Ross等(2003)TheOncologist307-325。乳腺腫瘤中的Her2/neu表達(dá)水平目前用于預(yù)測(cè)對(duì)抗-Her-2/neu抗體治療劑曲妥單抗(Herceptin；Genentech)的反應(yīng)。例如，參見(jiàn)文獻(xiàn)同前，和Ross等，文獻(xiàn)同上。此外，約三分之一的乳腺癌在腫瘤抑制基因p53中存在突變并且這些突變與疾病的侵害性增加和預(yù)后效果差相關(guān)。Fitzgibbons等，文獻(xiàn)同上。Ki-67為在細(xì)胞周期的G1-M期過(guò)程中表達(dá)的非組蛋白核蛋白。研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞增殖標(biāo)記Ki-67的超表達(dá)也與乳腺癌預(yù)后差相關(guān)，文獻(xiàn)同前。
盡管目前的預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)和分子標(biāo)記在預(yù)測(cè)患者結(jié)果和選擇合適的療程方面提供了一定的指導(dǎo)，但是仍然存在對(duì)用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后，特別是早期淋巴結(jié)陰性患者的特異性和靈敏性方法的顯著需求。這類(lèi)方法應(yīng)將預(yù)后差的乳腺癌患者與那些預(yù)后良好的乳腺癌患者特異性區(qū)分開(kāi)并且能夠鑒定可能需要攻擊性輔助療法的高危早期階段乳腺癌患者。
發(fā)明概述提供了用于評(píng)價(jià)癌癥患者，特別是乳腺癌患者預(yù)后的方法和組合物。這些方法包括檢測(cè)身體樣品中至少一種，更特別的是至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)預(yù)示癌癥預(yù)后。本發(fā)明生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后良好(即無(wú)疾病生存)或預(yù)后差(即，癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死于潛在的癌癥)。因此，本發(fā)明的方法能夠?qū)㈩A(yù)后良好的乳腺癌患者與預(yù)后差的那些患者區(qū)分開(kāi)來(lái)。本文披露的方法可以與常規(guī)臨床因素(例如腫瘤大小、腫瘤等級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)和家族史)和/或分析分子標(biāo)記，諸如Her2/neu、Ki67、p53和雌激素和孕酮激素受體的表達(dá)水平的評(píng)價(jià)聯(lián)用。按照這種方式，本發(fā)明的方法能夠更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后。
本發(fā)明的生物標(biāo)記為蛋白質(zhì)和/或基因，其超表達(dá)預(yù)示癌癥預(yù)后，包括那些參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、侵入或轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記。對(duì)本發(fā)明生物標(biāo)記基因或蛋白質(zhì)超表達(dá)的檢測(cè)能夠評(píng)價(jià)癌癥預(yù)后并且有利于將乳腺癌患者分成良好和不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)組，例如目的在于治療選擇。
可以在蛋白質(zhì)或核酸水平上評(píng)價(jià)生物標(biāo)記表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，提供了免疫組織化學(xué)技術(shù)，其使用抗體檢測(cè)乳腺腫瘤樣品中的生物標(biāo)記表達(dá)。在本發(fā)明的該方面中，使用針對(duì)所關(guān)注的特異性生物標(biāo)記的至少一種抗體。還可以通過(guò)基于核酸的技術(shù)，包括，例如雜交和RT-PCR檢測(cè)表達(dá)。
組合物包括能夠結(jié)合本發(fā)明生物標(biāo)記的單克隆抗體。本文還包括這些單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和變體、產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤細(xì)胞系和編碼這些單克隆抗體的氨基酸序列的分離的核酸分子。進(jìn)一步提供了包含用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑的試劑盒。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示作為實(shí)際乳腺癌結(jié)果的函數(shù)的具有強(qiáng)度2的染色的細(xì)胞百分比分布。實(shí)施例4中提供了實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述。
圖2提供了使用基于序列的用于SLPI/p21ras/E2F1/PSMB9/src/磷酸-p27組合的解讀手段獲得的ROC曲線(xiàn)。實(shí)施例5中提供了實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述。
圖3提供了SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物標(biāo)記組的預(yù)后表現(xiàn)的卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)圖。實(shí)施例8中提供了實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述。
圖4提供了一般乳腺癌患者群體的長(zhǎng)期存活數(shù)據(jù)的圖示，其不依賴(lài)于對(duì)生物標(biāo)記超表達(dá)的分析。實(shí)施例8中提供了實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述。
圖5提供了SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1生物標(biāo)記組的預(yù)后表現(xiàn)的卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)圖。實(shí)施例9中提供了實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)描述。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于評(píng)價(jià)癌癥患者，特別是乳腺癌患者，更具體地說(shuō)為早期階段乳腺癌患者預(yù)后的方法和組合物。這些方法包括檢測(cè)患者組織或體液樣品中生物標(biāo)記的表達(dá)并且測(cè)定所述生物標(biāo)記是否超表達(dá)。用于實(shí)施本發(fā)明的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后(即差或良好預(yù)后)。因此，所關(guān)注的特定生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)能夠?qū)⒖赡芙?jīng)歷疾病復(fù)發(fā)(即預(yù)后差)的乳腺癌患者與那些更可能保持無(wú)癌癥(即預(yù)后良好)的患者區(qū)分開(kāi)來(lái)。在本發(fā)明的某些方面中。這些方法包括檢測(cè)乳腺腫瘤樣品中至少一種生物標(biāo)記的超表達(dá)，其預(yù)示乳腺癌預(yù)后差且由此鑒定更可能經(jīng)歷潛在癌癥復(fù)發(fā)的患者。本發(fā)明的方法還可以用于輔助選擇合適的療程并且鑒定可以得益于更具攻擊性療法的患者。在具體的實(shí)施方案中，抗體和免疫組織化學(xué)技術(shù)用于檢測(cè)所關(guān)注的生物標(biāo)記的表達(dá)并且評(píng)價(jià)乳腺癌患者的預(yù)后。進(jìn)一步提供了對(duì)于所關(guān)注的生物標(biāo)記具有特異性的單克隆抗體和用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
所謂″乳腺癌″意指例如那些通過(guò)活組織檢查分類(lèi)為惡性病理情況的疾病。乳腺癌診斷的臨床描述為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解乳腺癌意指乳腺組織的任何惡性腫瘤，包括，例如癌和肉瘤。在具體的實(shí)施方案中，乳腺癌為原位導(dǎo)管癌(DCIS)、原位小葉癌(LCIS)或粘液癌。乳腺癌還指浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)或浸潤(rùn)性小葉癌(ILC)。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所關(guān)注的受試者為懷疑或?qū)嶋H上診斷為乳腺癌的人類(lèi)患者。
美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)已經(jīng)研發(fā)了使用″TNM″分類(lèi)方案對(duì)乳腺癌疾病分期的標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)。評(píng)價(jià)患者的原發(fā)性腫瘤大小(T)、局部淋巴結(jié)狀態(tài)(N)和存在/不存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(M)且然后基于該因素的組合分成0-IV期。在該系統(tǒng)中，以0-4的等級(jí)分類(lèi)原發(fā)性腫瘤大小(T0＝無(wú)原發(fā)性腫瘤跡象；T1＝≤2cm；T2＝＞2cm-≤5cm；T3＝＞5cm；T4＝具有直接擴(kuò)散至胸壁或皮膚的任何大小的腫瘤)。將淋巴結(jié)狀態(tài)分類(lèi)為N0-N3(N0＝局部淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移；N1＝轉(zhuǎn)移至可移動(dòng)的、同側(cè)的腋窩淋巴結(jié)；N2＝轉(zhuǎn)移至同側(cè)的彼此或與其它結(jié)構(gòu)固定的淋巴結(jié)；N3＝轉(zhuǎn)移至同側(cè)的胸骨下淋巴結(jié))。將轉(zhuǎn)移分類(lèi)為不存在(M0)或存在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(M1)。盡管本發(fā)明包括處于任何臨床階段的乳腺癌患者，但是特別關(guān)注早期階段乳腺癌中的乳腺癌患者。所謂″早期階段乳腺癌″意指階段0(原位乳腺癌)、I(T1、N0、M0)、IIA(T0-1、N1、M0或T2、N0、M0)和IIB(T2、N1、M0或T3、N0、M0)。早期階段乳腺癌患者幾乎不表現(xiàn)出或不呈現(xiàn)淋巴結(jié)牽連。本文所用的″淋巴結(jié)牽連″或″淋巴結(jié)狀態(tài)″意指癌癥是否已轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)。基于此將乳腺癌患者分類(lèi)為″淋巴結(jié)-陽(yáng)性″或″淋巴結(jié)-陰性″。鑒定乳腺癌患者和給該疾病分期的方法為眾所周知的并且可以包括手工診查、活組織檢查、患者病史和/或家族史的回顧和顯像技術(shù)，諸如乳房造影法、磁共振影像學(xué)(MRI)和正電子發(fā)射斷層攝影(PET)。
術(shù)語(yǔ)″預(yù)后″為本領(lǐng)域中公認(rèn)的并且包括有關(guān)可能的疾病過(guò)程或疾病發(fā)展，特別是有關(guān)疾病緩解、疾病復(fù)發(fā)、腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡的可能性的預(yù)測(cè)?！孱A(yù)后良好″意指患有癌癥，特別是乳腺癌的患者保持無(wú)病(即無(wú)癌)的可能性。″預(yù)后差″意指潛在癌癥或腫瘤的復(fù)發(fā)或再發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的可能性。分類(lèi)為具有″良好結(jié)果″的癌癥患者保持無(wú)潛在的癌癥或腫瘤。相反，″結(jié)果差″的癌癥患者經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)，腫瘤復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移或死亡。在具體的實(shí)施方案中，用于評(píng)價(jià)預(yù)后和結(jié)果的時(shí)限例如少于1年，1年，2年，3年，4年，5年，6年，7年，8年，9年，10年，15年，20年或20年以上。本文所用的用于評(píng)價(jià)預(yù)后或無(wú)病存活期的相關(guān)時(shí)間從手術(shù)摘除腫瘤或腫瘤生長(zhǎng)的抑制、緩解或延緩開(kāi)始。因此，例如，在具體的實(shí)施方案中，″預(yù)后良好″意指乳腺癌患者保持無(wú)潛在癌癥或腫瘤至少5年，更特別的是至少10年期限的可能性。在本發(fā)明的其它方面中，″預(yù)后差″意指乳腺癌患者在少于5年，更特別的是少于10年內(nèi)經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)，腫瘤復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移或死亡的可能性。上述提供的用于評(píng)價(jià)預(yù)后和結(jié)果的時(shí)限為例證性的且不用來(lái)起限定作用。
在本文所述的某些實(shí)施方案中，使用考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)模型分析評(píng)價(jià)了生物標(biāo)記和/或其它臨床參數(shù)的預(yù)后表現(xiàn)，這是一種提供危害比及其置信區(qū)間的評(píng)估值存活數(shù)據(jù)的回歸方法。考克斯模型為一種用于探查患者存活率與特定變量之間的相關(guān)性的公認(rèn)的統(tǒng)計(jì)技術(shù)。這種統(tǒng)計(jì)方法能夠評(píng)估指定其預(yù)后變量(例如如本文所述的特定生物標(biāo)記的超表達(dá))的個(gè)體的危害(即風(fēng)險(xiǎn))?？伎怂鼓Ｐ蛿?shù)據(jù)通常作為卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)提供?！逦：Ρ取鍨檎故境鎏囟A(yù)后變量的患者在任何指定的時(shí)間點(diǎn)處的死亡危險(xiǎn)率。一般參見(jiàn)Spruance等(2004)Antimicrob.Agents & Chemo.482787-2792。在具體的實(shí)施方案中，所關(guān)注的生物標(biāo)記對(duì)于評(píng)價(jià)因潛在乳腺癌導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)或死亡的可能性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用于評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且包括例如使用時(shí)序檢驗(yàn)(log-rank test)考克斯分析和卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)。在本發(fā)明的某些方面中，p-值小于0.05構(gòu)成統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
如上文所述，大量臨床和預(yù)后乳腺癌因素為本領(lǐng)域中已知的并且用于預(yù)測(cè)治療效果和疾病復(fù)發(fā)的可能性。這類(lèi)因素包括淋巴結(jié)牽連、腫瘤大小、組織學(xué)等級(jí)、家族史、雌激素和孕酮激素受體狀態(tài)、Her2/neu水平和腫瘤倍性。本文所用的雌激素和孕酮激素受體狀態(tài)意指這些受體是否在特定乳腺癌患者的乳腺腫瘤中表達(dá)。因此，″雌激素受體-陽(yáng)性患者″展示出雌激素受體在乳腺腫瘤中表達(dá)，而″雌激素受體-陰性患者″無(wú)此情況。使用本發(fā)明的方法，可以獨(dú)立地或與評(píng)價(jià)這些或其它臨床和預(yù)后因素結(jié)合測(cè)定乳腺癌患者的預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，將本文披露的方法與對(duì)其它預(yù)后因素的評(píng)價(jià)結(jié)合能夠更準(zhǔn)確地測(cè)定乳腺癌預(yù)后。可以將本發(fā)明的方法與分析例如Her2/neu、Ki67和/或p53表達(dá)水平結(jié)合。在通過(guò)本發(fā)明的方法評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后時(shí)，還可以考慮其它因素，諸如患者臨床史、家族史和月經(jīng)狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，可以將通過(guò)本文披露的方法獲得的患者數(shù)據(jù)與臨床信息分析和對(duì)乳腺癌預(yù)后的現(xiàn)存檢驗(yàn)結(jié)合，以便研發(fā)參比實(shí)驗(yàn)預(yù)后規(guī)則系統(tǒng)。這類(lèi)規(guī)則系統(tǒng)可應(yīng)用于將乳腺癌患者，特別是早期階段的乳腺癌患者分級(jí)成良好和差的預(yù)后群體。評(píng)價(jià)為具有差的預(yù)后的患者可以升級(jí)為接受更具攻擊性的乳腺癌治療的階段。
本發(fā)明的方法在與分析其它已知預(yù)后指示物(例如淋巴結(jié)累及、腫瘤大小、組織學(xué)等級(jí)、雌激素和孕酮激素受體狀態(tài)、Her2/neu水平、腫瘤倍性和家族史)相比能夠更好地評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后。在本發(fā)明的具體方面中，靈敏性和特異性等于或大于已知癌癥預(yù)后評(píng)價(jià)方法的靈敏性和特異性。用于評(píng)價(jià)特異性和靈敏性的終點(diǎn)在于使用本發(fā)明的方法預(yù)測(cè)的預(yù)后或結(jié)果(即在診斷或接近診斷時(shí))與實(shí)際臨床效果(即患者在指定時(shí)間期限內(nèi)是否保持無(wú)癌或經(jīng)歷復(fù)發(fā))的比較。本文所用的″特異性″意指本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確鑒定真陰性的水平。在臨床研究中，通過(guò)真陰性的數(shù)量除以真陰性與假陽(yáng)性之和計(jì)算特異性。所謂″靈敏性″是指本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確鑒定為真陽(yáng)性的樣品的水平。在臨床研究中通過(guò)真陽(yáng)性的數(shù)量除以真陽(yáng)性與假陰性之和計(jì)算靈敏性。在某些實(shí)施方案中，披露的用于評(píng)價(jià)乳腺癌的方法的靈敏性至少約為40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上。此外，本發(fā)明方法的特異性?xún)?yōu)選至少約為40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上。在另外的實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)用于本發(fā)明預(yù)后方法的合并的靈敏性和特異性值。所謂″合并的靈敏性和特異性值″是指如上文所定義的單獨(dú)特異性和靈敏性值的總和。本發(fā)明方法的合并的靈敏性和特異性值優(yōu)選至少約為105％，110％，115％，120％，130％，140％，150％，160％或160％以上。
本文所用的″真″和″假″陽(yáng)性和陰性的定義取決于在研究中的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合是良好結(jié)果的生物標(biāo)記還是差結(jié)果的生物標(biāo)記。即，就良好結(jié)果的生物標(biāo)記而言(即，那些預(yù)示良好預(yù)后的生物標(biāo)記)，″真陽(yáng)性″意指那些如通過(guò)本發(fā)明方法測(cè)定的表現(xiàn)出所關(guān)注的生物標(biāo)記超表達(dá)(例如，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色為陽(yáng)性)的樣品，它們具有經(jīng)證實(shí)的良好實(shí)際臨床效果。相反，″假陽(yáng)性″展示出良好結(jié)果的生物標(biāo)記的超表達(dá)，而具有經(jīng)證實(shí)的差的實(shí)際臨床效果。″真陰性″和″假陰性″對(duì)于良好結(jié)果生物標(biāo)記不展示出生物標(biāo)記超表達(dá)(例如在免疫組織化學(xué)方法中不染色為陽(yáng)性)并且分別具有經(jīng)證實(shí)的差的和良好的實(shí)際臨床效果。
類(lèi)似地，就差結(jié)果的生物標(biāo)記而言，″真陽(yáng)性″意指那些表現(xiàn)出所關(guān)注的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記組合超表達(dá)的樣品，它們具有經(jīng)證實(shí)的差的實(shí)際臨床效果。即，″真陽(yáng)性″對(duì)于良好和差結(jié)果的生物標(biāo)記意指實(shí)際臨床效果(即良好或差)得到準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的樣品?！寮訇?yáng)性″展示出差結(jié)果的生物標(biāo)記的超表達(dá)，但具有經(jīng)證實(shí)的良好的實(shí)際臨床效果?！逭骊幮浴搴汀寮訇幮浴鍖?duì)于差結(jié)果的生物標(biāo)記不展示出生物標(biāo)記超表達(dá)并且分別具有經(jīng)證實(shí)的良好和差的實(shí)際臨床效果。
通過(guò)幾種可選擇的策略控制乳腺癌，可以包括例如手術(shù)、放療、激素療法、化療或其某些的組合。正如本領(lǐng)域中已知的，可以基于涉及的淋巴結(jié)數(shù)量、雌激素和孕酮受體狀態(tài)、原發(fā)性腫瘤大小和診斷時(shí)疾病的階段對(duì)個(gè)體乳腺癌患者做出治療決定。對(duì)各種臨床因素和臨床試驗(yàn)的分析已經(jīng)導(dǎo)致了International Consensus Panel of the St.Gallen Conference(2001)對(duì)于早期階段乳腺癌確立的推薦和治療指導(dǎo)方針。參見(jiàn)Goldhirsch等(2001)J.Clin.Oncol.193817-3827，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。這些指導(dǎo)方針表明對(duì)具有瘤陰性的乳腺癌的患者的治療基本上隨著基線(xiàn)預(yù)后而改變。當(dāng)與具有相對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)度復(fù)發(fā)的患者比較時(shí)推薦對(duì)具有相對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)度復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行更具攻擊性的治療。已經(jīng)證實(shí)對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)度群體的化療導(dǎo)致了復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)度降低。通常用放療和激素療法治療具有低風(fēng)險(xiǎn)度類(lèi)別的女性。使用本文披露的方法在診斷時(shí)將患者分級(jí)成預(yù)后差或預(yù)后良好風(fēng)險(xiǎn)度的組可以提供另外或可選的治療決策因素。本發(fā)明的方法能夠?qū)㈩A(yù)后良好的乳腺癌患者與更可能經(jīng)歷復(fù)發(fā)的那些患者(即在診斷時(shí)可能需要或得益于額外攻擊性治療的患者)區(qū)分開(kāi)來(lái)。本發(fā)明的方法可特別應(yīng)用于選擇對(duì)早期階段的乳腺癌患者合適的治療。如上所述，在疾病早期階段診斷的大部分乳腺癌患者在手術(shù)和/或放療，而無(wú)另外的輔助療法后可以享受長(zhǎng)期存活。然而，這些患者中較大的百分比(約20％)會(huì)經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)或死亡，從而要求在臨床上推薦某些或全部早期階段的乳腺癌患者應(yīng)接受輔助療法(例如，化療)。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于鑒定這種高風(fēng)險(xiǎn)度的預(yù)后差的早期階段乳腺癌患者群體，并且由此確定哪些患者將會(huì)得益于持續(xù)和/或更具攻擊性的療法并且在治療后停止監(jiān)測(cè)。例如，可以對(duì)通過(guò)本文披露的方法評(píng)價(jià)為預(yù)后差的早期階段乳腺癌患者在手術(shù)和/或放療后選擇更具攻擊性的輔助療法，諸如化療。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以與St.Gallens Conference建立的治療指導(dǎo)方針聯(lián)用以做出更明智的乳腺癌治療決定。還可以將用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的本發(fā)明方法與本領(lǐng)域中公知的其它預(yù)后方法和分子標(biāo)記分析(例如，Her2/neu、Ki67和p53表達(dá)水平)聯(lián)用，目的在于選擇合適的乳腺癌治療。此外，可以將本發(fā)明的方法與隨后研發(fā)的本領(lǐng)域目前未知的預(yù)后方法和分子標(biāo)記分析聯(lián)用。
本文披露的方法還可應(yīng)用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)所選擇的治療的反應(yīng)。所謂″預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)所選擇的治療的反應(yīng)″是指評(píng)價(jià)患者采用特定的治療會(huì)體驗(yàn)陽(yáng)性或陰性結(jié)果的可能性。本文所用的″預(yù)示陽(yáng)性治療結(jié)果″意指患者會(huì)體驗(yàn)因所選擇的治療而產(chǎn)生的有益效果(例如，完全或部分好轉(zhuǎn)、腫瘤大小減小等)的可能性增加。所謂″預(yù)示陰性治療結(jié)果″意指患者就潛在乳腺癌發(fā)展而言不會(huì)得益于選擇的治療的可能性增加。在本發(fā)明的某些方面中，所選擇的治療為化療。
在某些實(shí)施方案中，提供了用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者存活可能性的方法。特別地，這些方法可以用于預(yù)測(cè)長(zhǎng)期無(wú)病存活的可能性。所謂″預(yù)測(cè)乳腺癌患者存活可能性″意指評(píng)價(jià)患者因潛在乳腺癌而死亡的風(fēng)險(xiǎn)度?！彘L(zhǎng)期無(wú)病存活″意指患者在初始診斷或治療后，在至少5年，更特別的是至少10年或10年以上期限內(nèi)不會(huì)死于潛在乳腺癌或經(jīng)歷潛在乳腺癌的復(fù)發(fā)。這類(lèi)用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者存活可能性的方法包括檢測(cè)患者樣品中多種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中存活，特別是長(zhǎng)期無(wú)病存活的可能性因測(cè)定的在患者樣品中超表達(dá)的生物標(biāo)記數(shù)量增加而下降。例如，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，測(cè)定了至少5種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中無(wú)一種生物標(biāo)記的超表達(dá)預(yù)示存活的可能性增加，并且其中兩種或多種生物標(biāo)記的超表達(dá)預(yù)示存活的可能性下降。例如，與本領(lǐng)域中可獲得的乳腺癌存活統(tǒng)計(jì)表相比可以評(píng)價(jià)存活的可能性。在其它實(shí)施方案中，用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者存活可能性的方法包括測(cè)定至少6種生物標(biāo)記的表達(dá)并且評(píng)價(jià)這些超表達(dá)的生物標(biāo)記的數(shù)量。用于這些方法的生物標(biāo)記選自例如，E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9。一般參見(jiàn)實(shí)施例8和9。
本發(fā)明的生物標(biāo)記包括基因和蛋白質(zhì)。這類(lèi)生物標(biāo)記包括包含編碼生物標(biāo)記的核酸序列的完整或部分序列或這種序列的互補(bǔ)物的DNA。生物標(biāo)記核酸還包括包含所關(guān)注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物標(biāo)記蛋白質(zhì)為由本發(fā)明的DNA生物標(biāo)記編碼或相當(dāng)于本發(fā)明的DNA生物標(biāo)記的蛋白質(zhì)。生物標(biāo)記蛋白質(zhì)包含任何生物標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽類(lèi)的完整或部分氨基酸序列。生物標(biāo)記基因和蛋白質(zhì)的片段和變體也包括在本發(fā)明中。所謂″片段″意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分和由此編碼的蛋白質(zhì)。為生物標(biāo)記核苷酸序列的片段的多核苷酸一般包含至少10，15，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，800，900，1,000，1,100，1,200，1,300或1,400個(gè)連續(xù)的核苷酸或達(dá)到存在于本文披露的全長(zhǎng)生物標(biāo)記多核苷酸中的核苷酸數(shù)量。生物標(biāo)記多核苷酸的片段一般編碼至少15，25，30，50，100，150，200或250個(gè)連續(xù)的氨基酸或達(dá)到存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)生物標(biāo)記蛋白質(zhì)中的氨基酸總數(shù)?！遄凅w″意指基本上相似的序列。一般而言，正如通過(guò)序列比對(duì)程序所測(cè)定的，本發(fā)明的特定生物標(biāo)記的變體與該生物標(biāo)記具有至少約40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上的序列同一性。
″生物標(biāo)記″為任何基因或蛋白質(zhì)，其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正常或健康細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平相比得到改變。本發(fā)明的生物標(biāo)記為基因和蛋白質(zhì)，其超表達(dá)與癌癥，特別是乳腺癌預(yù)后相關(guān)。在具體的實(shí)施方案中，所關(guān)注的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合在患者樣品中的選擇性超表達(dá)預(yù)示癌癥預(yù)后差。所謂″預(yù)示預(yù)后差″意指如本文定義的特定生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)與潛在癌癥或腫瘤的復(fù)發(fā)或再發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的可能性增加相關(guān)。例如，″預(yù)示預(yù)后差″可以指在5年，更特別的是10年內(nèi)潛在癌癥或腫瘤的復(fù)發(fā)或再發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的可能性增加。預(yù)示預(yù)后差的生物標(biāo)記在本文中稱(chēng)作″不良結(jié)果生物標(biāo)記″。在本發(fā)明的其它方面中，不存在所關(guān)注的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后良好。本文所用的″預(yù)示預(yù)后良好″意指如本文所定義的患者保持無(wú)癌的可能性增加。在某些實(shí)施方案中，″預(yù)示預(yù)后良好″意指在5年，更特別的是10年內(nèi)患者保持無(wú)癌的可能性增加。這類(lèi)生物標(biāo)記可以稱(chēng)作″良好結(jié)果生物標(biāo)記″。
本發(fā)明的生物標(biāo)記包括任何基因或蛋白質(zhì)，其超表達(dá)如本文所述與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。生物標(biāo)記包括預(yù)示乳腺癌預(yù)后差(即不良結(jié)果生物標(biāo)記)以及預(yù)示預(yù)后良好(即良好結(jié)果生物標(biāo)記)的基因和蛋白質(zhì)。特別關(guān)注的生物標(biāo)記包括參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期控制、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、編程性細(xì)胞死亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管發(fā)生/淋巴生成或轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)和基因。在某些實(shí)施方案中，所述的生物標(biāo)記調(diào)節(jié)涉及組織重建、胞外基質(zhì)降解和相鄰組織侵入的蛋白酶系統(tǒng)。盡管其超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后的任何生物標(biāo)記都可以用于實(shí)施本發(fā)明，但是在具體的實(shí)施方案中，生物標(biāo)記選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9、MCM6和p53組成的組。參見(jiàn)表43。在一個(gè)實(shí)施方案中，所關(guān)注的生物標(biāo)記包含SLPI、PSMB9、磷酸-p27、src、E2F1、p21ras或p53。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的方法包括檢測(cè)E2F1和SLPI的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些方法包括檢測(cè)E2F1、src和SLPI的表達(dá)，其中生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)E2F1、src、PSMB9和SLPI的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的至少兩種的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后差。在本發(fā)明的其它方面中，檢測(cè)E2F1、SLPI、PSMB9、p21ras和src的表達(dá)并且這些生物標(biāo)記中的至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括檢測(cè)患者樣品中SLPI、p21ras、E2F1、PSMB9、磷酸-p27和src的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的至少四種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所關(guān)注的生物標(biāo)記包含E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的方法包括檢測(cè)E2F1和SLPI的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括檢測(cè)E2F1、SLPI和PSMB9的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的至少兩種的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)E2F1、SLPI、MUC-1和src的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的至少兩種的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后差。在本發(fā)明的其它方面中，檢測(cè)E2F1、SLPI、MUC-1、src和p21ras的表達(dá)并且這些生物標(biāo)記中的至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括檢測(cè)患者樣品中E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的至少四種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。
分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)為一種非特異性抑制劑，它可以使大量蛋白酶失活，包括白細(xì)胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶G)。已知SLPI涉及與組織修復(fù)相關(guān)的炎癥和炎癥反應(yīng)。一般認(rèn)為蛋白酶抑制劑可抵抗進(jìn)行性腫瘤和轉(zhuǎn)移。然而，腫瘤中絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI′s)的表達(dá)通常與癌癥患者預(yù)后差相關(guān)。組織蛋白酶G在乳腺癌中超表達(dá)并且為預(yù)后差的指示物。其抑制作用通過(guò)防止上皮表面受到內(nèi)源性蛋白酶攻擊而促成免疫應(yīng)答。SLPI的基因位置為20q12，其為涉及乳腺癌染色體改變和非整倍性的染色體區(qū)。
PSMB9為蛋白酶體B-型家族，也稱(chēng)作T1B家族中的成員，為20S核心β-亞單位。該基因位于MHC(主要組織相容性復(fù)合物)的II類(lèi)區(qū)。該基因的表達(dá)由γ-干擾素誘導(dǎo)并且該基因產(chǎn)物置換了免疫蛋白酶體中的催化亞單位1(蛋白酶體β6亞單位)。需要蛋白酶解加工產(chǎn)生成熟亞單位。
NDRG-1(調(diào)節(jié)的N-Myc下游)在細(xì)胞分化過(guò)程中得到增量調(diào)節(jié)，被胚細(xì)胞中的N-myc和c-myc阻遏并且在幾種腫瘤細(xì)胞中得到抑制。超表達(dá)可能與缺氧和隨后誘導(dǎo)血管發(fā)生的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。缺氧導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)型因子1(HIF-1)蓄積，從而在缺氧誘導(dǎo)型基因，諸如那些用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和NDRG-1的基因的表達(dá)中達(dá)到頂點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)NDRG-1在某些乳腺癌中為超表達(dá)的mRNA。NDRG-1位于與c-myc基因相鄰的染色體8q24上。
MUC1為在大部分分泌上皮，包括乳腺和某些造血細(xì)胞上表達(dá)的大量O-糖基化跨膜蛋白。其在泌乳的乳腺中大量表達(dá)并且在90％以上的乳腺癌和轉(zhuǎn)移灶中超表達(dá)。在正常乳腺中，其在腺上皮的上表面上表達(dá)。
p27為細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物并且參與G1至S期進(jìn)展。它在G1期中與細(xì)胞周期蛋白E/cdk2復(fù)合物并且還與D-型細(xì)胞周期蛋白-cdks發(fā)生特異性相互作用。p27可以在蘇氨酸187上被Cdks磷酸化。p27在蘇氨酸187上的磷酸化還是細(xì)胞周期依賴(lài)性的，存在于增殖細(xì)胞中，但在G1細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到。在增殖細(xì)胞和許多類(lèi)型的侵害性人癌中觀察到p27降解的活化。p27的超表達(dá)可以導(dǎo)致編程性細(xì)胞死亡抑制和對(duì)某些化療的抗性。
蛋白酪氨酸激酶的Src家族(包括Src、Lyn、Fyn、Yes、Lck、Blk、Hck等)在調(diào)節(jié)真核細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中是重要的。Src活性受具有相反作用的兩個(gè)位點(diǎn)上的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)。激酶結(jié)構(gòu)域的活化環(huán)中Tyr416的磷酸化增量調(diào)節(jié)該酶。Csk對(duì)C-末端尾中的Tyr527的磷酸化使該酶的活性降低。
E2F1為涉及調(diào)節(jié)G1和S期細(xì)胞周期蛋白，特別是細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員。這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和控制DNA合成的Rb途徑。在細(xì)胞周期的G1期中，E2F轉(zhuǎn)錄因子在無(wú)活性復(fù)合物中結(jié)合Rb腫瘤抑制蛋白。在細(xì)胞周期的G1/S間界中，Rb蛋白高度磷酸化并且從其抑制復(fù)合物中釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子。然后E2F轉(zhuǎn)錄因子使那些負(fù)責(zé)細(xì)胞周期的S-期的基因的轉(zhuǎn)錄活化，從而主要導(dǎo)致啟動(dòng)DNA合成和準(zhǔn)備有絲分裂以及隨后的細(xì)胞分裂。已經(jīng)證實(shí)E2F1的超表達(dá)導(dǎo)致可能通過(guò)細(xì)胞周期蛋白D1-依賴(lài)性激酶活性抑制與誘導(dǎo)p16相關(guān)轉(zhuǎn)錄物結(jié)合誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。此外，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)E2F1，即E2F1蛋白水平也受泛素-蛋白體依賴(lài)性降解途徑控制。泛素化受到直接控制細(xì)胞周期進(jìn)展的方面的Rb和E2F1復(fù)合物阻斷。
p21ras為一大組涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞質(zhì)蛋白中的成員。鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)包含一大組涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的存在于真核細(xì)胞中的胞質(zhì)蛋白。存在兩種形式，即大的異源三聚體G蛋白和較小的單體。3種ras癌基因H-ras、K-ras和N-ras為較小的單體G蛋白中的成員并且分別位于染色體11、12和1上。它們編碼稱(chēng)作p21s的21-kD蛋白并且包含188個(gè)氨基酸。p21ras蛋白涉及正常的細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白酶活性和細(xì)胞粘著。
p21ras的三種形式通過(guò)使配體介導(dǎo)的胞外受體活化與胞內(nèi)酪氨酸激酶活化和隨后啟動(dòng)大量與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程聯(lián)合共同起作用，所述的細(xì)胞過(guò)程包括DNA復(fù)制、增殖和非附著依賴(lài)性生長(zhǎng)。K-和H-ras基因通常與乳腺癌最為相關(guān)。在這兩種ras基因中，密碼子12和13上的突變是常見(jiàn)的。這些功能獲得突變導(dǎo)致組成型活化，其使ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑內(nèi)正常的配體誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分開(kāi)。乳腺癌中不太常見(jiàn)的是N-ras的牽連。對(duì)乳腺癌中N-ras相關(guān)改變報(bào)導(dǎo)了兩種機(jī)制導(dǎo)致癌基因組成型活化的密碼子61上的突變，它與上述對(duì)K-和H-ras提及的突變類(lèi)似，和染色體擴(kuò)增。此外，除胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化外，還報(bào)導(dǎo)了ras癌基因誘導(dǎo)對(duì)組織重建和侵害而言重要的蛋白酶的超表達(dá)。H-ras涉及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)超表達(dá)，并且N-ras與MMP-9超表達(dá)相關(guān)。一般參見(jiàn)Correll和Zoll(1988)HumanGenetics 79225-259；Tong等(1989)Nature 33790-93；Watson等(1991)乳腺癌Res.Treat.17161-169；Dati等(1991)Int.J.Cancer 47833-838；Archer等(1995)Br.J.Cancer 721259-1266；Bland等(1995)Ann.Surg.221706-718；Shackney等(1998)Clin.Cancer Res.4913-928；和Gohring等(1999)Tumor Biol.20173-183，將所有這些文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。對(duì)p21ras蛋白的任何形式(即H-、K-、N-ras)的檢測(cè)包括在本發(fā)明內(nèi)。
微染色體維持(MCM)蛋白在真核DNA復(fù)制中起主要作用。MCM蛋白在其高度保守的中心結(jié)構(gòu)域中各自具有DNA-依賴(lài)性ATP酶基序。當(dāng)正常細(xì)胞從細(xì)胞周期的G0進(jìn)入G1/S期時(shí)，MCM蛋白的水平一般以可變方式增加。在G0期中，MCM2和MCM5蛋白遠(yuǎn)不如MCM7和MCM3蛋白豐富。MCM6與MCM2、MCM4和MCM7形成結(jié)合組蛋白H3的復(fù)合物。此外，MCM4、MCM6和MCM7的亞復(fù)合物具有解旋酶活性，這種活性由MCM6的ATP-結(jié)合活性和MCM4的DNA-結(jié)合活性介導(dǎo)。例如，參見(jiàn)Freeman等(1999)Clin.Cancer Res.52121-2132；Lei等(2001)J.Cell Sci.1141447-1454；Ishimi等(2003)Eur.J.Biochem.2701089-1101，將所有這些文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。
DARPP32為蛋白質(zhì)磷酸酶1的抑制劑，其生物功能和抑制活性通過(guò)DARPP32蛋白內(nèi)的特異性氨基酸殘基磷酸化得到調(diào)節(jié)。蘇氨酸34(T34)磷酸化使DARPP32蛋白成為特異性蛋白質(zhì)磷酸酶1抑制劑。然而，蘇氨酸75(T75)磷酸化使DARPP32成為蛋白激酶A(PKA)的抑制劑。DARPP32的基因位置為17q21.2，已知它與17q12上的her2/neu(c-erb-B2受體酪氨酸激酶)基因相鄰。該區(qū)涉及乳腺癌染色體擴(kuò)增和導(dǎo)致25-35％的乳腺癌中的結(jié)果差。幾篇出版物已經(jīng)證實(shí)乳腺癌中這種17q12-21擴(kuò)增子的特異性轉(zhuǎn)錄活化，其中大量基因位于超表達(dá)的這種擴(kuò)增子內(nèi)。
p53在細(xì)胞中起多種作用。高水平的野生型，而非突變型p53的表達(dá)存在兩種結(jié)果細(xì)胞周期停滯或編程性細(xì)胞死亡。DNA損傷劑誘導(dǎo)細(xì)胞中p53水平的觀察結(jié)果導(dǎo)致將p53定義為關(guān)卡因子，其可能與酵母中的fad9基因產(chǎn)物具有親緣關(guān)系。盡管對(duì)存活力而言并非必要，但是響應(yīng)于基因毒性應(yīng)激，p53作為″緊急制動(dòng)器″起作用，以便誘導(dǎo)停滯或編程性細(xì)胞死亡，從而防止基因組蓄積過(guò)量突變。與這一概念一致的是，已經(jīng)證實(shí)缺乏p53的細(xì)胞在遺傳上不穩(wěn)定，且由此更易發(fā)生腫瘤。p53蛋白位于細(xì)胞核中并且極不穩(wěn)定。p53在所有人體腫瘤的大約50％中，主要是在DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域密碼子中發(fā)生突變。
盡管已經(jīng)詳細(xì)討論了上述生物標(biāo)記，但是可以將其超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后的任何生物標(biāo)記用于實(shí)施本發(fā)明，包括本領(lǐng)域中尚未鑒定的生物標(biāo)記。這類(lèi)生物標(biāo)記包括例如參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期控制或癌癥活動(dòng)性和侵害的一般性機(jī)制的基因和蛋白質(zhì)?？赡荜P(guān)注的生物標(biāo)記包括環(huán)加氧酶-2(cox-2)、rhoC、c-myc、尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)、維爾姆斯腫瘤抑制基因、akt激酶和骨橋蛋白。例如，參見(jiàn)Perou等(2000)Nature 406747-752；Sorlie等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.9810869-10874；Van′t Veer等(2002)Nature415530-536；Huang等(2003)Lancet 3611590-1596，將所有這些文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。
在具體的實(shí)施方案中，所述的生物標(biāo)記為參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激酶，諸如PI3K調(diào)節(jié)a、LTk、Ser/thr激酶15、MAPK8IPI、MAPKAPK2和PK428、PRKR。生長(zhǎng)因子、胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和胞外基質(zhì)蛋白也為關(guān)注的生物標(biāo)記。這類(lèi)蛋白質(zhì)包括EGFR、TNF受體相關(guān)因子4、GFR結(jié)合蛋白7、ErbB2(her 2)、VEGF、GDF1、IGFBP5、EGF8 ras同源物、MMP 9、MMP 7、SLPI、角蛋白5、角蛋白17、層粘連蛋白γ2(層粘連蛋白V)、向?qū)幍鞍缀臀⒐艿鞍住?br> 在本發(fā)明的某些方面中，所述的生物標(biāo)記包含參與染色體濃縮和維持的基因和蛋白質(zhì)，諸如，例如Cc相關(guān)的，HMG非組蛋白染色體11，MMD5，MCM5，MCM6和Swi/snf相關(guān)肌動(dòng)蛋白。與著絲粒和中心體功能相關(guān)的生物標(biāo)記，包括CENPA、CENPF、CENPE、Bub 1、polo樣激酶和HsEg 5、MCAK和HSET也可以用于本文所述的方法。本發(fā)明的生物標(biāo)記還可以包含轉(zhuǎn)錄因子，特別是那些與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。所關(guān)注的轉(zhuǎn)錄因子包括，但不限于E2F1、E2F4、NDRG-1、ORC6L、PCNA、核因子1、EZH2和TFAP2A。細(xì)胞周期蛋白，諸如CDC20、CDC 25B、細(xì)胞周期蛋白A2、細(xì)胞周期蛋白E和細(xì)胞周期蛋白F也可以用于實(shí)施披露的方法。
盡管本發(fā)明的方法需要檢測(cè)患者樣品中的至少一種，更特別的是至少兩種生物標(biāo)記以便評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后，但是3，4，5，6，7，8，9，10或10種以上生物標(biāo)記也可以用于實(shí)施本發(fā)明。認(rèn)為檢測(cè)身體樣品中一種以上的生物標(biāo)記可以用于評(píng)價(jià)癌癥，特別是乳腺癌預(yù)后。因此，在某些實(shí)施方案中，使用兩種或多種生物標(biāo)記，更優(yōu)選兩種或多種互補(bǔ)生物標(biāo)記，所謂″互補(bǔ)″意指檢測(cè)身體樣品中生物標(biāo)記的組合導(dǎo)致在大于如果僅使用一種生物標(biāo)記鑒定的百分比的病例中準(zhǔn)確測(cè)定癌癥預(yù)后。因此，在某些情況中，可以通過(guò)使用至少兩種生物標(biāo)記對(duì)癌癥預(yù)后進(jìn)行更準(zhǔn)確的測(cè)定。因此，如果使用至少兩種生物標(biāo)記，那么針對(duì)于不同生物標(biāo)記蛋白的至少兩種抗體將用于實(shí)施本文披露的免疫組織化學(xué)方法?？梢允箍贵w同時(shí)或依次接觸身體樣品。
當(dāng)使用兩種或多種生物標(biāo)記的組合時(shí)，生物標(biāo)記一般在統(tǒng)計(jì)學(xué)上基本上彼此獨(dú)立。所謂″統(tǒng)計(jì)學(xué)上獨(dú)立的″生物標(biāo)記意指由此產(chǎn)生的預(yù)后是獨(dú)立的，使得一種生物標(biāo)記不會(huì)提供基本上重復(fù)的有關(guān)互補(bǔ)生物標(biāo)記方面的信息。例如，這可以確保生物標(biāo)記不與第一種生物標(biāo)記聯(lián)用，此時(shí)兩種生物標(biāo)記基本上是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上獨(dú)立的。兩種生物標(biāo)記的依賴(lài)性可以表明它們?yōu)槌蓪?duì)的并且添加第二種生物標(biāo)記不會(huì)對(duì)指定生物標(biāo)記對(duì)的預(yù)后能力附加額外的值。為了優(yōu)化指定組生物標(biāo)記的預(yù)后能力，還需要通過(guò)在與該組中另一種生物標(biāo)記比較時(shí)使提供復(fù)制的預(yù)后信息的生物標(biāo)記的應(yīng)用減少到最低限度來(lái)降低信號(hào)″噪聲″的量。用于測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)獨(dú)立性的方法為本領(lǐng)域中公知的?？梢允褂萌魏畏椒ㄔu(píng)價(jià)所關(guān)注的生物標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)學(xué)獨(dú)立性，包括，例如美國(guó)申請(qǐng)?zhí)枺撸邩?biāo)題為″分析和優(yōu)化癌癥預(yù)后的標(biāo)記候選物的方法和計(jì)算機(jī)程序(Methods and Computer Programs for Analysis and Optimizationof Marker Candidates for Cancer Prognosis)″中披露的方法，該申請(qǐng)與本申請(qǐng)同時(shí)提交并且將其完整地引入本文作為參考。如果彼此獨(dú)立，那么將預(yù)后生物標(biāo)記用于實(shí)施本發(fā)明的方法，通過(guò)檢測(cè)2，3，4，5，6，7或7種以上生物標(biāo)記的表達(dá)增加預(yù)后值。在這類(lèi)情況中，可以使用獨(dú)立的生物標(biāo)記的任何組合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還認(rèn)為可以將一組生物標(biāo)記用于按照本發(fā)明的方法評(píng)價(jià)乳腺癌患者的預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，提供了包含至少兩種生物標(biāo)記的一組，所述的生物標(biāo)記選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9、MCM6和p53組成的組。例如，具體的一組生物標(biāo)記可以包含E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9中的所有或亞組。一組生物標(biāo)記可以包含所關(guān)注的任何數(shù)量的生物標(biāo)記或其組合。在本發(fā)明的某些方面中，一組包含至少兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)上獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)記。
在具體的實(shí)施方案中，用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的方法包括收集患者身體樣品，優(yōu)選乳腺組織樣品，更優(yōu)選原發(fā)乳腺腫瘤組織樣品；使該樣品接觸至少一種對(duì)所關(guān)注的生物標(biāo)記具有特異性的抗體；檢測(cè)抗體結(jié)合并且測(cè)定所述的生物標(biāo)記是否得到超表達(dá)。即，將樣品與生物標(biāo)記抗體一起孵育足以形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)間，并且例如用標(biāo)記的二次抗體檢測(cè)抗體結(jié)合。正如根據(jù)抗體結(jié)合所確定的，將表現(xiàn)出至少一種不良結(jié)果的生物標(biāo)記的超表達(dá)的樣品分類(lèi)為具有差的預(yù)后。類(lèi)似地，將展示出至少一種良好結(jié)果的生物標(biāo)記的患者樣品分類(lèi)為具有良好的預(yù)后。此外，某些所關(guān)注的生物標(biāo)記組合的超表達(dá)特別用于區(qū)分具有差預(yù)后的乳腺癌患者與那些具有良好預(yù)后的乳腺癌患者。在本發(fā)明的某些方面中，所述的方法包括檢測(cè)患者樣品中的兩種或多種生物標(biāo)記并且測(cè)定所述生物標(biāo)記是否得到超表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中的所有或某些亞組的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法包括檢測(cè)SLPI、p21ras、E2F1、PSMB9、磷酸-p27和src的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中至少四種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所述的方法包括檢測(cè)SLPI、E2F1和src的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在其它實(shí)施方案中，所述的方法包括檢測(cè)E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中至少四種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所述的方法包括檢測(cè)SLPI、E2F1和MUC-1的表達(dá)，其中這些生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。
所謂″身體樣品″意指細(xì)胞、組織或體液的任何取樣，其中可以檢測(cè)生物標(biāo)記的表達(dá)。這類(lèi)身體樣品的實(shí)例包括，但不限于血液、淋巴、尿、婦科液體、活檢組織和涂片。用于本發(fā)明的體液包括血液、尿、唾液、乳頭吸出物或任何其它身體分泌物或其衍生物。血液可以包括全血、血漿、血清或血液的任何衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，身體樣品包含乳腺細(xì)胞，特別是來(lái)自活檢組織的乳腺組織，更特別的是乳腺腫瘤組織樣品。身體樣品可以通過(guò)各種技術(shù)獲自患者，例如通過(guò)刮取或拭抹區(qū)域，通過(guò)使用針頭抽吸體液或通過(guò)取出組織樣品(即，活組織檢查)。用于收集各種身體樣品的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。在某些實(shí)施方案中，例如，通過(guò)細(xì)針抽吸活組織檢查、磁芯針活組織檢查或切除活組織檢查獲得乳腺組織樣品。可以將固定和染色溶液施用于細(xì)胞或組織上以便保存樣本和有利于檢查?？梢詫⑸眢w樣品，特別是乳腺組織樣品轉(zhuǎn)至載玻片上以便在放大倍數(shù)下觀察。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，身體樣品為福爾馬林固定的石蠟包埋的乳腺組織樣品，特別是原發(fā)性乳腺腫瘤樣品。
本文包括用于檢測(cè)生物標(biāo)記表達(dá)的本領(lǐng)域中可利用的任何方法?？梢栽诤怂崴交虻鞍踪|(zhì)水平上檢測(cè)本發(fā)明生物標(biāo)記的表達(dá)。所謂″檢測(cè)表達(dá)″意指測(cè)定生物標(biāo)記基因或蛋白質(zhì)的量或存在。因此，″檢測(cè)表達(dá)″包括經(jīng)測(cè)定生物標(biāo)記未得到表達(dá)，未得到可檢測(cè)性表達(dá)，以低水平表達(dá)，以正常水平表達(dá)或超表達(dá)的情形。為了測(cè)定超表達(dá)，可以將待檢查的身體樣品與來(lái)源于健康人的相應(yīng)身體樣品進(jìn)行比較。即，表達(dá)的″正?！逅綖樵诶鐏?lái)自未患有乳腺癌的人受試者或患者的乳腺組織樣品中生物標(biāo)記的表達(dá)水平。這種樣品可以以標(biāo)準(zhǔn)化形式存在。在某些實(shí)施方案中，測(cè)定生物標(biāo)記超表達(dá)無(wú)需在身體樣品與來(lái)源于健康人的相應(yīng)身體樣品之間進(jìn)行比較。例如，檢測(cè)乳腺腫瘤樣品中的預(yù)示預(yù)后差的生物標(biāo)記的超表達(dá)可以排除對(duì)與來(lái)源于健康人的相應(yīng)乳腺組織樣品進(jìn)行比較的需要。此外，在本發(fā)明的某些方面中，所關(guān)注的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合沒(méi)有表達(dá)，過(guò)低表達(dá)或正常表達(dá)(即不存在超表達(dá))提供了有關(guān)乳腺癌患者預(yù)后的有用的信息。
用于評(píng)價(jià)本發(fā)明生物標(biāo)記表達(dá)的方法包括以核酸或蛋白質(zhì)水平測(cè)定生物標(biāo)記的量或存在的任何方法。這類(lèi)方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且包括，但不限于蛋白質(zhì)印跡、RNA印跡、DNA印跡、ELISA、免疫沉淀、免疫熒光、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、免疫組織化學(xué)、核酸雜交技術(shù)、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法和核酸擴(kuò)增方法。在具體的實(shí)施方案中，例如，使用針對(duì)于特異性生物標(biāo)記蛋白的抗體在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)生物標(biāo)記的表達(dá)。這些抗體可以用于各種方法，諸如蛋白質(zhì)印跡、ELISA、免疫沉淀或免疫組織化學(xué)技術(shù)。同樣，可以將乳腺組織，特別是乳腺腫瘤組織的免疫染色與臨床信息評(píng)價(jià)、常規(guī)預(yù)后方法和本領(lǐng)域公知的分子標(biāo)記(例如Her2/neu、Ki67、p53和激素受體狀態(tài))的表達(dá)聯(lián)用。以這種方式，披露的方法可以允許更準(zhǔn)確的確定乳腺癌預(yù)后。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將對(duì)生物標(biāo)記蛋白具有特異性的抗體用于檢測(cè)身體樣品中生物標(biāo)記蛋白的表達(dá)。所述的方法包括從患者獲得身體樣品，使該身體樣品接觸至少一種針對(duì)于SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9或MCM6的抗體并且檢測(cè)抗體結(jié)合以便確定生物標(biāo)記是否在患者樣品中超表達(dá)。生物標(biāo)記蛋白的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后，更特別的是不良的乳腺癌預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中生物標(biāo)記中的至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后。這類(lèi)方法可以包含檢測(cè)患者樣品中的多種生物標(biāo)記，其中這些生物標(biāo)記中的所有或亞組的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的免疫組織化學(xué)技術(shù)。具體地說(shuō)，所述的方法包括對(duì)乳腺組織樣品，更特別的是乳腺腫瘤樣品中預(yù)示預(yù)后的生物標(biāo)記進(jìn)行抗體染色。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為下文披露的免疫組織化學(xué)方法可以手動(dòng)或例如，使用自動(dòng)染色機(jī)通用染色系統(tǒng)(Autostainer Universal Staining System)(Dako)以自動(dòng)化方式進(jìn)行。實(shí)施例1中提供了用于乳腺組織樣品的抗體染色(即，免疫組織化學(xué))的一種方案。
在一種免疫組織化學(xué)方法中，例如，通過(guò)本領(lǐng)域已知的活組織檢查技術(shù)采集患者乳腺組織樣品。冷凍樣品以便隨后制備或即刻放入固定溶液中?？梢酝ㄟ^(guò)用試劑，諸如福爾馬林、戊二醛(gluteraldehyde)、甲醇等處理固定組織樣品并且包埋在石蠟中。用于由福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品制備免疫組織化學(xué)分析用載玻片的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。
在某些實(shí)施方案中，特別是本發(fā)明的免疫組織化學(xué)方法中，樣品可能需要修飾以使生物標(biāo)記抗原易于進(jìn)行抗體結(jié)合。例如，組織樣品的福爾馬林固定導(dǎo)致蛋白質(zhì)廣泛交聯(lián)，這可能導(dǎo)致對(duì)抗原位點(diǎn)的掩蔽或破壞和隨后抗體染色弱。本文所用的″抗原回收″或″抗原暴露″意指用于增加抗原易接近性或回收例如福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品中的抗原性。用于使抗原更易于進(jìn)行抗體結(jié)合的任何方法都可以用于實(shí)施本發(fā)明，包括那些本領(lǐng)域中已知的抗原回收方法。例如，參見(jiàn)Hanausek和Walaszek，eds.(1998)Tumor Marker Protocols(HumanaPress，Inc.，Totowa，New Jersey)；和Shi等，eds.(2000)AntigenRetrieval TechniquesImmunohistochemistry and MolecularMorphology(Eaton Publishing，Natick，MA)，將這兩篇文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。
抗原回收方法包括，但不限于用蛋白酶(例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等)或抗原回收溶液處理。例如，所關(guān)注的抗原回收溶液包括檸檬酸鹽緩沖液，pH 6.0(Dako)；tris緩沖液，pH 9.5(Biocare)；EDTA，pH 8.0(Biocare)；L.A.B.(″LiberateAntibodyBinding Solution；″Polysciences)；抗原回收Glyca溶液(Biogenex)；檸檬酸鹽緩沖溶液，pH 4.0(Zymed)；Dawn洗滌劑(Proctor & Gamble)；去離子水；和2％冰醋酸。在某些實(shí)施方案中，抗原回收包括將抗原回收溶液施用在福爾馬林固定的組織樣品上且然后在烘箱(例如，60℃)、蒸氣發(fā)生器(例如，95℃)或加壓蒸煮器(例如，120℃)內(nèi)和在規(guī)定的溫度下將該樣品加熱確定的時(shí)間期限。在本發(fā)明的其它方面中，抗原回收可以在室溫下進(jìn)行。孵育時(shí)間隨選擇的具體抗原回收溶液和孵育溫度的不同而改變。例如，可以將抗原回收溶液施用在樣品上短至5，10，20或30分鐘或長(zhǎng)達(dá)過(guò)夜。確定合適的抗原回收溶液和最佳孵育時(shí)間和溫度的試驗(yàn)設(shè)計(jì)為標(biāo)準(zhǔn)的并且完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的能力范圍。
在抗原回收后，使用合適的封閉劑，例如過(guò)氧化氫封閉樣品。然后將針對(duì)于所關(guān)注的生物標(biāo)記的抗體與樣品一起孵育足以使抗原-抗體結(jié)合的時(shí)間。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在某些情況中，可以通過(guò)檢測(cè)患者樣品中一種以上生物標(biāo)記的超表達(dá)而獲得更為準(zhǔn)確的乳腺癌預(yù)后。因此，在具體的實(shí)施方案中，將針對(duì)于兩種不同生物標(biāo)記的至少兩種抗體用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者的預(yù)后。如果使用一種以上的抗體，那么可以將這些抗體作為單獨(dú)抗體試劑依次或作為抗體混合物同時(shí)加入到單一樣品中?；蛘撸梢詫⒏鲉为?dú)抗體加入到來(lái)自單一患者樣品的單獨(dú)的組織切片中并且匯集所得數(shù)據(jù)。
用于檢測(cè)抗體結(jié)合的技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知。可以通過(guò)使用化學(xué)試劑檢測(cè)與所關(guān)注的生物標(biāo)記結(jié)合的抗體，所述的化學(xué)試劑產(chǎn)生相當(dāng)于抗體結(jié)合水平和由此相當(dāng)于生物標(biāo)記蛋白表達(dá)水平的可檢測(cè)信號(hào)。例如，可以通過(guò)使用與標(biāo)記的聚合物綴合的二次抗體檢測(cè)抗體結(jié)合。標(biāo)記的聚合物的實(shí)例包括，但不限于聚合物-酶綴合物。這些復(fù)合物中的酶一般用于催化抗原-抗體結(jié)合位點(diǎn)上色原的沉積，由此產(chǎn)生相當(dāng)于所關(guān)注生物標(biāo)記的表達(dá)水平的細(xì)胞染色。特別關(guān)注的酶包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。商品抗體檢測(cè)系統(tǒng)，諸如，例如DakoEnvision+系統(tǒng)和Biocare Medical′s Mach 3系統(tǒng)可以用于實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明的一種免疫組織化學(xué)方法中，通過(guò)使用與二次抗體綴合的HRP標(biāo)記的聚合物檢測(cè)與生物標(biāo)記結(jié)合的抗體。使用色原3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)對(duì)載玻片中的抗體結(jié)合進(jìn)行染色且然后用蘇木精，并且可選地用上藍(lán)劑，諸如氫氧化銨復(fù)染。在本發(fā)明的某些方面中，由病理學(xué)家通過(guò)顯微鏡觀察載玻片以便評(píng)價(jià)細(xì)胞染色(即，生物標(biāo)記超表達(dá))并且評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后。或者，通過(guò)自動(dòng)化顯微鏡檢查法或由工作人員借助于有利于鑒定陽(yáng)性染色細(xì)胞的計(jì)算機(jī)軟件觀察樣品。
術(shù)語(yǔ)″抗體″廣泛包括抗體和重組抗體的天然存在形式，諸如單鏈抗體、嵌合和人源化抗體以及多特異性抗體和所有上述抗體的片段和衍生物，這些片段和衍生物至少具有抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w衍生物可以包含與抗體綴合的蛋白質(zhì)或化學(xué)部分。
″抗體″和″免疫球蛋白″(Igs)為具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。盡管抗體表現(xiàn)出對(duì)抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括這兩種抗體和其它缺乏抗原特異性的抗體樣分子。后一種類(lèi)型的多肽類(lèi)例如以低水平由淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生并且以增加水平由骨髓瘤產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)″抗體″以其最廣泛的含義使用并且涵蓋完全裝配的抗體，可以結(jié)合抗原的抗體片段(例如Fab′、F′(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙抗體)和包含上述的重組肽類(lèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)″單克隆抗體″意指獲自一群基本上同種抗體的抗體，即，包含該群體的各個(gè)抗體相同，但是可能有可以以最少量存在的天然存在的突變。
″抗體片段″包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線(xiàn)性抗體(Zapata等(1995)Protein Eng.8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩種相同的各自帶有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合片段，稱(chēng)作″Fab″片段；和殘留″Fc″片段，其名稱(chēng)反映出它易于結(jié)晶35的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并且仍然能夠交聯(lián)抗原的F(ab′)2片段。
″Fv″為含有完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類(lèi)中，該區(qū)由緊密非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單鏈Fv種類(lèi)中，一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)可以通過(guò)柔性肽接頭共價(jià)連接，使得該輕鏈和重鏈可以以與雙鏈Fv種類(lèi)類(lèi)似的″二聚化″結(jié)構(gòu)形式結(jié)合。在該構(gòu)型中，每種可變區(qū)中的三個(gè)CDRs相互作用以確定VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDRs共同賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變區(qū)(或僅包含3個(gè)對(duì)抗原具有特異性的CDRs的一半Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，不過(guò)，親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab片段不同于Fab′片段之處在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端上增加了幾個(gè)殘基，包括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體絞鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab′-SH為本文對(duì)其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab′的命名。F(ab′)2抗體片段最初作為Fab′片段對(duì)產(chǎn)生，在它們之間存在鉸鏈半胱氨酸。
可以使用Kohler等(1975)Nature 256495-496的方法或其改進(jìn)的方法制備單克隆抗體。一般而言，使用含有抗原的溶液對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種。通過(guò)在鹽水，優(yōu)選在佐劑，諸如弗氏完全佐劑中混合或乳化含抗原的溶液并且通過(guò)非腸道注射該混合物或乳液進(jìn)行免疫接種。本領(lǐng)域中已知的任何免疫接種方法都可以用于獲得本發(fā)明的單克隆抗體。在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種后，摘除脾(和任選幾個(gè)大的淋巴結(jié))并且分離成單細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)將細(xì)胞混懸液在用所關(guān)注的抗原包被的平板或孔上涂布來(lái)篩選脾細(xì)胞。表達(dá)對(duì)抗原具有特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞結(jié)合平板并且不被沖洗掉。然后誘導(dǎo)所得的B細(xì)胞或所有分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤并且在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)連續(xù)稀釋將所得細(xì)胞鋪板并且檢測(cè)特異性結(jié)合所關(guān)注的抗原(且不結(jié)合無(wú)關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生。然后在體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或空心纖維反應(yīng)器中)或在體內(nèi)(如小鼠的腹水)培養(yǎng)選擇的分泌單克隆抗體(mAb)的雜交瘤。
作為使用雜交瘤的備選，正如美國(guó)專(zhuān)利US5,545,403；US5,545,405；和US5,998,144中披露的，可以在細(xì)胞系，諸如CHO細(xì)胞系中產(chǎn)生抗體，將上述專(zhuān)利引入本文作為參考。簡(jiǎn)言之，用能夠分別表達(dá)輕鏈和重鏈的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。通過(guò)在單獨(dú)的載體上轉(zhuǎn)染兩種蛋白質(zhì)，可以產(chǎn)生嵌合抗體。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于抗體的正確糖基化。還可以通過(guò)用生物標(biāo)記蛋白篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如，抗體噬菌體展示文庫(kù))而由此分離結(jié)合該生物標(biāo)記蛋白的免疫球蛋白文庫(kù)成員來(lái)鑒定和分離單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒為商購(gòu)的(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)(RecombinantPhage Antibody System)，目錄號(hào)27-9400-01；和StratageneSurfZAP 9噬菌體展示試劑盒(Phage Display Kit)，目錄號(hào)240612)。另外，適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)例可以在下列文獻(xiàn)中找到美國(guó)專(zhuān)利US 5,223,409；PCT公開(kāi)號(hào)WO92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；93/01288；WO 92/01047；92/09690；和90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology91370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 381-85；Huse等(1989)Science 2461275-1281；Griffiths等(1993)EMSO J.12725-734。
可以通過(guò)用生物標(biāo)記蛋白免疫原免疫接種合適的受試者(例如家兔、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)制備多克隆抗體。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如使用應(yīng)用固定化生物標(biāo)記蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)隨時(shí)間的推移監(jiān)測(cè)免疫接種的受試者中的抗體滴度。在免疫接種后的合適的時(shí)間，例如在抗體滴度為最高時(shí)，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以獲自該受試者并且用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497描述的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等(1983)Immunol.Today472)，EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，ed.Reisfeld和Sell(Alan R.Liss，Inc.，New York，NY)，pp.77-96)或三源雜交瘤技術(shù)。用于產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)為眾所周知的(一般參見(jiàn)Coligan等，eds.(1994)Current Protocols inImmunology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY)；Galfre等(1977)Nature 26655052；Kenneth(1980)Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses(Plenum Publishing Corp.，NY；和Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54387-402)。
本發(fā)明的組合物進(jìn)一步包含特異性結(jié)合所關(guān)注的生物標(biāo)記蛋白的單克隆抗體及其變體和片段。例如，提供了對(duì)SLPI(命名為克隆5G6.24)、DARPP-32(8G11.20)、MGC 14832(1F3.9和2D1.14)、NDRG-1(10A9.34)、PSMB9(3A2.4)和MUC-1(16E 3.3)具有特異性的單克隆抗體?？梢匀缦挛乃鲇每蓹z測(cè)物質(zhì)標(biāo)記該單克隆抗體以便有利于樣品中生物標(biāo)記蛋白的檢測(cè)。這類(lèi)抗體可應(yīng)用于實(shí)施本發(fā)明的方法。具有本文披露的抗體結(jié)合特性的單克隆抗體也包括在本發(fā)明中。組合物進(jìn)一步包含單克隆抗體的抗原結(jié)合變體和片段、產(chǎn)生這些抗體的雜交瘤細(xì)胞系和編碼這些單克隆抗體的氨基酸序列的分離的核酸分子。
還提供了具有本發(fā)明單克隆抗體結(jié)合特性的抗體?！褰Y(jié)合特性″或″結(jié)合特異性″在用于提及抗體時(shí)意指該抗體識(shí)別與對(duì)比抗體相同或相似的抗原表位。這類(lèi)抗體的實(shí)例包括例如，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中與本發(fā)明單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定一種抗體是否干擾另一種抗體。
所謂″表位″意指產(chǎn)生抗體并且與抗體結(jié)合的抗原分子的一部分。表位可以包含線(xiàn)性氨基酸殘基(即，表位內(nèi)的殘基以線(xiàn)性方式接連地依次排列)，非線(xiàn)性氨基酸殘基(本文稱(chēng)作″非線(xiàn)性表位″；這些表位不依次排列)，或線(xiàn)性和非線(xiàn)性的氨基酸殘基兩者。一般而言，表位為短的氨基酸序列，例如約5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。用于鑒定表位的系統(tǒng)技術(shù)為本領(lǐng)域中已知的并且例如描述在美國(guó)專(zhuān)利US 4,708,871中。簡(jiǎn)言之，可以合成一組來(lái)源于抗原的重疊寡肽類(lèi)并且使之與固相針陣列結(jié)合，其中在各針上有獨(dú)特的寡肽。針陣列可以包含96-孔微量滴定板，從而允許同時(shí)檢測(cè)所有的96種例如用于結(jié)合生物標(biāo)記特異性單克隆抗體的寡肽類(lèi)?；蛘撸衫媚壳翱缮藤?gòu)的噬菌體展示文庫(kù)試劑盒(NewEngland BioLabs)進(jìn)行表位作圖。使用這些方法，可以測(cè)定對(duì)每一可能亞組的連續(xù)氨基酸的結(jié)合親和力以便鑒定指定抗體所結(jié)合的表位。還可以在將表位長(zhǎng)度肽序列用于免疫接種從中獲得抗體的動(dòng)物時(shí)，通過(guò)推定鑒定表位。
進(jìn)一步提供了本文披露的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段和變體。這類(lèi)變體將保持親代抗體的所需結(jié)合特性。用于制備抗體片段和變體的方法為本領(lǐng)域中一般可獲得的。例如，可以通過(guò)在編碼所關(guān)注的抗體的克隆的DNA序列中進(jìn)行突變制備本文所述的單克隆抗體的氨基酸序列變體。用于誘變和核苷酸序列改變的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。例如，參見(jiàn)Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)MethodsEnzymol.154367-382；Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Harbor，New York)；美國(guó)專(zhuān)利US4,873,192；及其中引述的參考文獻(xiàn)；將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。可以在Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)的模型中找到關(guān)于不影響所關(guān)注多肽的生物活性的合適的氨基酸置換的指導(dǎo)，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。可以?xún)?yōu)選保守置換，諸如一種氨基酸與另一種具有相似特性的氨基酸交換。保守置換的實(shí)例包括，但不限于Gly<＝>Ala；Val<＝>Ile<＝>Leu；Asp<＝>Glu；Lys<＝>Arg，Asn<＝>Gln；和Phe<＝>Trp<＝>Tyr。
在構(gòu)建所關(guān)注的抗體多肽變體的過(guò)程中，進(jìn)行修飾，以便變體持續(xù)具有所需的活性，即，對(duì)生物標(biāo)記的相似的結(jié)合親和力。顯然，在編碼變體多肽的DNA中進(jìn)行的任何突變都不一定將該序列置于讀框范圍外并且優(yōu)選不會(huì)建立可能產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP75,444。
優(yōu)選，參比生物標(biāo)記抗體的變體具有的氨基酸序列與參比抗體分子或與參比抗體分子的較短部分的氨基酸序列具有至少70％或75％的序列同一性，優(yōu)選至少80％或85％的序列同一性，更優(yōu)選至少90％，91％，92％，93％，94％或95％的序列同一性。更優(yōu)選，所述的分子共有至少96％，97％，98％或99％的序列同一性。就本發(fā)明的目的而言，使用Smith-Waterman同源性檢索規(guī)則系統(tǒng)測(cè)定序列同一性百分比，其中使用緊密相鄰的缺口檢索，且缺口打開(kāi)罰分為12和缺口延長(zhǎng)罰分為2，BLOSUM矩陣為62。Smith-Waterman同源性檢索規(guī)則系統(tǒng)教導(dǎo)于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482-489中。例如，變體與參比抗體不同的方面為可以少至1-15個(gè)氨基酸殘基，少至1-10個(gè)氨基酸殘基，諸如6-10個(gè)，少至5個(gè)，少至4，3，2個(gè)乃至1個(gè)氨基酸殘基。
在兩種氨基酸序列的最佳序列比對(duì)方面，變體氨基酸序列的連續(xù)片段與參比氨基酸序列相比可以具有增加的氨基酸殘基或缺失的氨基酸殘基。用于與參比氨基酸序列比較的連續(xù)片段包括至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，并且可以為30，40，50或50個(gè)以上氨基酸殘基?？梢詫?duì)與保守殘基置換或缺口相關(guān)的序列同一性進(jìn)行校準(zhǔn)(參見(jiàn)Smith-Waterman同源性檢索規(guī)則系統(tǒng))。
選擇對(duì)所關(guān)注的生物標(biāo)記蛋白具有特異性的用于實(shí)施本發(fā)明的抗體。用于制備抗體和篩選合適的抗體的方法為本領(lǐng)域中已知的。例如，參見(jiàn)Celis，ed.(印刷中)Cell Biology & Laboratory Handbook，3rdedition(Academic Press，New York)，將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。在某些實(shí)施方案中，針對(duì)于特異性生物標(biāo)記蛋白的商品抗體可以用于實(shí)施本發(fā)明?？梢曰谒璧慕M織學(xué)樣品染色選擇本發(fā)明的抗體。即，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用關(guān)注的最終樣品類(lèi)型(例如福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺腫瘤組織樣品)并且針對(duì)結(jié)合特異性選擇抗體。
在本發(fā)明的某些方面中，通過(guò)多步驟篩選過(guò)程選擇和純化針對(duì)于所關(guān)注的特定的生物標(biāo)記的抗體。在具體的實(shí)施方案中，篩選polydoma以便鑒定具有所需特異性和靈敏性特性的生物標(biāo)記-特異性抗體。本文所用的″polydoma″意指多雜交瘤。一般將本發(fā)明的polydoma提供于多孔組織培養(yǎng)平板中。在初始抗體篩選步驟中，使用一組包含正常(即，非癌性)乳腺組織和I、II、III和IV期乳腺腫瘤樣品的各個(gè)載玻片或腫瘤組織微陣列。用于在單個(gè)載玻片上產(chǎn)生多組織陣列的方法和設(shè)備，諸如ChemiconAdvanced Tissue Arrayer為本領(lǐng)域中已知的。例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US4,820,504。使用標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)來(lái)自含有polydoma的各孔的未稀釋上清液檢測(cè)陽(yáng)性染色。在這一初始篩選步驟，基本上忽略了背景的非特異性結(jié)合。選擇產(chǎn)生陽(yáng)性染色的Polydoma并且用于二期抗體篩選。
在第二個(gè)篩選步驟中，對(duì)陽(yáng)性polydoma進(jìn)行有限稀釋過(guò)程。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)所得的未篩選的抗體以便對(duì)具有已知5-年結(jié)果的乳腺腫瘤組織樣品進(jìn)行陽(yáng)性染色。為了達(dá)到該目的，產(chǎn)生組織微陣列，其包含正常乳腺組織，具有已知良好5年結(jié)果的早期階段乳腺腫瘤樣品，具有已知不良5年結(jié)果的早期階段乳腺腫瘤樣品，正常非乳腺組織和癌性非乳腺組織。在該步驟，背景染色是有關(guān)聯(lián)的并且僅選擇對(duì)異常細(xì)胞(即，癌細(xì)胞)染色為陽(yáng)性的候選polydoma用于進(jìn)一步分析以便鑒定可區(qū)分良好和不良結(jié)果患者樣品的抗體。
將陽(yáng)性染色培養(yǎng)物制備成各個(gè)克隆以便選擇各個(gè)單克隆抗體候選物。用于分離各個(gè)克隆和通過(guò)親和吸附色譜法純化抗體的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。進(jìn)一步分析各個(gè)克隆以便確定最優(yōu)化抗原回收條件和操作稀釋度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為需要優(yōu)化染色試劑和條件，例如抗體滴度和檢測(cè)化學(xué)參數(shù)，以便使特定抗體的信噪比最大化。測(cè)定使與本發(fā)明的生物標(biāo)記特異性結(jié)合最大化并且將非特異性結(jié)合(或″背景″)減少至最低限度的抗體濃度。在具體的實(shí)施方案中，通過(guò)最初對(duì)福爾馬林固定的石蠟包埋的正常和癌性乳腺組織樣品測(cè)試不同抗體稀釋液來(lái)確定合適的抗體滴度。優(yōu)化抗體滴度和檢測(cè)條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)為標(biāo)準(zhǔn)的并且完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。某些抗體需要額外的優(yōu)化以便減少背景染色和/或增加染色的特異性和靈敏性。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為用于實(shí)施本發(fā)明方法的特定抗體濃度根據(jù)諸如結(jié)合時(shí)間、抗體對(duì)生物標(biāo)記蛋白的特異性水平和身體樣品制備方法這類(lèi)因素的不同而改變。此外，當(dāng)將多種抗體用于單一樣品時(shí)，所需濃度可能受到抗體施用于樣品的次序影響，即，作為混合物同時(shí)施用還是作為單獨(dú)的抗體試劑依次施用。此外，還必須優(yōu)化用于使結(jié)合所關(guān)注生物標(biāo)記的抗體顯現(xiàn)的檢測(cè)化學(xué)以便產(chǎn)生所需的信噪比。用于免疫組織化學(xué)染色試劑和條件的優(yōu)化的一個(gè)實(shí)例描述在實(shí)施例6中。
通過(guò)使抗體與可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)可以有利于對(duì)抗體結(jié)合的檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；且合適的放射性物質(zhì)的實(shí)例包括125I、131I、35S或3H。
就在本發(fā)明的免疫組織化學(xué)方法中檢測(cè)抗體染色而言，本領(lǐng)域中還存在用于定量測(cè)定生物樣品中多分子種類(lèi)(例如生物標(biāo)記蛋白)的量的視頻顯微鏡檢查和軟件方法，其中存在的各分子種類(lèi)由具有特定顏色的有代表性的染料標(biāo)記指示。這類(lèi)方法在本領(lǐng)域中還稱(chēng)作比色分析法。在這些方法中，視頻顯微鏡檢查用于提供染色后生物樣品影像以便視覺(jué)顯示存在所關(guān)注的特定生物標(biāo)記。這些方法中的某些披露了成像系統(tǒng)和相關(guān)軟件在基于存在的有代表性的顏色染料標(biāo)記測(cè)定存在的各分子種類(lèi)的相對(duì)量中的應(yīng)用，如分別由通過(guò)成像系統(tǒng)和相關(guān)軟件測(cè)定的那些顏色染料標(biāo)記的光密度或透射率值所指示的，所述的某些方法諸如Marcelpoil等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US09/957,446和Marcelpoil等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US10/057,729中披露的那些方法。這些技術(shù)提供了使用單一視頻影像定量測(cè)定染色的生物樣品中各分子種類(lèi)的相對(duì)量的方法，所述的單一視頻影像被″解構(gòu)″成其組分顏色部分。
本發(fā)明的方法可以與用于檢測(cè)生物標(biāo)記表達(dá)的成像系統(tǒng)和相關(guān)軟件聯(lián)用。可以基于用于與本申請(qǐng)同時(shí)提交的標(biāo)題為″分析和優(yōu)化癌癥預(yù)后的標(biāo)記候選物的方法和計(jì)算機(jī)程序″的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枴信兜姆椒ê陀?jì)算機(jī)程序選擇用于本發(fā)明方法的生物標(biāo)記，并且將該文獻(xiàn)完整地引入作為參考。本文披露的方法可以用于研發(fā)用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的規(guī)則系統(tǒng)。
在其它實(shí)施方案中，在核酸水平上檢測(cè)所關(guān)注的生物標(biāo)記的表達(dá)。用于評(píng)價(jià)表達(dá)的基于核酸的技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知的并且包括例如測(cè)定身體樣品中生物標(biāo)記mRNA的水平。許多表達(dá)檢測(cè)方法使用分離的RNA?？梢詫⒉会槍?duì)mRNA的分離選擇的任何RNA分離技術(shù)用于純化RNA(例如，參見(jiàn)Ausubel等，ed.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York 1987-1999)。另外，易于使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)加工大量組織樣品，諸如，例如Chomczynski的單步RNA分離法(1989，美國(guó)專(zhuān)利US4,843,155)。
術(shù)語(yǔ)″探針″意指能夠選擇性結(jié)合具體指定的靶生物分子，例如，核苷酸轉(zhuǎn)錄物或由生物標(biāo)記編碼或相當(dāng)于生物標(biāo)記的蛋白質(zhì)的任何分子。探針可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員合成或來(lái)源于合適的生物制品?？梢跃唧w設(shè)計(jì)用于標(biāo)記的探針?？梢杂米魈结樀姆肿拥膶?shí)例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白質(zhì)、抗體和有機(jī)分子。
在雜交或擴(kuò)增試驗(yàn)中可以使用分離的mRNA，所述的雜交或擴(kuò)增試驗(yàn)包括，但不限于DNA或RNA印跡分析、聚合酶鏈反應(yīng)分析和探針陣列。用于檢測(cè)mRNA水平的一種方法包括使分離的mRNA接觸可以與由待檢測(cè)的基因編碼的mRNA雜交的核酸分子(探針)。例如，核酸探針可以為全長(zhǎng)cDNA或其部分，諸如至少7，15，30，50，100，250或500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度和足以在嚴(yán)格條件下與編碼本發(fā)明生物標(biāo)記的mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸。mRNA與探針雜交表明所述的生物標(biāo)記得到表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，mRNA被固定在固相表面上并且例如通過(guò)在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行分離的mRNA并且將來(lái)自凝膠的mRNA轉(zhuǎn)至膜，諸如硝化纖維素上接觸探針。在備選的實(shí)施方案中，探針被固定在固相表面上并且使mRNA在例如Affymetrix基因芯片陣列中接觸探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于采取已知的mRNA檢測(cè)方法用于檢測(cè)由本發(fā)明的生物標(biāo)記編碼的mRNA水平。
用于測(cè)定樣品中生物標(biāo)記mRNA水平的備選方法包括核酸擴(kuò)增過(guò)程，例如通過(guò)RT-PCR(Mullis，1987，美國(guó)專(zhuān)利US 4,683,202中所述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案)、連接酶鏈反應(yīng)(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88189-193)、自我持續(xù)序列復(fù)制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)、Q-β復(fù)制酶(Lizardi等.，1988，Bio/Technology 61197)、滾環(huán)復(fù)制(Lizardi等.，美國(guó)專(zhuān)利US5,854,033)或任何其它核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行，隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子。這些檢測(cè)方案尤其可用于檢測(cè)核酸分子，條件是這類(lèi)分子以極低數(shù)量存在。在本發(fā)明的具體方面中，通過(guò)定量熒光RT-PCR(即，TaqManSystem)評(píng)價(jià)生物標(biāo)記表達(dá)。
可以使用膜印跡(諸如用于雜交分析，諸如RNA印跡、DNA印跡、斑點(diǎn)印跡等)或微孔、樣品試管、凝膠、珠或纖維(或包含結(jié)合的核酸的任何固相支持體)監(jiān)測(cè)RNA的生物標(biāo)記表達(dá)水平。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,770,722、US5,874,219、US5,744,305、US5,677,195和US5,445,934，將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。生物標(biāo)記表達(dá)的檢測(cè)還可以包括使用在溶液中的核酸探針。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，微陣列用于檢測(cè)生物標(biāo)記表達(dá)。微陣列因不同實(shí)驗(yàn)之間的可再現(xiàn)性而特別充分適合于這一目的。DNA微陣列提供了一種用于同時(shí)測(cè)定較大數(shù)量基因的表達(dá)水平的方法。每一陣列由附著于固相支持體上的可再現(xiàn)模式的俘獲探針組成。標(biāo)記的RNA或DNA與陣列上的互補(bǔ)探針雜交且然后通過(guò)激光掃描檢測(cè)。測(cè)定陣列上每一探針的雜交強(qiáng)度并且將其轉(zhuǎn)化成代表相對(duì)基因表達(dá)水平的定量值。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US6,040,138、US5,800,992和US6,020,135、US6,033,860和US6,344,316，將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。高密度寡核苷酸陣列特別可用于測(cè)定樣品中大量RNA的基因表達(dá)特征。
使用機(jī)械合成方法合成這些陣列的技術(shù)描述在例如美國(guó)專(zhuān)利US5,384,261中，為所有目的而將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。盡管優(yōu)選平面陣列表面，但是可以使該陣列在實(shí)際上任何形狀的表面乃至多種多樣的表面上構(gòu)成。陣列可以為在珠、凝膠、聚合物表面、纖維，諸如光學(xué)纖維、玻璃或任何其它合適的底物上的肽類(lèi)或核酸，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,770,358、US5,789,162、US5,708,153、US6,040,193和US5,800,992，為所有目的而將這些文獻(xiàn)各自完整地引入本文。按照能夠用于診斷或綜合裝置的其它操作這樣的方式包裝陣列。例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利US5,856,174和US5,922,591,將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
在一種手段中，將從樣品中分離的總mRNA轉(zhuǎn)化成標(biāo)記的cRNA且然后與寡核苷酸陣列雜交。每種樣品與單獨(dú)的陣列雜交。可以通過(guò)參比存在于陣列上和樣品中的合適的對(duì)照品計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)錄物水平。
進(jìn)一步提供了用于實(shí)施本發(fā)明的試劑盒。所謂″試劑盒″意指任何制品(例如，包裝或容器)，其包含至少一種用于特異性檢測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)記表達(dá)的試劑，例如，抗體、核酸探針等?？梢詫⒃噭┖凶鳛橛糜趯?shí)施本發(fā)明方法的單元、供銷(xiāo)或銷(xiāo)售。另外，試劑盒可以包含描述該試劑盒及其使用方法的藥品說(shuō)明書(shū)。
在具體的實(shí)施方案中，提供了用于實(shí)施本發(fā)明的免疫組織化學(xué)方法的試劑盒。這類(lèi)試劑盒與下文實(shí)施例1中所述的手動(dòng)和自動(dòng)化免疫組織化學(xué)技術(shù)(例如細(xì)胞染色)相適應(yīng)。這些試劑盒包含至少一種針對(duì)于所關(guān)注的生物標(biāo)記蛋白的抗體。任選提供了用于檢測(cè)結(jié)合生物標(biāo)記、復(fù)染劑和上藍(lán)劑的抗體的化學(xué)品以便有利于鑒定陽(yáng)性染色細(xì)胞?；蛘?，本發(fā)明的免疫化學(xué)試劑盒與商品抗體結(jié)合檢測(cè)系統(tǒng)，諸如，例如DakoEnvision+系統(tǒng)和Biocare Medical′s Mach 3系統(tǒng)聯(lián)用。檢測(cè)抗原-抗體結(jié)合的任何化學(xué)品都可以用于實(shí)施本發(fā)明。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)化學(xué)品包含與二次抗體綴合的標(biāo)記聚合物。例如，可以提供與催化色原在抗原-抗體結(jié)合位點(diǎn)上沉積的酶綴合的二次抗體。這類(lèi)酶和使用它們檢測(cè)抗體結(jié)合的技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含與HRP-標(biāo)記的聚合物綴合的二次抗體?？梢赃M(jìn)一步提供與該綴合酶相容的色原(例如，就HRP-標(biāo)記的二次抗體而言為DAB)和用于阻斷非特異性染色的溶液，諸如過(guò)氧化氫。本發(fā)明的試劑盒還可以包含復(fù)染劑，諸如，例如蘇木精?？梢栽谠噭┖兄羞M(jìn)一步提供上藍(lán)劑(例如，氫氧化銨)以便有利于檢測(cè)陽(yáng)性染色細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫組織化學(xué)試劑盒包含至少兩種試劑，例如，抗體，用于特異性檢測(cè)至少兩種不同生物標(biāo)記的表達(dá)?？梢栽谠噭┖兄袑⒚糠N抗體作為單獨(dú)的試劑或作為包含所有針對(duì)于不同所關(guān)注的生物標(biāo)記的抗體的抗體混合物提供。此外，可以在容器內(nèi)提供任何或所有的試劑盒試劑，這些容器可防止它們受到外部環(huán)境影響，諸如在密封容器中。在試劑盒中可以包括陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照品以便驗(yàn)證按照本發(fā)明使用的試劑的活性和正確用法。對(duì)照品可以包括樣品，諸如組織切片、固定在載玻片上的細(xì)胞等，已知它們對(duì)于所關(guān)注的生物標(biāo)記的存在呈陽(yáng)性或陰性。對(duì)照品的設(shè)計(jì)和使用為標(biāo)準(zhǔn)的并且完全屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)能力范圍。
在其它實(shí)施方案中，進(jìn)一步提供了用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的試劑盒，所述的評(píng)價(jià)包括在核酸水平上檢測(cè)生物標(biāo)記的超表達(dá)。這類(lèi)試劑盒包含，例如，至少一種特異性結(jié)合生物標(biāo)記核酸或其片段的核酸探針。在具體的實(shí)施方案中，該試劑盒包含至少兩種與不同生物標(biāo)記核酸雜交的核酸探針。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本發(fā)明方法中任何或所有的步驟均可以由個(gè)人實(shí)施，或按照自動(dòng)化方式進(jìn)行。因此，身體樣品制備、樣品染色和生物標(biāo)記表達(dá)檢測(cè)的步驟均可以自動(dòng)進(jìn)行。此外，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫組織化學(xué)方法與計(jì)算機(jī)成像設(shè)備和軟件聯(lián)用以便有利于由病理學(xué)工作者鑒定陽(yáng)性染色的細(xì)胞。還可以將本文披露的方法與其它預(yù)后方法或分析(例如腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、Her2/neu、Ki67和p53表達(dá)水平)結(jié)合。按照這種方式，對(duì)本發(fā)明生物標(biāo)記超表達(dá)的檢測(cè)能夠更準(zhǔn)確地確定乳腺癌患者的預(yù)后。
文章中的″一種″在本文中使用時(shí)意指文章中合乎語(yǔ)法對(duì)象的一種或一種以上(即，至少一種)。作為實(shí)例，″一種成分″意指一種或多種成分。
在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，措詞″包含(comprising)″或變化形式，諸如″包含(comprises)″或″包含(comprising)″應(yīng)理解為指包含所述的成分、整體或步驟或成分、整體或步驟組，但不排除任何其它成分、整體或步驟或成分、整體或步驟組。
提供下列實(shí)施例作為解釋?zhuān)黄鹣薅ㄗ饔脤?shí)驗(yàn)實(shí)施例1使用免疫組織化學(xué)檢測(cè)生物標(biāo)記超表達(dá)載玻片制備使用切片機(jī)切下福爾馬林固定的石蠟包埋的乳腺腫瘤組織樣品的4μM切片并且置于SuperFrost+載玻片(VWR)上。將該載玻片在強(qiáng)制空氣干燥箱內(nèi)烘焙20分鐘且然后接觸Histo-Orienter，直到石蠟熔化為止。用二甲苯將載玻片洗滌3次，每次5分鐘，以便除去石蠟且然后用無(wú)水乙醇沖洗3次每次沖洗2分鐘。
預(yù)處理和抗原回收為了防止非特異性背景染色，將載玻片在過(guò)氧化氫/甲醇封閉物中和室溫下孵育5分鐘。然后用更換幾次的dH2O徹底沖洗載玻片。
為了使抗原易于進(jìn)行抗體結(jié)合，在加壓蒸煮器內(nèi)將載玻片在抗原回收溶液中孵育5分鐘。使載玻片在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上冷卻至室溫下20分鐘，并且逐步用dH2O、tris緩沖鹽水(TBS)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)經(jīng)連續(xù)稀釋替換檸檬酸鹽緩沖液。然后用TBS以2分鐘/沖洗將載玻片沖洗3次。為了破壞表面張力，向每一載玻片中加入750μl/50ml的1％BSA/TBS。
手動(dòng)免疫組織化學(xué)為了防止非特異性背景染色，不允許在染色操作步驟中載玻片變干。將已經(jīng)進(jìn)行抗原回收的載玻片加載入裝入了水濕潤(rùn)的紙巾的濕度室內(nèi)。在室溫下將SLPI抗體(克隆5G6.24；1∶100稀釋)以足以完全覆蓋組織切片的體積施用在載玻片上1小時(shí)。在與初次抗體一起孵育后，以每次洗滌2分鐘用TBS將載玻片沖洗3次。向最終洗滌物中加入750μl/50ml的1％BSA/TBS。
在室溫下將Dako Envision+HRP-標(biāo)記的聚合物二次抗體施用于載玻片上30分鐘，隨后用TBS沖洗。將HRP底物色原DAB施用10分鐘且然后用水將載玻片沖洗5分鐘。用蘇木精將每一載玻片復(fù)染5秒鐘且然后用水沖洗至澄清。在復(fù)染后，通過(guò)浸入氨水10秒鐘使載玻片″變藍(lán)″且然后用水沖洗1分鐘。
通過(guò)使載玻片浸入95％乙醇1分鐘且然后再浸入無(wú)水乙醇1分鐘使樣品脫水。通過(guò)在二甲苯中沖洗3次，每次沖洗1分鐘使載玻片澄清。然后用持久封固劑對(duì)載玻片進(jìn)行蓋玻片覆蓋并且在35℃下孵育至干燥。使用明視野顯微鏡使生物標(biāo)記染色顯現(xiàn)。由部門(mén)持有證書(shū)的病理學(xué)工作者以盲式方式進(jìn)行評(píng)分。
自動(dòng)化免疫組織化學(xué)按照制造商的說(shuō)明對(duì)Dako自動(dòng)染色機(jī)通用染色系統(tǒng)編程并且使上述對(duì)手動(dòng)免疫組織化學(xué)所述的必要的染色和復(fù)染試劑上機(jī)。使制備的載玻片上自動(dòng)染色機(jī)并且運(yùn)行程序。在運(yùn)行結(jié)束時(shí)，取出載玻片并且用水沖洗5分鐘。使載玻片脫水，澄清，加蓋玻片并且如上所述進(jìn)行分析。
實(shí)施例2臨床樣品至各生物標(biāo)記超表達(dá)的檢測(cè)采集來(lái)自不同疾病階段的約130個(gè)乳腺腫瘤組織樣品。患者平均年齡為77歲。已知每位患者的實(shí)際臨床結(jié)果數(shù)據(jù)并且將每位患者分類(lèi)為具有良好或不良結(jié)果。在本研究中，將良好結(jié)果定義為保持無(wú)癌至少5年；將不良結(jié)果定義為在5年內(nèi)經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)、再發(fā)或死亡。下表表示每一分析的診斷組內(nèi)樣品的數(shù)量以及實(shí)際臨床結(jié)果數(shù)據(jù)。
表1分析的臨床樣品
通過(guò)實(shí)施例1中所述的自動(dòng)化免疫組織化學(xué)分析樣品以便鑒定生物標(biāo)記，其超表達(dá)預(yù)示差的癌癥預(yù)后。即本臨床研究的目的在于鑒定可以區(qū)分良好和差結(jié)果的患者樣品的生物標(biāo)記。抗體用于檢測(cè)所關(guān)注的8種生物標(biāo)記的超表達(dá)SLPI、PSMB9、NDRG-1、E2F1、p21ras、MUC-1、磷酸-p27和src。就質(zhì)量控制目的而言，還分析了樣品的ER、PR、p53、Ki67和Her2/neu表達(dá)。
如表2中所示稀釋通過(guò)如本文所述polydoma篩選鑒定的針對(duì)于所關(guān)注的生物標(biāo)記的商品抗體或單克隆抗體并且用于檢測(cè)生物標(biāo)記的超表達(dá)。下文中還列出了用于每一生物標(biāo)記的抗原回收條件。
表2抗體稀釋和抗原回收條件
載玻片的判讀觀察每一載玻片并且由不了解患者實(shí)際臨床結(jié)果的部門(mén)持有證書(shū)的病理學(xué)工作者評(píng)分。以0-3的等級(jí)對(duì)樣品的生物標(biāo)記染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。例如，參見(jiàn)Hanausek和Walaszek，eds.(1998)Tumor MarkerProtocols(Humana Press，Inc.，Totowa，New Jersey)；和Shi等，eds.(2000)Antigen Retrieval TechniquesImmunohistochemistryand Molecular Morphology(Eaton Publishing，Natick，MA)，將這兩篇文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。對(duì)每一生物標(biāo)記建立閾值染色強(qiáng)度。認(rèn)為表現(xiàn)出低于該閾值的特定生物標(biāo)記的染色強(qiáng)度的樣品對(duì)該生物標(biāo)記而言是陰性的。所關(guān)注的生物標(biāo)記的染色強(qiáng)度閾值如下Src≥1MUC-1≥3磷酸-p27≥0.5PSMB9≥0.5
NDRG-1≥1E2F1≥3p21ras≥0.5SLPI≥2將染色強(qiáng)度結(jié)果與已知的對(duì)每一患者獲得的實(shí)際臨床結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行比較且然后按照下述參數(shù)給出每一載玻片的真陽(yáng)性(TP)、真陰性(TN)、假陽(yáng)性(FP)、假陰性(FN)的最終結(jié)果。計(jì)算每一生物標(biāo)記的靈敏性和特異性值。
表3不良結(jié)果生物標(biāo)記的載玻片分類(lèi)
*良好臨床結(jié)果＝無(wú)癌存活至少5年不良臨床結(jié)果＝5年內(nèi)復(fù)發(fā)或因潛在癌癥死亡使用的計(jì)算靈敏性＝TP/(TP+FN)特異性＝TN/(FP+TN)陽(yáng)性預(yù)測(cè)力(PPP)＝TP/(TP+FP)陰性預(yù)測(cè)力(NPP)＝TN/(FN+TN)結(jié)果將每一生物標(biāo)記的結(jié)果總結(jié)如下。
表4使用各生物標(biāo)記的結(jié)果總結(jié)
實(shí)施例3臨床樣品中生物標(biāo)記超表達(dá)的檢測(cè)-合并生物標(biāo)記為了測(cè)定如果合并多種生物標(biāo)記是否可以改善本發(fā)明方法的靈敏性和特異性，對(duì)來(lái)自實(shí)施例2的數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步分析。因此，考慮了各種生物標(biāo)記的組合并且認(rèn)為對(duì)所關(guān)注的該組合中的任何生物標(biāo)記染色為陽(yáng)性的樣品是陽(yáng)性的。將這些結(jié)果與與已知的對(duì)每一患者獲得的實(shí)際臨床結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行比較且然后如上所述給出每一載玻片的真陽(yáng)性(TP)、真陰性(TN)、假陽(yáng)性(FP)、假陰性(FN)的最終結(jié)果。對(duì)每一生物標(biāo)記的組合計(jì)算靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)。
結(jié)果將每一生物標(biāo)記的組合的結(jié)果總結(jié)如下。
表5SLPI、PSMB9、MUC-1和磷酸-p27
表6SLPI、PSMB9、MUC-1、磷酸-p27和src
表7SLPI、PSMB9、MUC-1、磷酸-p27、src、p21ras、E2F1和NDRG-1
實(shí)施例4使用標(biāo)記分析研究系統(tǒng)(MARS)檢測(cè)臨床樣品中各生物標(biāo)記的超表達(dá)在本研究中分析了超過(guò)200位患者。正如表8中概括的，該患者群體相當(dāng)不同并且表現(xiàn)出T1N0-T3N0的不同階段的腫瘤。
表8分析的患者群體
患者的靶向特征為他們的良好結(jié)果或不良結(jié)果狀態(tài)。在本研究中，良好結(jié)果的患者為那些在5年后仍然保持無(wú)病狀態(tài)的患者；將不良結(jié)果的患者定義為在5年內(nèi)復(fù)發(fā)、再發(fā)或死亡。
生物標(biāo)記選擇用于生物標(biāo)記選擇的范例在于生物標(biāo)記超表達(dá)可以俘獲某些不良結(jié)果的患者并且表現(xiàn)出極高的特異性。因此合并不同的標(biāo)記可以確保高度特異性并且增加靈敏性，例如達(dá)到80％的靈敏性和80％的特異性。在多步驟選擇過(guò)程后，選擇9種生物標(biāo)記用于目前的研究。這些標(biāo)記與其相應(yīng)的亞細(xì)胞定位如表9中所示。
表9分析的生物標(biāo)記
自動(dòng)化免疫組織化學(xué)基本上如實(shí)施例1中所述，通過(guò)自動(dòng)化免疫組織化學(xué)分析患者樣品，以便鑒定生物標(biāo)記，其超表達(dá)預(yù)示差的癌癥預(yù)后。即，本臨床研究的目的在于鑒定可以區(qū)分良好和不良結(jié)果的患者樣品的生物標(biāo)記?？贵w用于檢測(cè)9種所關(guān)注的生物標(biāo)記SLPI、PSMB9、NDRG-1、E2F1、p21ras、p53、MUC-1、磷酸-p27和src的超表達(dá)。還分析了樣品的ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2)的表達(dá)。
如實(shí)施例1中所述制備載玻片并且進(jìn)行抗原回收。具體地，將制備的載玻片浸入抗原回收溶液且然后放入加壓蒸煮器(120-125℃，在17-23psi下)5分鐘。將用于每一生物標(biāo)記的抗原回收溶液列在下表10中。
表10抗原回收溶液
使載玻片逐步返回到室溫的去離子水中。用TBS/tween-20將載玻片沖洗3次，每次洗滌2分鐘。將200μl生物標(biāo)記-特異性抗體加入到每一載玻片中并且在室溫下孵育1小時(shí)。將通過(guò)如本文所述polydoma篩選鑒定的針對(duì)于所關(guān)注的生物標(biāo)記的商品抗體或單克隆抗體用于檢測(cè)生物標(biāo)記的超表達(dá)。
在與初次抗體一起孵育后，用TBS/tween-20將載玻片沖洗2次。然后在室溫下加入200μl標(biāo)記的聚合物(Dako Envision+HRP-標(biāo)記的聚合物二次抗體)30分鐘。用TBS/tween-20再次將載玻片沖洗3次，此后在室溫下添加200μl DAB溶液5分鐘。然后用TBS/tween-20將載玻片沖洗3次并且用去離子水沖洗1次。加入200μl蘇木精5分鐘。用去離子水將載玻片沖洗3次，用TBS/tween-20沖洗1次并且再用去離子水沖洗2次。如實(shí)施例1中所述使載玻片脫水，澄清并且覆蓋蓋玻片。
病理學(xué)工作者評(píng)價(jià)部門(mén)持有證書(shū)的病理學(xué)工作者手動(dòng)對(duì)載玻片評(píng)分。使用0、0.5、1、2或3的等級(jí)、標(biāo)記細(xì)胞的百分比和臨床診斷得分對(duì)p53表達(dá)的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。使用0、0.5、1、2或3的等級(jí)和標(biāo)記細(xì)胞的百分比對(duì)SLPI和PSMB9的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。病理學(xué)工作者還在載玻片上標(biāo)出了用于進(jìn)行測(cè)定的腫瘤區(qū)(ROI)。使用MARS獲得來(lái)自對(duì)每一腫瘤選擇的區(qū)內(nèi)的以單一焦點(diǎn)構(gòu)成的多達(dá)10個(gè)單獨(dú)的20x視野。獲自每一樣品的影像的實(shí)際數(shù)量依賴(lài)于個(gè)別腫瘤的大小。生成含有所有上述評(píng)分信息與患者結(jié)果、淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤大小的Excel表單。如下所述對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。
數(shù)據(jù)提取使用MARS，對(duì)每一文件系統(tǒng)性地進(jìn)行下列步驟·使用顯示出最佳質(zhì)量染色的可利用的載玻片優(yōu)化色原分離用于每一生物標(biāo)記。
·分段設(shè)定按照其亞細(xì)胞定位(核、細(xì)胞質(zhì)或膜)專(zhuān)用于每一生物標(biāo)記。
·提取定義的ROI內(nèi)的細(xì)胞、視野(FOV)和焦點(diǎn)水平的特征并且輸送至輸出文件(XML格式)。
數(shù)據(jù)分析研發(fā)了稱(chēng)作多標(biāo)記分析儀(Multi Marker Analyzer)的具體程序以便整合新的分析算法并且滿(mǎn)足對(duì)這一分析的大量計(jì)算要求。這一軟件提供了加載使用MARS生成的全部或部分TMAs或組織切片XML文件的方式，從而可以使用描述TMA關(guān)鍵詞的XML文件(就TMA分析而言)或給出患者臨床狀態(tài)和患者評(píng)價(jià)的Excel文件(就組織切片分析而言)合并在這些文件中包含的數(shù)據(jù)以及所有進(jìn)一步分析的數(shù)據(jù)。這種數(shù)據(jù)合并過(guò)程包括將MARS對(duì)每一核心(或患者)測(cè)定的參數(shù)與TMA關(guān)鍵詞(或Excel文件)中保持的有關(guān)患者的信息結(jié)合鑒定數(shù)量和醫(yī)學(xué)狀態(tài)(良好或不良結(jié)果)和病理學(xué)工作者評(píng)價(jià)，條件是在XML格式化的MARS文件中不包括。
因?yàn)槟承悠凡唤?jīng)歷完整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，所以分析的患者的數(shù)量小于上述表8中記錄的患者數(shù)量并且根據(jù)生物標(biāo)記彼此的不同而改變。將對(duì)每一生物標(biāo)記分析的組織切片數(shù)量列在下表11中。對(duì)常用乳腺癌標(biāo)記(即ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2))分析的組織樣品數(shù)量列在表12中。
表11分析生物標(biāo)記超表達(dá)的組織切片數(shù)量
表12分析常用乳腺癌標(biāo)記的組織切片數(shù)量
分段化和分配器設(shè)定為了使MARS分析接近表征載玻片的病理學(xué)工作者的方式，僅選擇至少認(rèn)為是1+的細(xì)胞。表13中概括了為這一分析用于MARS的分段化設(shè)定。這一分段化設(shè)定導(dǎo)致能夠檢測(cè)大部分染色的細(xì)胞。分段化和分配器透射率閾值基于細(xì)胞學(xué)工作者的輸入信息。分段化設(shè)定為使用用計(jì)算機(jī)TPO-RDLAB5上Dage照相機(jī)捕捉的20x圖像的基于像素的。
表13主要分段化設(shè)定參數(shù)
為了將選擇的細(xì)胞分入基于靶向的細(xì)胞區(qū)室中生物標(biāo)記染色強(qiáng)度的類(lèi)別，將由分段化產(chǎn)生的合格的細(xì)胞分成3類(lèi)1(在MARS中NegRef)；2(在MARS中Test)；和3(在MARS中PosRef)。表14中提供了MARS特征及其用于進(jìn)行這一分配的值，作為標(biāo)記的細(xì)胞定位的函數(shù)。
表14導(dǎo)致將選擇的細(xì)胞分成1、2或3類(lèi)的分配器設(shè)定
進(jìn)行0類(lèi)(相當(dāng)于″未染色細(xì)胞的預(yù)測(cè)數(shù)量″)的評(píng)價(jià)。用獲自具有1、2和3細(xì)胞染色強(qiáng)度的細(xì)胞區(qū)域的腫瘤細(xì)胞區(qū)域平均值(如根據(jù)稱(chēng)作CELL_AREA的MARS特征所估計(jì)的1100像素)計(jì)算這些細(xì)胞的近似數(shù)量N1＝NNegRefN2＝NTestN3＝NPosRef
N0＝最大(0，N總-N1-N2-N3)使用N0、N1、N2和N3，計(jì)算染色為0、1、2和3的細(xì)胞的細(xì)胞百分比。表15中給出了這些新特征的名稱(chēng)。
表15概括的百分比特征
將這些特征計(jì)算為簡(jiǎn)單的百分比，例如CELL_PERCENT_0
本研究使用MARS特征、這些新的概括的特征和病理學(xué)工作者的評(píng)分進(jìn)行。USER_TYPE僅為病理學(xué)工作者評(píng)分用的MARS特征的名稱(chēng)。
多種生物標(biāo)記分析為了獲得改善的靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)，合并并且分析來(lái)自多種生物標(biāo)記的數(shù)據(jù)。用于每一生物標(biāo)記的特異性靶標(biāo)依賴(lài)于合并的生物標(biāo)記的數(shù)量。作為實(shí)例，3種生物標(biāo)記的組合可以達(dá)到80％的特異性，條件是每種標(biāo)記各自的特異性至少為0.81/3＝93％。表16提供了基于從1-9組合中的生物標(biāo)記的數(shù)量的所需特異性值的清單。
表16在對(duì)多達(dá)9種生物標(biāo)記的指定組合靶向0.8的總體特異性時(shí)每種生物標(biāo)記所需的最低特異性
數(shù)據(jù)的判讀本文所用的術(shù)語(yǔ)″標(biāo)記性能″包括涉及標(biāo)記的確切生物識(shí)別能力以及生物樣品的來(lái)源和儲(chǔ)存、染色方案、掃描過(guò)程、成像和數(shù)據(jù)采集程序的完整實(shí)驗(yàn)性能。
結(jié)果1.每種生物標(biāo)記A.病理學(xué)工作者評(píng)分在僅考慮病理學(xué)工作者評(píng)分(MARS中的USER_TYPE)時(shí)計(jì)算產(chǎn)生最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)的閾值。在靶向0.75的特異性時(shí)，將最有意義的結(jié)果概括在表17中。
表17生物標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)(病理學(xué)工作者評(píng)分)
還在僅考慮病理學(xué)工作者對(duì)乳腺組常用標(biāo)記(即ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2))的評(píng)價(jià)時(shí)計(jì)算產(chǎn)生最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)的閾值。在靶向0.75的特異性時(shí)，將最有意義的結(jié)果概括在表18中。
18.用于常用標(biāo)記(病理學(xué)工作者評(píng)分)的最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)
對(duì)每一生物標(biāo)記和常用的乳腺癌標(biāo)記(即ER、PR、Ki67和Her2/neu(CerbB2))而言，計(jì)算產(chǎn)生最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)的特征和閾值僅用于病理學(xué)工作者的評(píng)價(jià)(USER_TYPE)。制備相應(yīng)的接收器工作特性(ROC)曲線(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。
B.單一特征分析就每一生物標(biāo)記而言，在考慮定義為在分析的生物標(biāo)記方面有意義的每一MARS特征時(shí)，計(jì)算產(chǎn)生最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)的特征和閾值。制備相應(yīng)的ROCs(數(shù)據(jù)未顯示)。在靶向0.75的特異性時(shí)，將產(chǎn)生每一生物標(biāo)記最佳結(jié)果的特征和閾值概括在表19中.。
表19獲自MARS特征(單一特征規(guī)則系統(tǒng))的每一生物標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
*決策規(guī)則為1意指將高于閾值的患者視為陽(yáng)性(即如果是不良實(shí)際臨床結(jié)果，那么為真陽(yáng)性)，而決策規(guī)則為8意指將高于閾值的患者視為陰性(即如果是不良實(shí)際臨床結(jié)果，那么為假陰性)。
C.多重特征分析將每一百分比概括特征兩兩合并并且計(jì)算產(chǎn)生最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)的閾值。對(duì)0.75的靶特異性而言，表20中提供了每一生物標(biāo)記的最有意義的結(jié)果。
表20獲自MARS特征(多重特征規(guī)則系統(tǒng))的每一生物標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
*決策規(guī)則相當(dāng)于2個(gè)特征區(qū)間中的四分體屬性。
2.生物標(biāo)記的組合依次使用病理學(xué)工作者評(píng)分，1個(gè)MARS特征和每個(gè)標(biāo)記2個(gè)MARS特征研究1-9標(biāo)記的完全可能組合的組。按照FDA-樣和基于序列的判讀方法計(jì)算靈敏性和特異性?！錐DA-樣″意指任何為ON(1)的標(biāo)記產(chǎn)生不良結(jié)果判斷。即，如果至少一種標(biāo)記為陽(yáng)性的，那么認(rèn)為標(biāo)記的組合為陽(yáng)性?；谛蛄械呐凶x依賴(lài)于每種特定的ON/OFF組合的靈敏性/特異性。將使用病理學(xué)工作者評(píng)分(表21)和特征評(píng)價(jià)百分比(表22)獲得的結(jié)果列在下面。
表21使用不同靶向的特異性(75％和95％)和不同判讀規(guī)則系統(tǒng)(病理學(xué)工作者評(píng)分)的生物標(biāo)記組合的最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)
*每位患者的特征在于病理學(xué)工作者評(píng)分。
表22使用不同靶向的特異性(75％和95％)和不同判讀規(guī)則系統(tǒng)(百分比特征)的生物標(biāo)記組合的最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)
*每位患者的特征在于1、2和3的染色細(xì)胞百分比。
實(shí)施例5中提供了4和6種生物標(biāo)記的組合的具體實(shí)例。
來(lái)自浸潤(rùn)性小葉癌(ILC)患者的無(wú)數(shù)據(jù)分析基于診斷進(jìn)一步再細(xì)分表8中所述的患者群體。具體地，排除來(lái)自具有浸潤(rùn)性小葉癌(ILC)的患者的數(shù)據(jù)并且對(duì)所得數(shù)據(jù)組進(jìn)行上述分析。表23中提供了本研究中分析的患者群體的詳細(xì)內(nèi)容。
表23分析的患者群體(無(wú)ILC患者)
結(jié)果1.每個(gè)生物標(biāo)記A.病理學(xué)工作者評(píng)分表24無(wú)ILC患者數(shù)據(jù)的生物標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)(病理學(xué)工作者評(píng)分)
表25無(wú)ILC患者數(shù)據(jù)的常用標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)(病理學(xué)工作者評(píng)分)
B.單一特征的分析表26獲自無(wú)ILC患者數(shù)據(jù)的MARS特征(單一特征規(guī)則系統(tǒng))的每一生物標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
*決策規(guī)則為1意指將高于閾值的患者視為陽(yáng)性(即，如果是不良實(shí)際臨床結(jié)果，那么為真陽(yáng)性)，而決策規(guī)則為8意指將高于閾值的患者視為陰性(即，如果是不良實(shí)際臨床結(jié)果，那么為假陰性)。
C.多重特征分析表27獲自無(wú)ILC患者數(shù)據(jù)的MARS特征(多重特征規(guī)則系統(tǒng))的每一生物標(biāo)記的最佳靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
*決策規(guī)則相當(dāng)于2個(gè)特征區(qū)間中的四分體屬性D.分析之間的變差所有患者與無(wú)ILC患者之間測(cè)定以每一生物標(biāo)記為基礎(chǔ)，使用對(duì)完整患者群體(表8)和無(wú)ILC患者的群體(表23)獲得的靈敏性和特異性值的變差。將結(jié)果列在下表28中?？傆?jì)欄(d2)中給出了ROC曲線(xiàn)上的二次方距離的差異，即靈敏性和特異性的總體增加。
表28使用完整患者群體和無(wú)ILC患者獲得的靈敏性和特異性的變差(每個(gè)生物標(biāo)記)
2.生物標(biāo)記的組合A.病理學(xué)工作者評(píng)分表29使用不同靶向的特異性(75％和95％)和不同的判讀規(guī)則系統(tǒng)(病理學(xué)工作者評(píng)分)的無(wú)ILC患者的生物標(biāo)記組合的最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)
*每位患者的特征在于病理學(xué)工作者評(píng)分B.特征分析百分比表30使用不同靶向的特異性(75％和95％)和不同的判讀規(guī)則系統(tǒng)(百分比特征)的無(wú)ILC患者的生物標(biāo)記組合的最佳靈敏性/特異性關(guān)聯(lián)
*每位患者的特征在于1、2和3的染色細(xì)胞的百分比。
表30表示特異性增加(0.88與0.81相比，參見(jiàn)表28)，此時(shí)考慮5種生物標(biāo)記組合，不包括具有單一特征百分比的ILC患者。在使用2個(gè)特征進(jìn)行5種生物標(biāo)記序列分析時(shí)，觀察到靈敏性增加(0.71與0.65相比，參見(jiàn)表28)，此時(shí)從本研究種排除ILC患者。
C.分析之間的變差所有患者與無(wú)ILC的患者測(cè)定對(duì)生物標(biāo)記組合，使用對(duì)完整患者群體和無(wú)ILC患者的群體獲得的靈敏性和特異性值的變差。將結(jié)果列在下表31中。總計(jì)欄(d2)中給出了ROC曲線(xiàn)上的二次方距離差異，即靈敏性和特異性的總體增加。在從本研究中排除ILC患者時(shí)，觀察到了使用一種或兩種百分比特征對(duì)5種生物標(biāo)記的序列分析的性能微小的增加。
表31使用完整患者群體和無(wú)ILC患者獲得的靈敏性和特異性的變差(生物標(biāo)記組合)
實(shí)施例5特定的生物標(biāo)記組合進(jìn)一步分析上述實(shí)施例4中所述的本研究中獲得的數(shù)據(jù)并且考慮特定的生物標(biāo)記的組合。將使用4種(SLPI/p21ras/E2F1/src)和6種(SLPI/p21ras/PSMB9/E2F1/src/磷酸-p27)生物標(biāo)記的組合獲得的結(jié)果列在下面。
4種生物標(biāo)記組合SLPI/p21ras/E2F1/src僅使用SLPI、p21ras、E2F1和src的一種百分比特征與表32中定義的閾值和決策規(guī)則進(jìn)行分析。使用如下規(guī)則獲得了60％的靈敏性和80％的特異性如果E2F1為ON(即為1)并且并非僅該生物標(biāo)記為ON，那么認(rèn)為患者的結(jié)果不良；否則，認(rèn)為結(jié)果良好。圖1表示作為E2F1的不良和良好結(jié)果患者的函數(shù)的百分比特征的分布。使用2.46％的閾值分別獲得了0.54和0.75的靈敏性和特異性值。
表324種生物標(biāo)記分析的百分比概括特征
將基于序列的判讀手段用于分析4種生物標(biāo)記組合。所用的基于序列的決策規(guī)則為如果E2F1為ON(即為1)并且并非僅該生物標(biāo)記為ON，那么認(rèn)為患者的結(jié)果不良；否則，認(rèn)為結(jié)果良好。表33中提供了4種生物標(biāo)記的所有可能的組合的靈敏性和特異性值。制備使用用于SLPI/p21ras/E2F1/src組合的序列判讀手段獲得的ROC曲線(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。
表33使用對(duì)SLPI、p21ras、E2F1和SRC組合的基于序列的判讀手段的靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
*序列S0110如下SLPI＝OFF/p21ras＝ON/E2F1＝ON/src＝0FF。
基于單獨(dú)的E2F1的判讀分別得到了54％和75％的靈敏性和特異性。使用上述定義的基于序列的系統(tǒng)規(guī)則分別獲得了60％和80％的特異性和靈敏性(即，如果E2F1為ON(即為1)并且并非僅該生物標(biāo)記為ON，那么認(rèn)為患者的結(jié)果不良；否則，認(rèn)為結(jié)果良好)。
6種生物標(biāo)記組合SLPI/p21ras/E2F1/src/PSMB9/磷酸-p27僅使用SLPI、p21ras、E2F1、src、PSMB9和磷酸-p27的6種生物標(biāo)記組合的一種百分比特征與表34中定義的閾值和決策規(guī)則進(jìn)行分析。
表346種生物標(biāo)記分析的百分比概括特征
將基于序列的判讀手段用于分析6種生物標(biāo)記組合。所用的基于序列的決策規(guī)則為如果E2F1為ON(即為1)且SLPI或21ras，或E2F1和任何2種生物標(biāo)記，或SLPI和任何2種生物標(biāo)記，或任何4種生物標(biāo)記或4種以上為ON，那么認(rèn)為患者的結(jié)果不良；否則，認(rèn)為結(jié)果良好。表35中提供了所關(guān)注的6種生物標(biāo)記的所有可能的組合的靈敏性和特異性值。使用用于SLPI/p21ras/E2F1/PSMB9/src/磷酸-p27組合的序列判讀手段獲得的ROC曲線(xiàn)如圖2中所示。
表35使用用于SLPI、p21ras、E2F1、PSMB9、SRC和磷酸-p27組合的基于序列的判讀手段的靈敏性和特異性關(guān)聯(lián)
使用上述定義的基于序列的系統(tǒng)規(guī)則分別獲得了70％和77％的特異性和靈敏性。
實(shí)施例6用于免疫組織化學(xué)的試劑和染色條件的優(yōu)化為了使用本文披露的免疫組織化學(xué)方法將對(duì)特定生物標(biāo)記表達(dá)的檢測(cè)的信噪比最大化，進(jìn)行選擇最佳抗原回收溶液和條件、抗體濃度和稀釋劑配方和檢測(cè)化學(xué)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)。對(duì)每組實(shí)驗(yàn)而言，通過(guò)從正規(guī)石蠟塊中獲得圓柱形組織樣本，將其裝配成單個(gè)塊并且制備含有多組織樣本的切片來(lái)構(gòu)建生物標(biāo)記-特異性組織微陣列(TMAs)。使用具有2-3個(gè)預(yù)先選擇的對(duì)每種乳腺生物標(biāo)記而言已知陽(yáng)性和陰性腫瘤的TMAs。制備載玻片并且基本上如實(shí)施例1中所述進(jìn)行自動(dòng)化免疫組織化學(xué)。在所有優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用下列對(duì)照試劑·就陰性對(duì)照而言，用備用的通用陰性試劑，即非特異性的小鼠或家兔IgG替換施用初次抗體。
·EF1-α用作陽(yáng)性對(duì)照。
·按照在對(duì)測(cè)試的每種抗體而言可行的過(guò)程中建立的優(yōu)化標(biāo)記參數(shù)運(yùn)行陽(yáng)性標(biāo)記對(duì)照載玻片。
·含有陽(yáng)性和陰性腫瘤的生物標(biāo)記特異性TMA用于測(cè)試每種乳腺標(biāo)記抗體。
1.抗原回收優(yōu)化A.抗原回收溶液使用所關(guān)注的生物標(biāo)記抗體中的每一種測(cè)試下列各抗原回收溶液。本文所用的時(shí)間和溫度為如下定義的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的值。
表36測(cè)試的抗原回收溶液
由病理學(xué)工作者給載玻片評(píng)分并且通過(guò)比較陽(yáng)性與陰性腫瘤之間的標(biāo)記特異性和強(qiáng)度確定最佳性能的抗原回收溶液。如果結(jié)果基本上為陰性，那么篩選備選的抗原回收溶液。如果結(jié)果為陽(yáng)性，即標(biāo)記強(qiáng)于無(wú)抗原回收，那么鑒定上部(1-3)溶液并且用于抗原回收時(shí)間和溫度測(cè)試。通過(guò)標(biāo)記陽(yáng)性和陰性全組織切片的有代表性的樣品驗(yàn)證選擇的抗原回收溶液的活性。
B.抗原回收條件-時(shí)間和溫度使用下列時(shí)間和溫度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試最佳性能的抗原回收溶液表37測(cè)試的抗原回收時(shí)間和溫度條件
由病理學(xué)工作者給載玻片評(píng)分并且通過(guò)比較陽(yáng)性與陰性腫瘤之間的標(biāo)記特異性和強(qiáng)度確定最佳性能的抗原回收時(shí)間和溫度的組合。通過(guò)標(biāo)記陽(yáng)性和陰性完整組織切片的有代表性的樣品，應(yīng)用上述對(duì)照品驗(yàn)證選擇的抗原回收溶液和時(shí)間和溫度的組合的活性。
2.抗體稀釋度和稀釋劑配方的優(yōu)化A.抗體稀釋在一定范圍的抗體稀釋度內(nèi)測(cè)試每種乳腺癌生物標(biāo)記抗體。表38提供了測(cè)試SLPI 5G6.24抗體的抗體稀釋實(shí)例。按照類(lèi)似的方式測(cè)試所有其它乳腺生物標(biāo)記抗體。
表38測(cè)試的抗體稀釋度
由病理學(xué)工作者給載玻片評(píng)分并且評(píng)價(jià)對(duì)照品、已知陽(yáng)性和已知陰性腫瘤之間的標(biāo)記強(qiáng)度。分析標(biāo)記數(shù)據(jù)以便確定維持所需標(biāo)記強(qiáng)度和每種抗體應(yīng)用范圍寬度的抗體稀釋度的上限和下限。如果最初的測(cè)試的稀釋度范圍未能確定上限和下限，那么再測(cè)試抗體稀釋度。
B.抗體稀釋劑配方使用所關(guān)注的每種乳腺生物標(biāo)記抗體測(cè)試不同抗體稀釋液。下表中提供了有關(guān)測(cè)試的稀釋劑參數(shù)的描述。
表39測(cè)試的抗體稀釋劑
由病理學(xué)工作者給載玻片的標(biāo)記強(qiáng)度評(píng)分。通過(guò)比較生物標(biāo)記對(duì)照載玻片與實(shí)驗(yàn)載玻片的標(biāo)記等級(jí)來(lái)確定稀釋劑配方的有效性。測(cè)試那些通過(guò)比較陽(yáng)性與陰性腫瘤的標(biāo)記產(chǎn)生最具特異性和最高信噪比的稀釋劑配方。將產(chǎn)生最佳標(biāo)記強(qiáng)度的稀釋劑配方(約1-3種)轉(zhuǎn)入進(jìn)一步優(yōu)化和穩(wěn)定性研究。通過(guò)標(biāo)記陽(yáng)性和陰性完整乳腺瘤組織切片的有代表性的樣品驗(yàn)證選擇的稀釋劑的活性。
3.檢測(cè)化學(xué)的優(yōu)化使用DAKO Envision+檢測(cè)試劑盒在下列時(shí)間和濃度范圍內(nèi)測(cè)試每種乳腺生物標(biāo)記抗體。
表40測(cè)試的檢測(cè)化學(xué)時(shí)間和濃度條件
由病理學(xué)工作者給載玻片評(píng)分并且評(píng)價(jià)對(duì)照品、已知陽(yáng)性和已知陰性腫瘤之間的標(biāo)記強(qiáng)度。通過(guò)標(biāo)記陽(yáng)性和陰性完整乳腺癌組織切片的有代表性的樣品驗(yàn)證選擇的檢測(cè)化學(xué)時(shí)間和濃度組合的活性。
結(jié)果使用最優(yōu)化染色試劑條件觀察到顯著改善的信噪比(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例7臨床樣品中生物標(biāo)記的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)使用ABI Prism 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Sequence Detection System)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)PCR。在本研究中借助于Primer ExpressTM程序1.5版(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)設(shè)計(jì)引物和探針，以便對(duì)靶向的乳腺疾病分期標(biāo)記(例如DARPP32和NDRG-1)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。有關(guān)引物和探針的序列信息如下所示DARPP32正向引物名稱(chēng)DARPP32_t1-F序列TACACACCACCTTCGCTGAAAG(SEQ ID NO33)反向引物名稱(chēng)DARPP32_t1-R序列GGCCTGGTTCTCATTCAAATTG(SEQ ID NO34)TaqMan探針名稱(chēng)DARPP32_t1-探針序列CGCATTGCTGAGTCTCACCTGCAGTC(SEQ ID NO35)正向引物名稱(chēng)DARPP32_t2-F序列CAGCCTTACAGAGACTGGAAAAGAA(SEQ ID NO36)反向引物名稱(chēng)DARPP32_t2-R序列GAGGCTCAGGGACCCAAAG(SEQ ID NO37)TaqMan探針名稱(chēng)DARPP32_t2-探針序列CCAAACCAAGGCCCCCAGAGAGGT(SEQ ID NO38)NDRG-1正向引物名稱(chēng)NDRG-1-F序列CCTACCGCCAGCACATTGT(SEQ ID NO39)反向引物名稱(chēng)NDRG-1-R序列GCTGTTGTAGGCATTGATGAACA(SEQ ID NO40)TaqMan探針名稱(chēng)NDRG-1-探針序列AATGACATGAACCCCGGCAACCTG(SEQ ID NO41)用5′堿基上的熒光染料FAM(6-羧基熒光素)和3′堿基上的猝滅染料TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)標(biāo)記探針。擴(kuò)增子的大小約為100bp。將18S核糖體RNA用作內(nèi)源性對(duì)照品。用熒光染料VIC標(biāo)記18SrRNA探針。預(yù)研發(fā)的18S rRNA引物/探針混合物購(gòu)自AppliedBiosystems(P/N4310893E)。在本研究中分析了20個(gè)冷凍乳腺組織(即，6個(gè)具有不良結(jié)果的腫瘤，12個(gè)具有良好結(jié)果的腫瘤和2個(gè)正常組織)。在本研究中，將良好結(jié)果定義為保持無(wú)癌至少5年；將不良結(jié)果定義為在5年內(nèi)經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)、再發(fā)或死亡。通過(guò)使用High-Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems，P/N4322171)將從冷凍乳腺組織中提取的5μg總RNA定量轉(zhuǎn)化成具有隨機(jī)六聚物(沒(méi)有低聚-dT)的單鏈cDNA形式。制備下列反應(yīng)試劑2OX引物/探針主混合物(在200μl中)180μM正向引物20μl180μM反向引物20μl100μM TaqMan探針 10μlH2O 150μl最終反應(yīng)混合物(25μl/孔)2OX引物/探針主混合物 1.25μl2X TaqMan通用PCR主混合物(P/N4304437) 12.5μlcDNA模板 5.0μlH2O 6.25μl20X TaqMan通用PCR主混合物購(gòu)自Applied Biosystems(P/N4304437)。在25μl總體積中的最終引物和探針濃度分別為0.9μM和0.25μM。將10ng總RNA施加到反應(yīng)的各孔中。擴(kuò)增條件為在50℃下2分鐘，在95℃下10分鐘和在95℃下15秒和60℃下60秒的兩步循環(huán)，總計(jì)40個(gè)循環(huán)。在每次反應(yīng)中包括至少三種無(wú)模板的對(duì)照反應(yīng)混合物。所有實(shí)驗(yàn)均按照一式三份進(jìn)行。
在每次反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將記錄的熒光強(qiáng)度用于下列計(jì)算Rn+為含有所有成分的反應(yīng)的Rn值，Rn-為未反應(yīng)的樣品的Rn值(基線(xiàn)值或在NTC中檢測(cè)到的值)。ΔRn為Rn+與Rn-之差。它是由PCR生成的信號(hào)強(qiáng)度的指示物。通過(guò)比較CT法計(jì)算靶基因的表達(dá)水平。所述的方法未使用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品，而是比較靶序列的相對(duì)量與選擇的參比值(選擇18SrRNA作為本研究中的參比物)。參見(jiàn)Applied Biosystems的TaqManHuman Endogenous Control Plate Protocol，其包含有關(guān)基于MS Excel的數(shù)據(jù)分析的詳細(xì)說(shuō)明。
結(jié)果將使用每種生物標(biāo)記和特異性引物獲得的結(jié)果列在下表中。將使用正常乳腺組織樣品獲得的結(jié)果命名為N；將那些使用乳腺癌樣品獲得的結(jié)果標(biāo)記為T(mén)。
表41DARPP32 TaqMan結(jié)果
DARPP32具有兩種轉(zhuǎn)錄物t1和t2。TaqMan數(shù)據(jù)顯示了t1和t2在具有不良結(jié)果的乳腺腫瘤中超表達(dá)(用粗體表示)，與之相比的是那些具有良好結(jié)果的乳腺腫瘤。
表42NDRG-1 TaqMan結(jié)果
NDRG-1具有一種轉(zhuǎn)錄物。TaqMan數(shù)據(jù)顯示了NDRG-1在具有不良結(jié)果的乳腺腫瘤中超表達(dá)(用粗體表示)，與之相比的是那些具有良好結(jié)果的乳腺腫瘤。
實(shí)施例8具有10-年臨床隨訪(fǎng)的首次進(jìn)入化療患者群體中生物標(biāo)記超表達(dá)的檢測(cè)(5種生物標(biāo)記組)在本研究中在或接近最初診斷時(shí)從255位早期階段乳腺癌患者中采集乳腺腫瘤組織樣品分析生物標(biāo)記超表達(dá)。在本研究中對(duì)所有患者利用10-年臨床隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)。無(wú)一患者在其對(duì)乳腺癌治療過(guò)程中的任何時(shí)間接受細(xì)胞毒性化療。將患者群體的臨床人口統(tǒng)計(jì)、分布和標(biāo)準(zhǔn)組織病理學(xué)參數(shù)(例如ER/PR激素受體狀態(tài)、組織學(xué)等級(jí)等)概括在下表43中。
表43首次進(jìn)入化療患者群體的臨床特征
基本上如上所述對(duì)包含SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1的5種生物標(biāo)記組的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。即，制備乳腺腫瘤樣品并且如上述實(shí)施例1中所述使用Dako自動(dòng)染色機(jī)對(duì)生物標(biāo)記表達(dá)染色。使用實(shí)施例4中所述的成像分析測(cè)定生物標(biāo)記超表達(dá)。
使用考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)模型分析評(píng)價(jià)5種生物標(biāo)記組的預(yù)后性能。例如，參見(jiàn)Spruance等，文獻(xiàn)同上。計(jì)算鑒定10年后無(wú)病患者中10年內(nèi)經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)或死亡的患者的每種生物標(biāo)記和/或組織學(xué)特征的預(yù)后值。在無(wú)生物標(biāo)記組的分析中，發(fā)現(xiàn)年齡和腫瘤大小為獨(dú)立的預(yù)后因素，其中p值＜0.05。當(dāng)將生物標(biāo)記加入到該分析中時(shí)，它們表現(xiàn)出最高統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性獨(dú)立預(yù)后效用，其中p值＜0.0001。將考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果概括在下表44中。
表44使用首次進(jìn)入化療患者群體的考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)分析的結(jié)果(SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物標(biāo)記組)
診斷時(shí)的年齡為連續(xù)的變量并且生物標(biāo)記為具有0或1、2、3、4的普通變量(0＝無(wú)陽(yáng)性標(biāo)記，1＝1種陽(yáng)性標(biāo)記，或2、3、4種陽(yáng)性標(biāo)記)。
SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物標(biāo)記組的預(yù)后性能以圖示呈現(xiàn)在圖3的卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)圖中。x-軸代表距最初診斷時(shí)的年數(shù)，且y軸為無(wú)病存活百分比。一般乳腺癌群體與生物標(biāo)記分析彼此獨(dú)立的相應(yīng)圖呈現(xiàn)在圖4中。這些圖表示這種生物標(biāo)記組將該早期階段乳腺癌患者群體因原發(fā)性疾病導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)和/或死亡進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)的能力。在患者樣品中超表達(dá)的生物標(biāo)記的數(shù)量增加時(shí)，原發(fā)性疾病導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)和/或死亡的風(fēng)險(xiǎn)度也增加。根據(jù)超表達(dá)的生物標(biāo)記的數(shù)量鑒定的患者亞組的無(wú)病存活率彼此具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中p值為＜0.001，正如通過(guò)用于比較0個(gè)陽(yáng)性，1個(gè)陽(yáng)性，2個(gè)陽(yáng)性，3個(gè)或3個(gè)以上陽(yáng)性的生物標(biāo)記組的時(shí)序檢驗(yàn)所測(cè)定的。認(rèn)為通過(guò)本文所述的成像分析分類(lèi)為超表達(dá)的生物標(biāo)記是″陽(yáng)性的″。
因?yàn)槿橄侔┗颊咴\斷的最重要的臨床特征之一涉及雌激素受體(ER)狀態(tài)，所以在ER-陽(yáng)性和-陰性患者亞組中使用考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)分析進(jìn)一步評(píng)價(jià)了SLPI、src、PSMB9、p21ras、和E2F1生物標(biāo)記的預(yù)后性能。這兩個(gè)亞組的臨床控制和預(yù)后是不同的，因?yàn)镋R-陽(yáng)性患者為他莫昔芬療法的候選者，而ER陰性患者不是。將分析結(jié)果概括在下表45中。數(shù)據(jù)顯示所關(guān)注的5種生物標(biāo)記在ER陽(yáng)性和陰性乳腺癌患者亞組中具有預(yù)后效用。因此，盡管生物標(biāo)記SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1不依賴(lài)于患者的ER狀態(tài)預(yù)示預(yù)后，但是這些生物標(biāo)記還與ER狀態(tài)相關(guān)。
表45使用首次進(jìn)入化療患者群體的考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)分析的結(jié)果(ER陽(yáng)性和陰性患者亞組中的SLPI、src、PSMB9、p21ras和E2F1生物標(biāo)記組)
診斷時(shí)的年齡為連續(xù)的變量并且TPO標(biāo)記為具有0或1、2、3、4的普通變量(0＝無(wú)陽(yáng)性標(biāo)記，1＝1種陽(yáng)性標(biāo)記，或2、3、4種陽(yáng)性標(biāo)記)實(shí)施例9具有10-年臨床隨訪(fǎng)的首次進(jìn)入化療患者群體中生物標(biāo)記超表達(dá)的檢測(cè)(6種生物標(biāo)記組)對(duì)來(lái)自實(shí)施例8中所述首次進(jìn)入化療的患者群體的100位患者(50位結(jié)果良好；50位結(jié)果不良患者)的乳腺腫瘤組織樣品分析所關(guān)注的6種生物標(biāo)記(SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1)的超表達(dá)?；旧先缟纤鐾ㄟ^(guò)自動(dòng)化免疫組織化學(xué)對(duì)6種生物標(biāo)記組的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，但使用備選的染色平臺(tái)Ventana BenchMark XT代替Dako自動(dòng)染色機(jī)。用于操作Ventana BenchMark XT的標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)易于從制造商處獲得。將對(duì)用于Ventana BenchMark XT染色平臺(tái)的免疫組織化學(xué)參數(shù)的額外修訂概括在下表46中。如上所述使用實(shí)施例4中所述的成像分析測(cè)定生物標(biāo)記超表達(dá)。
表46使用Ventana BenchMark XT染色平臺(tái)對(duì)生物標(biāo)記染色的免疫組織化學(xué)參數(shù)
*CC1和CC2意指商購(gòu)自Ventana的細(xì)胞條件試劑。關(guān)于抗原回收時(shí)間短＝30分鐘；標(biāo)準(zhǔn)＝60分鐘；且延長(zhǎng)的＝90分鐘*使用上述考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)模型分析評(píng)價(jià)6種生物標(biāo)記組的預(yù)后性能。計(jì)算鑒定10年后無(wú)病患者中10年內(nèi)經(jīng)歷疾病復(fù)發(fā)或死亡的患者的每種生物標(biāo)記和/或組織學(xué)特征的預(yù)后值。所關(guān)注的生物標(biāo)記(SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1)表現(xiàn)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的預(yù)后效用，其中p值為0.0220。將考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果概括在下表47中。
表47使用首次進(jìn)入化療患者群體的考克斯多因素疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)分析的結(jié)果(SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1生物標(biāo)記組)
SLPI、src、PSMB9、p21ras、E2F1和MUC-1生物標(biāo)記組的預(yù)后性能以圖示呈現(xiàn)在圖5的卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)圖中。x-軸代表距最初診斷時(shí)的年數(shù)，且y軸為無(wú)病存活百分比。一般乳腺癌群體與生物標(biāo)記分析彼此獨(dú)立的相應(yīng)圖呈現(xiàn)在圖4中。這些圖表示這種生物標(biāo)記組將該早期階段乳腺癌患者群體因原發(fā)性疾病導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)和/或死亡進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)的能力。在患者樣品中超表達(dá)的生物標(biāo)記的數(shù)量增加時(shí)，原發(fā)性疾病導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和/或死亡的風(fēng)險(xiǎn)度也增加。根據(jù)超表達(dá)的生物標(biāo)記的數(shù)量鑒定的患者亞組的無(wú)病存活率彼此具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中p值為＜0.0065，正如通過(guò)用于比較0個(gè)陽(yáng)性，1個(gè)陽(yáng)性，2個(gè)陽(yáng)性，3個(gè)或3個(gè)以上陽(yáng)性的生物標(biāo)記組的時(shí)序檢驗(yàn)所測(cè)定的。如上所述，認(rèn)為通過(guò)本文所述的成像分析分類(lèi)為超表達(dá)的生物標(biāo)記是″陽(yáng)性的″。
表48生物標(biāo)記核苷酸和氨基酸序列信息
本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)預(yù)示了本發(fā)明涉及的本領(lǐng)域的技術(shù)水平。將所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)引入本文作為參考，其引入程度與將各出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e和各自引入作為參考的程度相同。
盡管為清楚地理解的目的已經(jīng)通過(guò)解釋和實(shí)施例在一定程度上詳細(xì)描述了上述本發(fā)明，但是顯然抗原在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以進(jìn)行某些改變和變型。
序列表<110>TriPath Imaging，Inc.
Fischer，Timothy J.
Whitehead，Clark M.
Malinowski，Douglas P.
Marcelpoil，RaphaelMorel，Didier<120>用于評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的方法和組合物<130>46143/296716<150>60/612,073<151>2004-09-22<150>60/611,965<151>2004-09-22<160>41<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>598<212>DNA<213>人類(lèi)<220>
<221>CDS<222>(23)...(421)<400>1cagagtcact cctgccttca cc atg aag tcc agc ggc ctc ttc ccc ttc ctg 52Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu1 5 10gtg ctg ctt gcc ctg gga act ctg gca cct tgg gct gtg gaa ggc tct100Val Leu Leu Ala Leu Gly Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser15 20 25gga aag tcc ttc aaa gct gga gtc tgt cct cct aag aaa tct gcc cag148
Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln30 35 40tgc ctt aga tac aag aaa cct gag tgc cag agt gac tgg cag tgt cca196Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro45 50 55ggg aag aag aga tgt tgt cct gac act tgt ggc atc aaa tgc ctg gat244Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp60 65 70cct gtt gac acc cca aac cca aca agg agg aag cct ggg aag tgc cca292Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro75 80 85 90gtg act tat ggc caa tgt ttg atg ctt aac ccc ccc aat ttc tgt gag340Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu95 100 105atg gat ggc cag tgc aag cgt gac ttg aag tgt tgc atg ggc atg tgt388Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys110 115 120ggg aaa tcc tgc gtt tcc cct gtg aaa gct tga ttcctgccat atggaggagg 441Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala *125 130ctctggagtc ctgctctgtg tggtccaggt cctttccacc ctgagacttg gctccaccac 501tgatatcctc ctttggggaa aggcttggca cacagcaggc tttcaagaag tgccagttga 561tcaatgaata aataaacgag cctatttctc tttgcac 598<210>2<211>132<212>PRT<213>人類(lèi)<400>2Met Lys Ser Ser Gly Leu Phe Pro Phe Leu Val Leu Leu Ala Leu Gly1 5 10 15Thr Leu Ala Pro Trp Ala Val Glu Gly Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala20 25 30Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys35 40 45Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys
50 55 60Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn65 70 75 80Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys85 90 95Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys100 105 110Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser115 120 125Pro Val Lys Ala130<210>3<211>1513<212>DNA<213>人類(lèi)<220>
<221>CDS<222>(236)...(742)<400>3attcacttct cacaaggact gggtgaagag ttctgcagcc ttacagagac tggaaaagaa60gcccaaacca aggcccccag agaggtcccc caggcccctt tgggtccctg agcctcagct120ggaggtgggg ggtgcctgca gtgcgctggc tcagtctcct tctgaaaagc tggatccagc180ttgtttgaag cccttgagct gatcttagat ccggcgcagg agaccaacgc ctgcc atg 238Met1ctg ttc cgg ctc tca gag cac tcc tca cca gag gag gaa gcc tcc ccc 286Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu Glu Glu Ala Ser Pro5 10 15cac cag aga gcc tca gga gag ggg cac cat ctc aag tcg aag aga ccc 334His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu Lys Ser Lys Arg Pro20 25 30aac ccc tgt gcc tac aca cca cct tcg ctg aaa gct gtg cag cgc att 382Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys Ala Val Gln Arg Ile35 40 45gct gag tct cac ctg cag tct atc agc aat ttg aat gag aac cag gcc 430Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu Asn Glu Asn Gln Ala
50 55 60 65tca gag gag gag gat gag ctg ggg gag ctt cgg gag ctg ggt tat cca 478Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Pro70 75 80aga gag gaa gat gag gag gaa gag gag gat gat gaa gaa gag gaa gaa 526Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu85 90 95gaa gag gac agc cag gct gaa gtc ctg aag gtc atc agg cag tct gct 574Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser Ala100 105 110ggg caa aag aca acc tgt ggc cag ggt ctg gaa ggg ccc tgg gag cgc 622Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu Arg115 120 125cca ccc cct ctg gat gag tcc gag aga gat gga ggc tct gag gac caa 670Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp Gln130 135 140 145gtg gaa gac cca gca cta agt gag cct ggg gag gaa cct cag cgc cct 718Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg Pro150 155 160tcc ccc tct gag cct ggc aca tag gcacccagcc tgcatctccc aggaggaagt 772Ser Pro Ser Glu Pro Gly Thr *165ggaggggaca tcgctgttcc ccagaaaccc actctatcct caccctgttt tgtgctcttc832ccctcgcctg ctagggctgc ggcttctgac ttctagaaga ctaaggctgg tctgtgtttg892cttgtttgcc cacctttggc tgatacccag agaacctggg cacttgctgc ctgatgccca952cccctgccag tcattcctcc attcacccag cgggaggtgg gatgtgagac agcccacatt1012ggaaaatcca gaaaaccggg aacagggatt tgcccttcac aattctactc cccagatcct1072ctcccctgga cacaggagac ccacagggca ggaccctaag atctggggaa aggaggtcct1132gagaaccttg aggtaccctt agatcctttt ctacccactt tcctatggag gattccaagt1192caccacttct ctcaccggct tctaccaggg tccaggacta aggcgttttt ctccatagcc1252tcaacatttt gggaatcttc ccttaatcac ccttgctcct cctgggtgcc tggaagatgg1312actggcagag acctctttgt tgcgttttgt gctttgatgc caggaatgcc gcctagttta1372tgtccccggt ggggcacaca gcggggggcg ccaggttttc cttgtccccc agctgctctg1432cccctttccc cttcttccct gactccaggc ctgaacccct cccgtgctgt aataaatctt1492tgtaaataac aaaaaaaaaa a 1513
<210>4<211>168<212>PRT<213>人類(lèi)<400>4Met Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu Glu Glu Ala Ser1 5 10 15Pro His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu Lys Ser Lys Arg20 25 30Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys Ala Val Gln Arg35 40 45Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu Asn Glu Asn Gln50 55 60Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu Gly Tyr65 70 75 80Pro Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu85 90 95Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val Ile Arg Gln Ser100 105 110Ala Gly Gln Lys Thr Thr Cys Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro Trp Glu115 120 125Arg Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Asp130 135 140Gln Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu Glu Pro Gln Arg145 150 155 160Pro Ser Pro Ser Glu Pro Gly Thr165<210>5<211>748<212>DNA<213>人類(lèi)<220>
<22l>CDS<222>(8)...(355)<400>5ggccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc 49Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro1 5 10
gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt 97Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys15 20 25 30gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg 145Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val35 40 45aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca 193Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr50 55 60ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg 241Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu65 70 75gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga 289Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg80 85 90aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct 337Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro95 100 105 110ccc tgc gtc atc ctg tga ctgcacagga ctctgggttc ctgctctgtt 385Pro Cys Val Ile Leu *115ctggggtcca aaccttggtc tccctttggt cctgctggga gctccccctg cctctttccc445ctacttagct ccttagcaaa gagaccctgg cctccacttt gccctttggg tacaaagaag505gaatagaaga ttccgtggcc ttgggggcag gagagagaca ctctccatga acacttctcc565agccacctca tacccccttc ccagggtaag tgcccacgaa agcccagtcc actcttcgcc625tcggtaatac ctgtctgatg ccacagattt tatttattct cccctaaccc agggcaatgt685cagctattgg cagtaaagtg gcgctacaaa cactaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa745aaa 748<210>6<211>115<212>PRT<213>人類(lèi)<400>6Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro Glu Glu1 5 10 15
Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys Glu Pro20 25 30Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val Lys Glu35 40 45Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr Gly Ala50 55 60Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu Glu Asn65 70 75 80Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg Arg Ala85 90 95Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro Pro Cys100 105 110Val Ile Leu115<210>7<211>3020<212>DNA<213>人類(lèi)<220>
<221>CDS<222>(111)...(1295)<400>7tgaagctcgt cagttcacca tccgccctcg gcttccgcgg ggcgctgggc cgccagcctc60ggcaccgtcc tttcctttct ccctcgcgtt aggcaggtga cagcagggac atg tct 116Met Ser1cgg gag atg cag gat gta gac ctc gct gag gtg aag cct ttg gtg gag 164Arg Glu Met Gln Asp Val Asp Leu Ala Glu Val Lys Pro Leu Val Glu5 10 15aaa ggg gag acc atc acc ggc ctc ctg caa gag ttt gat gtc cag gag 212Lys Gly Glu Thr Ile Thr Gly Leu Leu Gln Glu Phe Asp Val Gln Glu20 25 30cag gac atc gag act tta cat ggc tct gtt cac gtc acg ctg tgt ggg 260Gln Asp Ile Glu Thr Leu His Gly Ser Val His Val Thr Leu Cys Gly35 40 45 50act ccc aag gga aac cgg cct gtc atc ctc acc tac cat gac atc ggc 308
Thr Pro Lys Gly Asn Arg Pro Val Ile Leu Thr Tyr His Asp Ile Gly55 60 65atg aac cac aaa acc tgc tac aac ccc ctc ttc aac tac gag gac atg 356Met Asn His Lys Thr Cys Tyr Asn Pro Leu Phe Asn Tyr Glu Asp Met70 75 80cag gag atc acc cag cac ttt gcc gtc tgc cac gtg gac gcc cct ggc 404Gln Glu Ile Thr Gln His Phe Ala Val Cys His Val Asp Ala Pro Gly85 90 95cag cag gac ggc gca gcc tcc ttc ccc gca ggg tac atg tac ccc tcc 452Gln Gln Asp Gly Ala Ala Ser Phe Pro Ala Gly Tyr Met Tyr Pro Ser100 105 110atg gat cag ctg gct gaa atg ctt cct gga gtc ctt caa cag ttt ggg 500Met Asp Gln Leu Ala Glu Met Leu Pro Gly Val Leu Gln Gln Phe Gly115 120 125 130ctg aaa agc att att ggc atg gga aca gga gca ggc gcc tac acc cta 548Leu Lys Ser Ile Ile Gly Met Gly Thr Gly Ala Gly Ala Tyr Thr Leu135 140 145act cga ttt gct cta aac aac cct gag atg gtg gag ggc ctt gtc ctt 596Thr Arg Phe Ala Leu Asn Asn Pro Glu Met Val Glu Gly Leu Val Leu150 155 160atc aac gtg aac cct tgt gcg gaa ggc tgg atg gac tgg gcc gcc tcc 644Ile Asn Val Asn Pro Cys Ala Glu Gly Trp Met Asp Trp Ala Ala Ser165 170 175aag atc tca gga tgg acc caa gct ctg ccg gac atg gtg gtg tcc cac 692Lys Ile Ser Gly Trp Thr Gln Ala Leu Pro Asp Met Val Val Ser His180 185 190ctt ttt ggg aag gaa gaa atg cag agt aac gtg gaa gtg gtc cac acc 740Leu Phe Gly Lys Glu Glu Met Gln Ser Asn Val Glu Val Val His Thr195 200 205 210tac cgc cag cac att gtg aat gac atg aac ccc ggc aac ctg cac ctg 788Tyr Arg Gln His Ile Val Asn Asp Met Asn Pro Gly Asn Leu His Leu215 220 225ttc atc aat gcc tac aac agc cgg cgc gac ctg gag att gag cga cca 836
Phe Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Arg Asp Leu Glu Ile Glu Arg Pro230 235 240atg ccg gga acc cac aca gtc acc ctg cag tgc cct gct ctg ttg gtg 884Met Pro Gly Thr His Thr Val Thr Leu Gln Cys Pro Ala Leu Leu Val245 250 255gtt ggg gac agc tcg cct gca gtg gat gcc gtg gtg gag tgc aac tca 932Val Gly Asp Ser Ser Pro Ala Val Asp Ala Val Val Glu Cys Asn Ser260 265 270aaa ttg gac cca aca aag acc act ctc ctc aag atg gcg gac tgt ggc 980Lys Leu Asp Pro Thr Lys Thr Thr Leu Leu Lys Met Ala Asp Cys Gly275 280 285 290ggc ctc ccg cag atc tcc cag ccg gcc aag ctc gct gag gcc ttc aag 1028Gly Leu Pro Gln Ile Ser Gln Pro Ala Lys Leu Ala Glu Ala Phe Lys295 300 305tac ttc gtg cag ggc atg gga tac atg ccc tcg gct agc atg acc cgc 1076Tyr Phe Val Gln Gly Met Gly Tyr Met Pro Ser Ala Ser Met Thr Arg310 315 320ctg atg cgg tcc cgc aca gcc tct ggt tcc agc gtc act tct ctg gat 1124Leu Met Arg Ser Arg Thr Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ser Leu Asp325 330 335ggc acc cgc agc cgc tcc cac acc agc gag ggc acc cga agc cgc tcc 1172Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser340 345 350cac acc agc gag ggc acc cgc agc cgc tcg cac acc agc gag ggg gcc 1220His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Ala355 360 365 370cac ctg gac atc acc ccc aac tcg ggt gct gct ggg aac agc gcc ggg 1268His Leu Asp Ile Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ala Gly Asn Ser Ala Gly375 380 385ccc aag tcc atg gag gtc tcc tgc tag gcggcctgcc cagctgccgc 1315Pro Lys Ser Met Glu Val Ser Cys *390ccccggactc tgatctctgt agtggccccc tcctccccgg ccccttttcg ccccctgcct 1375
gccatactgc gcctaactcg gtattaatcc aaagcttatt ttgtaagagt gagctctggt1435ggagacaaat gaggtctatt acgtgggtgc cctctccaaa ggcggggtgg cggtggacca1495aaggaaggaa gcaagcatct ccgcatcgca tcctcttcca ttaaccagtg gccggttgcc1555actctcctcc cctccctcag agacaccaaa ctgccaaaaa caagacgcgt agcagcacac1615acttcacaaa gccaagccta ggccgccctg agcatcctgg ttcaaacggg tgcctggtca1675gaaggccagc cgcccacttc ccgtttcctc tttaactgag gagaagctga tccagctttc1735cggaaacaaa atccttttct tcatttgggg aggggggtaa tagtgacatg caggcacctc1795ttttaaacag gcaaaacagg aagggggaaa aggtgggatt catgtcgagg ctagaggcat1855ttggaacaac aaatctacgt agttaacttg aagaaaccga tttttaaagt tggtgcatct1915agaaagcttt gaatgcagaa gcaaacaagc ttgatttttc tagcatcctc ttaatgtgca1975gcaaaagcag gcaacaaaat ctcctggctt tacagacaaa aatatttcag caaacgttgg2035gcatcatggt ttttgaaggc tttagttctg ctttctgcct ctcctccaca gccccaacct2095cccacccctg atacatgagc cagtgattat tcttgttcag ggagaagatc atttagattt2155gttttgcatt ccttagaatg gagggcaaca ttccacagct gccctggctg tgatgagtgt2215ccttgcaggg gccggagtag gagcactggg gtgggggcgg aattggggtt actcgatgta2275agggattcct tgttgttgtg ttgagatcca gtgcagttgt gatttctgtg gatcccagct2335tggtccagga attttgagag attggcttaa atccagtttt caatcttcga cagctgggct2395ggaacgtgaa ctcagtagct gaacctgtct gacccggtca cgttcttgga tcctcagaac2455tctttgctct tgtcggggtg ggggtgggaa ctcacgtggg gagcggtggc tgagaaaatg2515taaggattct ggaatacata ttccatggac tttccttccc tctcctgctt cctcttttcc2575tgctccctaa cctttcgccg aatggggcag acaaacactg acgtttctgg gtggccagtg2635cggctgccag gttcctgtac tactgccttg tacttttcat tttggctcac cgtggatttt2695ctcataggaa gtttggtcag agtgaattga atattgtaag tcagccactg ggacccgagg2755atttctggga ccccgcagtt gggaggagga agtagtccag ccttccaggt gggcgtgaga2815ggcaatgact cgttacctgc cgcccatcac cttggaggcc ttccctggcc ttgagtagaa2875aagtcgggga tcggggcaag agaggctgag tacggatggg aaactattgt gcacaagtct2935ttccagagga gtttcttaat gagatatttg tatttatttc cagaccaata aatttgtaac2995tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 3020<210>8<211>394<212>PRT<213>人類(lèi)<400>8Met Ser Arg Glu Met Gln Asp Val Asp Leu Ala Glu Val Lys Pro Leu1 5 10 15Val Glu Lys Gly Glu Thr Ile Thr Gly Leu Leu Gln Glu Phe Asp Val20 25 30Gln Glu Gln Asp Ile Glu Thr Leu His Gly Ser Val His Val Thr Leu35 40 45Cys Gly Thr Pro Lys Gly Asn Arg Pro Val Ile Leu Thr Tyr His Asp50 55 60Ile Gly Met Asn His Lys Thr Cys Tyr Asn Pro Leu Phe Asn Tyr Glu
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gtg gag gag ctg cgc tcg ctg agg cag ctg cat ctg aac cag ctg atc915Val Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Gln Leu His Leu Asn Gln Leu Ile285 290 295cgc acc agt ggg gtg gtg acc agc tgc act ggc gtc ctg ccc cag ctc963Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Ser Cys Thr Gly Val Leu Pro Gln Leu300 305 310agc atg gtc aag tac aac tgc aac aag tgc aat ttc gtc ctg ggt cct1011Ser Met Val Lys Tyr Asn Cys Asn Lys Cys Asn Phe Val Leu Gly Pro315 320 325ttc tgc cag tcc cag aac cag gag gtg aaa cca ggc tcc tgt cct gag1059Phe Cys Gln Ser Gln Asn Gln Glu Val Lys Pro Gly Ser Cys Pro Glu330 335 340 345tgc cag tcg gcc ggc ccc ttt gag gtc aac atg gag gag acc atc tat1107Cys Gln Ser Ala Gly Pro Phe Glu Val Asn Met Glu Glu Thr Ile Tyr350 355 360cag aac tac cag cgt atc cga atc cag gag agt cca ggc aaa gtg gcg1155Gln Asn Tyr Gln Arg Ile Arg Ile Gln Glu Ser Pro Gly Lys Val Ala365 370 375gct ggc cgg ctg ccc cgc tcc aag gac gcc att ctc ctc gca gat ctg1203Ala Gly Arg Leu Pro Arg Ser Lys Asp Ala Ile Leu Leu Ala Asp Leu380 385 390gtg gac agc tgc aac gca gga gac gag ata gag ctg act ggc atc tat1251Val Asp Ser Cys Asn Ala Gly Asp Glu Ile Glu Leu Thr Gly Ile Tyr395 400 405cac aac aac tat gat ggc tcc ctc aac act gcc aat ggc ttc cct gtc1299His Asn Asn Tyr Asp Gly Ser Leu Asn Thr Ala Asn Gly Phe Pro Val410 415 420 425ttt gcc act gtc atc cta gcc aac cac gtg gcc aag aag gac aac aag1347Phe Ala Thr Val Ile Leu Ala Asn His Val Ala Lys Lys Asp Asn Lys430 435 440gtt gct gta ggg gaa ctg acc gat gaa gat gtg aag atg atc act agc1395Val Ala Val Gly Glu Leu Thr Asp Glu Asp Val Lys Met Ile Thr Ser445 450 455
ctc tcc aag gat cag cag atc gga gag aag atc ttt gcc agc att gct1443Leu Ser Lys Asp Gln Gln Ile Gly Glu Lys Ile Phe Ala Ser Ile Ala460 465 470cct tcc atc tat ggt cat gaa gac atc aag aga ggc ctg gct ctg gcc1491Pro Ser Ile Tyr Gly His Glu Asp Ile Lys Arg Gly Leu Ala Leu Ala475 480 485ctg ttc gga ggg gag ccc aaa aac cca ggt ggc aag cac aag gta cgt1539Leu Phe Gly Gly Glu Pro Lys Asn Pro Gly Gly Lys His Lys Val Arg490 495 500 505ggt gat atc aac gtg ctc ttg tgc gga gac cct ggc aca gcg aag tcg1587Gly Asp Ile Asn Val Leu Leu Cys Gly Asp Pro Gly Thr Ala Lys Ser510 515 520cag ttt ctc aag tat att gag aaa gtg tcc agc cga gcc atc ttc acc1635Gln Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Lys Val Ser Ser Arg Ala Ile Phe Thr525 530 535act ggc cag ggg gcg tcg gct gtg ggc ctc acg gcg tat gtc cag cgg1683Thr Gly Gln Gly Ala Ser Ala Val Gly Leu Thr Ala Tyr Val Gln Arg540 545 550cac cct gtc agc agg gag tgg acc ttg gag gct ggg gcc ctg gtt ctg1731His Pro Val Ser Arg Glu Trp Thr Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu555 560 565gct gac cga gga gtg tgt ctc att gat gaa ttt gac aag atg aat gac1779Ala Asp Arg Gly Val Cys Leu Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Asn Asp570 575 580 585cag gac aga acc agc atc cat gag gcc atg gag caa cag agc atc tcc1827Gln Asp Arg Thr Ser Ile His Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser590 595 600atc tcg aag gct ggc atc gtc acc tcc ctg cag gct cgc tgc acg gtc1875Ile Ser Lys Ala Gly Ile Val Thr Ser Leu Gln Ala Arg Cys Thr Val605 610 615att gct gcc gcc aac ccc ata gga ggg cgc tac gac ccc tcg ctg act1923Ile Ala Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Arg Tyr Asp Pro Ser Leu Thr620 625 630
ttc tct gag aac gtg gac ctc aca gag ccc atc atc tca cgc ttt gac1971Phe Ser Glu Asn Val Asp Leu Thr Glu Pro Ile Ile Ser Arg Phe Asp635 640 645atc ctg tgt gtg gtg agg gac acc gtg gac cca gtc cag gac gag atg2019Ile Leu Cys Val Val Arg Asp Thr Val Asp Pro Val Gln Asp Glu Met650 655 660 665ctg gcc cgc ttc gtg gtg ggc agc cac gtc aga cac cac ccc agc aac2067Leu Ala Arg Phe Val Val Gly Ser His Val Arg His His Pro Ser Asn670 675 680aag gag gag gag ggg ctg gcc aat ggc agc gct gct gag ccc gcc atg2115Lys Glu Glu Glu Gly Leu Ala Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Ala Met685 690 695ccc aac acg tat ggc gtg gag ccc ctg ccc cag gag gtc ctg aag aag2163Pro Asn Thr Tyr Gly Val Glu Pro Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Lys700 705 710tac atc atc tac gcc aag gag agg gtc cac ccg aag ctc aac cag atg2211Tyr Ile Ile Tyr Ala Lys Glu Arg Val His Pro Lys Leu Asn Gln Met715 720 725gac cag gac aag gtg gcc aag atg tac agt gac ctg agg aaa gaa tct2259Asp Gln Asp Lys Val Ala Lys Met Tyr Ser Asp Leu Arg Lys Glu Ser730 735 740 745atg gcg aca ggc agc atc ccc att acg gtg cgg cac atc gag tcc atg2307Met Ala Thr Gly Ser Ile Pro Ile Thr Val Arg His Ile Glu Ser Met750 755 760atc cgc atg gcg gag gcc cac gcg cgc atc cat ctg cgg gac tat gtg2355Ile Arg Met Ala Glu Ala His Ala Arg Ile His Leu Arg Asp Tyr Val765 770 775atc gaa gac gac gtc aac atg gcc atc cgc gtg atg ctg gag agc ttc2403Ile Glu Asp Asp Val Asn Met Ala Ile Arg Val Met Leu Glu Ser Phe780 785 790ata gac aca cag aag ttc agc gtc atg cgc agc atg cgc aag act ttt2451Ile Asp Thr Gln Lys Phe Ser Val Met Arg Ser Met Arg Lys Thr Phe795 800 805
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<221>CDS<222>(58)...(1605)<400>19gaattccctg gctgcttgaa tctgttctgc cccctcccca cccatttcac caccacc atg60Met1aca ccg ggc acc cag tct cct ttc ttc ctg ctg ctg ctc ctc aca gtg 108Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr Val5 10 15ctt aca gtt gtt aca ggt tct ggt cat gca agc tct acc cca ggt gga 156
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Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys370 375 380 385acg gaa gca gcc tct cga tat aac ctg acg atc tca gac gtc agc gtg1260Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val390 395 400agt gat gtg cca ttt cct ttc tct gcc cag tct ggg gct ggg gtg cca1308Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro405 410 415ggc tgg ggc atc gcg ctg ctg gtg ctg gtc tgt gtt ctg gtt gcg ctg1356Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu420 425 430gcc att gtc tat ctc att gcc ttg gct gtc tgt cag tgc cgc cga aag1404Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys435 440 445aac tac ggg cag ctg gac atc ttt cca gcc cgg gat acc tac cat cct1452Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro450 455 460 465atg agc gag tac ccc acc tac cac acc cat ggg cgc tat gtg ccc cct1500Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro470 475 480agc agt acc gat cgt agc ccc tat gag aag gtt tct gca ggt aat ggt1548Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly485 490 495ggc agc agc ctc tct tac aca aac cca gca gtg gca gcc act tct gcc1596Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala500 505 510aac ttg tag gggcacgtcg ccctctgagc tgagtggcca gccagtgcca1645Asn Leu *515ttccactcca ctcagggctc tctgggccag tcctcctggg agcccccacc acaacacttc 1705ccaggcatgg aattcc 1721<210>20<211>515
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195 200 205Arg Glu Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser210 215 220Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu225 230 235 240Asn Ile His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu245 250 255Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp260 265 270His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu275 280 285Asp Asn Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr290 295 300Asn Tyr Cys Phe Arg305<210>27<211>6378<212>DNA<213>人類(lèi)<220>
<221>CDS<222>(140)...(3409)<400>27cccattactg ttggagctac agggagagaa acaggaggag actgcaagag atcatttggg60aaggccgtgg gcacgctctt tactccatgt gtgggacatt cattgcggaa taacatcgga120ggagaagttt cccagagct atg ggg act tcc cat ccg gcg ttc ctg gtc tta 172Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu1 5 10ggc tgt ctt ctc aca ggg ctg agc cta atc ctc tgc cag ctt tca tta 220Gly Cys Leu Leu Thr Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu15 20 25ccc tct atc ctt cca aat gaa aat gaa aag gtt gtg cag ctg aat tca 268Pro Ser Ile Leu Pro Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser30 35 40tcc ttt tct ctg aga tgc ttt ggg gag agt gaa gtg agc tgg cag tac 316Ser Phe Ser Leu Arg Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr45 50 55
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ctaacttgat agggtctacc aatacaaaat gtattacgaa tgcccctgtt catgtttttg6319ttttaaaacg tgtaaatgaa gatctttata tttcaataaa tgatatataa tttaaagtt 6378<210>28<211>1089<212>PRT<213>人類(lèi)<400>28Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr1 5 10 15Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro20 25 30Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg35 40 45Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu50 55 60Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arg Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu65 70 75 80Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly85 90 95Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu100 105 110Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe115 120 125Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp130 135 140Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr145 150 155 160Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln165 170 175Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr180 185 190Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu195 200 205Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val210 215 220Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn225 230 235 240Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys245 250 255Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val260 265 270Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr
275 280 285Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys290 295 300Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr305 310 315 320Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val325 330 335Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn340 345 350Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu355 360 365Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala370 375 380Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp385 390 395 400Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser405 410 415Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr420 425 430Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met435 440 445Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile450 455 460Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp465 470 475 480Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr485 490 495Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg500 505 510Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala515 520 525Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val530 535 540Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg545 550 555 560Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp565 570 575Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly580 585 590Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val595 600 605Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val610 615 620Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala
625 630 635 640Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn645 650 655Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile660 665 670Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys675 680 685Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu690 695 700Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr705 710 715 720Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln725 730 735Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser740 745 750Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr755 760 765Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp770 775 780Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr785 790 795 800Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His805 810 815Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val820 825 830Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn835 840 845Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro850 855 860Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser865 870 875 880Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr885 890 895Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly900 905 910Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile915 920 925Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr930 935 940His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys945 950 955 960Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala965 970 975Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr
980 985 990Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp995 10001005Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro Asp101010151020Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn Arg His102510301035 1040Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly Ser Ser Ser104510501055Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu Asp Ile Asp Met106010651070Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu Val Glu Asp Ser Phe107510801085Leu<210>29<211>2121<212>DNA<213>人類(lèi)<220>
<221>CDS<222>(559)...(1878)<400>29ctgctcgcgg ccgccaccgc cgggccccgg ccgtccctgg ctcccctcct gcctcgagaa60gggcagggct tctcagaggc ttggcgggaa aaaagaacgg agggagggat cgcgctgagt120ataaaagccg gttttcgggg ctttatctaa ctcgctgtag taattccagc gagaggcaga180gggagcgagc gggcggccgg ctagggtgga agagccgggc gagcagagct gcgctgcggg240cgtcctggga agggagatcc ggagcgaata gggggcttcg cctctggccc agccctcccg300cttgatcccc caggccagcg gtccgcaacc cttgccgcat ccacgaaact ttgcccatag360cagcgggcgg gcactttgca ctggaactta caacacccga gcaaggacgc gactctcccg420acgcggggag gctattctgc ccatttgggg acacttcccc gccgctgcca ggacccgctt480ctctgaaagg ctctccttgc agctgcttag acgctggatt tttttcgggt agtggaaaac540cagcagcctc ccgcgacg atg ccc ctc aac gtt agc ttc acc aac agg aac 591Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn1 5 10tat gac ctc gac tac gac tcg gtg cag ccg tat ttc tac tgc gac gag 639Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu15 20 25
gag gag aac ttc tac cag cag cag cag cag agc gag ctg cag ccc ccg687Glu Glu Asn Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro30 35 40gcg ccc agc gag gat atc tgg aag aaa ttc gag ctg ctg ccc acc ccg735Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro45 50 55ccc ctg tcc cct agc cgc cgc tcc ggg ctc tgc tcg ccc tcc tac gtt783Pro Leu Ser Pro Ser Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val60 65 70 75gcg gtc aca ccc ttc tcc ctt cgg gga gac aac gac ggc ggt ggc ggg831Ala Val Thr Pro Phe Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly80 85 90agc ttc tcc acg gcc gac cag ctg gag atg gtg acc gag ctg ctg gga879Ser Phe Ser Thr Ala Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly95 100 105gga gac atg gtg aac cag agt ttc atc tgc gac ccg gac gac gag acc927Gly Asp Met Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr110 115 120ttc atc aaa aac atc atc atc cag gac tgt atg tgg agc ggc ttc tcg975Phe Ile Lys Asn Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser125 130 135gcc gcc gcc aag ctc gtc tca gag aag ctg gcc tcc tac cag gct gcg1023Ala Ala Ala Lys Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala140 145 150 155cgc aaa gac agc ggc agc ccg aac ccc gcc cgc ggc cac agc gtc tgc1071Arg Lys Asp Ser Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys160 165 170tcc acc tcc agc ttg tac ctg cag gat ctg agc gcc gcc gcc tca gag1119Ser Thr Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu175 180 185tgc atc gac ccc tcg gtg gtc ttc ccc tac cct ctc aac gac agc agc1167Cys Ile Asp Pro Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser190 195 200
tcg ccc aag tcc tgc gcc tcg caa gac tcc agc gcc ttc tct ccg tcc1215Ser Pro Lys Ser Cys Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser205 210 215tcg gat tct ctg ctc tcc tcg acg gag tcc tcc ccg cag ggc agc ccc1263Ser Asp Ser Leu Leu Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro220 225 230 235gag ccc ctg gtg ctc cat gag gag aca ccg ccc acc acc agc agc gac1311Glu Pro Leu Val Leu His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp240 245 250tct gag gag gaa caa gaa gat gag gaa gaa atc gat gtt gtt tct gtg1359Ser Glu Glu Glu Gln Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val255 260 265gaa aag agg cag gct cct ggc aaa agg tca gag tct gga tca cct tct1407Glu Lys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser270 275 280gct gga ggc cac agc aaa cct cct cac agc cca ctg gtc ctc aag agg1455Ala Gly Gly His Ser Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg285 290 295tgc cac gtc tcc aca cat cag cac aac tac gca gcg cct ccc tcc act1503Cys His Val Ser Thr His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr300 305 310 315cgg aag gac tat cct gct gcc aag agg gtc aag ttg gac agt gtc aga1551Arg Lys Asp Tyr Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg320 325 330gtc ctg aga cag atc agc aac aac cga aaa tgc acc agc ccc agg tcc1599Val Leu Arg Gln Ile Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser335 340 345tcg gac acc gag gag aat gtc aag agg cga aca cac aac gtc ttg gag1647Ser Asp Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu350 355 360cgc cag agg agg aac gag cta aaa cgg agc ttt ttt gcc ctg cgt gac1695Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp365 370 375
cag atc ccg gag ttg gaa aac aat gaa aag gcc ccc aag gta gtt atc 1743Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile380 385 390 395ctt aaa aaa gcc aca gca tac atc ctg tcc gtc caa gca gag gag caa 1791Leu Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln400 405 410aag ctc att tct gaa gag gac ttg ttg cgg aaa cga cga gaa cag ttg 1839Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu415 420 425aaa cac aaa ctt gaa cag cta cgg aac tct tgt gcg taa ggaaaagtaa 1888Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala *430 435ggaaaacgat tccttctaac agaaatgtcc tgagcaatca cctatgaact tgtttcaaat1948gcatgatcaa atgcaacctc acaaccttgg ctgagtcttg agactgaaag atttagccat2008aatgtaaact gcctcaaatt ggactttggg cataaaagaa cttttttatg cttaccatct2068tttttttttc tttaacagat ttgtatttaa gaattgtttt taaaaaattt taa 2121<210>30<211>439<212>PRT<213>人類(lèi)<400>30Met Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr1 5 10 15Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr20 25 30Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp35 40 45Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser50 55 60Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe65 70 75 80Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala85 90 95Asp Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn100 105 110Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile115 120 125Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu
130 135 140Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly145 150 155 160Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu165 170 175Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser180 185 190Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys195 200 205Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu210 215 220Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu225 230 235 240His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln245 250 255Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala260 265 270Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser275 280 285Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr290 295 300His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro305 310 315 320Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile325 330 335Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu340 345 350Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn355 360 365Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu370 375 380Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr385 390 395 400Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu405 410 415Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu420 425 430Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala435<210>31<211>1374<212>DNA
<213>人類(lèi)<220>
<221>CDS<222>(103)...(1047)<400>31ggacagcttg gagatagggc ccggaattgc gggcgtcact ctgctcctgc gacctagcca60ggcgtgaggg agtgacagca gcgcattcgc gggacgagag cg atg agt gag aac 114Met Ser Glu Asn1gcc gca cca ggt ctg atc tca gag ctg aag ctg gct gtg ccc tgg ggc 162Ala Ala Pro Gly Leu Ile Ser Glu Leu Lys Leu Ala Val Pro Trp Gly5 10 15 20cac atc gca gcc aaa gcc tgg ggc tcc ctg cag ggc cct cca gtt ctc 210His Ile Ala Ala Lys Ala Trp Gly Ser Leu Gln Gly Pro Pro Val Leu25 30 35tgc ctg cac ggc tgg ctg gac aat gcc agc tcc ttc gac aga ctc atc 258Cys Leu His Gly Trp Leu Asp Asn Ala Ser Ser Phe Asp Arg Leu Ile40 45 50cct ctt ctc ccg caa gac ttt tat tac gtt gcc atg gat ttc gga ggt 306Pro Leu Leu Pro Gln Asp Phe Tyr Tyr Val Ala Met Asp Phe Gly Gly55 60 65cat ggg ctc tcg tcc cat tac agc cca ggt gtc cca tat tac ctc cag 354His Gly Leu Ser Ser His Tyr Ser Pro Gly Val Pro Tyr Tyr Leu Gln70 75 80act ttt gtg agt gag atc cga aga gtt gtg gca gcc ttg aaa tgg aat 402Thr Phe Val Ser Glu Ile Arg Arg Val Val Ala Ala Leu Lys Trp Asn85 90 95 100cga ttc tcc att ctg ggc cac age ttc ggt ggc gtc gtg ggc gga atg 450Arg Phe Ser Ile Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Val Val Gly Gly Met105 110 115ttt ttc tgt acc ttc ccc gag atg gtg gat aaa ctt atc ttg ctg gac 498Phe Phe Cys Thr Phe Pro Glu Met Val Asp Lys Leu Ile Leu Leu Asp120 125 130
acg ccg ctc ttt ctc ctg gaa tca gat gaa atg gag aac ttg ctg acc546Thr Pro Leu Phe Leu Leu Glu Ser Asp Glu Met Glu Asn Leu Leu Thr135 140 145tac aag cgg aga gcc ata gag cac gtg ctg cag gta gag gcc tcc cag594Tyr Lys Arg Arg Ala Ile Glu His Val Leu Gln Val Glu Ala Ser Gln150 155 160gag ccc tcg cac gtg ttc agc ctg aag cag ctg ctg cag agg tta ctg642Glu Pro Ser His Val Phe Ser Leu Lys Gln Leu Leu Gln Arg Leu Leu165 170 175 180aag agc aat agc cac ttg agt gag gag tgc ggg gag ctt ctc ctg caa690Lys Ser Asn Ser His Leu Ser Glu Glu Cys Gly Glu Leu Leu Leu Gln185 190 195aga gga acc acg aag gtg gcc aca ggt ctg gtt ctg aac aga gac cag738Arg Gly Thr Thr Lys Val Ala Thr Gly Leu Val Leu Asn Arg Asp Gln200 205 210agg ctc gcc tgg gca gag aac agc att gac ttc atc agc agg gag ctg786Arg Leu Ala Trp Ala Glu Asn Ser Ile Asp Phe Ile Ser Arg Glu Leu215 220 225tgt gcg cat tcc atc agg aag ctg cag gcc cat gtc ctg ttg atc aaa834Cys Ala His Ser Ile Arg Lys Leu Gln Ala His Val Leu Leu Ile Lys230 235 240gca gtc cac gga tat ttt gat tca aga cag aat tac tct gag aag gag882Ala Val His Gly Tyr Phe Asp Ser Arg Gln Asn Tyr Ser Glu Lys Glu245 250 255 260tcc ctg tcg ttc atg ata gac acg atg aaa tcc acc ctc aaa gag cag930Ser Leu Ser Phe Met Ile Asp Thr Met Lys Ser Thr Leu Lys Glu Gln265 270 275ttc cag ttt gtg gaa gtc cca ggc aat cac tgt gtc cac atg agc gaa978Phe Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Asn His Cys Val His Met Ser Glu280 285 290ccc cag cac gtg gcc agt atc atc agc tcc ttc tta cag tgc aca cac1026Pro Gln His Val Ala Ser Ile Ile Ser Ser Phe Leu Gln Cys Thr His295 300 305
atg ctc cca gcc cag ctg tag ctctgggcct ggaactatga agacctagtg 1077Met Leu Pro Ala Gln Leu *310ctcccagact caacactggg actctgagtt cctgagcccc acaacaaggc cagggatggt1137ggggacaggc ctcactagtc ttgaggccca gcctaggatg gtagtcaggg gaaggagcga1197gattccaact tcaacatctg tgacctcaag ggggagacag agtctgggtt ccagggctgc1257tttctcctgg ctaataataa atatccagcc agctggagga aggaagggca ggctgggccc1317acctagcctt tccctgctgc ccaactggat ggaaaataaa aggttcttgt attctca 1374<210>32<211>314<212>PRT<213>人類(lèi)<400>32Met Ser Glu Asn Ala Ala Pro Gly Leu Ile Ser Glu Leu Lys Leu Ala1 5 10 15Val Pro Trp Gly His Ile Ala Ala Lys Ala Trp Gly Ser Leu Gln Gly20 25 30Pro Pro Val Leu Cys Leu His Gly Trp Leu Asp Asn Ala Ser Ser Phe35 40 45Asp Arg Leu Ile Pro Leu Leu Pro Gln Asp Phe Tyr Tyr Val Ala Met50 55 60Asp Phe Gly Gly His Gly Leu Ser Ser His Tyr Ser Pro Gly Val Pro65 70 75 80Tyr Tyr Leu Gln Thr Phe Val Ser Glu Ile Arg Arg Val Val Ala Ala85 90 95Leu Lys Trp Asn Arg Phe Ser Ile Leu Gly His Ser Phe Gly Gly Val100 105 110Val Gly Gly Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Glu Met Val Asp Lys Leu115 120 125Ile Leu Leu Asp Thr Pro Leu Phe Leu Leu Glu Ser Asp Glu Met Glu130 135 140Asn Leu Leu Thr Tyr Lys Arg Arg Ala Ile Glu His Val Leu Gln Val145 150 155 160Glu Ala Ser Gln Glu Pro Ser His Val Phe Ser Leu Lys Gln Leu Leu165 170 175Gln Arg Leu Leu Lys Ser Asn Ser His Leu Ser Glu Glu Cys Gly Glu180 185 190Leu Leu Leu Gln Arg Gly Thr Thr Lys Val Ala Thr Gly Leu Val Leu195 200 205Asn Arg Asp Gln Arg Leu Ala Trp Ala Glu Asn Ser Ile Asp Phe Ile210 215 220
Ser Arg Glu Leu Cys Ala His Ser Ile Arg Lys Leu Gln Ala His Val225 230 235 240Leu Leu Ile Lys Ala Val His Gly Tyr Phe Asp Ser Arg Gln Asn Tyr245 250 255Ser Glu Lys Glu Ser Leu Ser Phe Met Ile Asp Thr Met Lys Ser Thr260 265 270Leu Lys Glu Gln Phe Gln Phe Val Glu Val Pro Gly Asn His Cys Val275 280 285His Met Ser Glu Pro Gln His Val Ala Ser Ile Ile Ser Ser Phe Leu290 295 300Gln Cys Thr His Met Leu Pro Ala Gln Leu305 310<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>33tacacaccac cttcgctgaa ag22<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>34ggcctggttc tcattcaaat tg22<210>35<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物
<400>35cgcattgctg agtctcacct gcagtc26<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>36cagccttaca gagactggaa aagaa 25<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>37gaggctcagg gacccaaag19<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>38ccaaaccaag gcccccagag aggt 24<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物
<400>39cctaccgcca gcacattgt19<210>40<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>40gctgttgtag gcattgatga aca 23<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TaqMan引物<400>41aatgacatga accccggcaa cctg 2權(quán)利要求
1.評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少一種生物標(biāo)記的超表達(dá)，其中所述的生物標(biāo)記選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6組成的組，其中所述生物標(biāo)記的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物標(biāo)記的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差。
3.用于評(píng)價(jià)淋巴結(jié)-陰性乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中檢測(cè)所述生物標(biāo)記的表達(dá)包含進(jìn)行免疫組織化學(xué)、核酸雜交或定量RT-PCR，其中所述生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
4.用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中檢測(cè)所述生物標(biāo)記的表達(dá)包含進(jìn)行免疫組織化學(xué)、核酸雜交或定量RT-PCR，其中不存在所述生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后良好，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中至少兩種生物標(biāo)記的超表達(dá)特異性將預(yù)后差的乳腺癌患者與預(yù)后良好的患者區(qū)分開(kāi)來(lái)。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的生物標(biāo)記參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、侵入、編程性細(xì)胞死亡、蛋白水解或轉(zhuǎn)移。
7.用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，其中所述的生物標(biāo)記選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6組成的組，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的生物標(biāo)記選自由SLPI、PSMB9、MUC-1、src、E2F1和p21ras組成的組。
9.權(quán)利要求7所述的方法，所述的方法包括檢測(cè)樣品中兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述的生物標(biāo)記為SLPI和E2F1，其中所述生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
10.權(quán)利要求7所述的方法，所述的方法包括檢測(cè)樣品中三種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述的生物標(biāo)記為SLPI、E2F1和MUC-1，其中所述生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
11.權(quán)利要求7所述的方法，所述的方法包括檢測(cè)樣品中四種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述的生物標(biāo)記為SLPI、E2F1、MUC-1和src，其中所述生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
12.權(quán)利要求7所述的方法，所述的方法包括檢測(cè)樣品中五種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述的生物標(biāo)記為E2F1、SLPI、MUC-1、src和p21ras，其中所述生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
13.權(quán)利要求7所述的方法，所述的方法包括檢測(cè)樣品中六種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述的生物標(biāo)記為E2F1、SLPI，MUC-1、src、p21ras和PSMB9，其中所述生物標(biāo)記中至少一種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
14.用于評(píng)價(jià)淋巴結(jié)-陰性乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差，其中使用時(shí)序檢驗(yàn)將所述的生物標(biāo)記確定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，以便評(píng)價(jià)因潛在的乳腺癌導(dǎo)致的乳腺癌復(fù)發(fā)或死亡的可能性，并且由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
15.權(quán)利要求3所述的方法，其中用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的所述的方法進(jìn)一步包含評(píng)價(jià)臨床信息。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的臨床信息包含腫瘤大小、腫瘤等級(jí)、淋巴結(jié)狀態(tài)和家族史。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的方法用于研發(fā)針對(duì)所述乳腺癌患者的治療策略。
18.權(quán)利要求3所述的方法，其中將用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的所述方法與分析Her2/neu表達(dá)水平相結(jié)合。
19.權(quán)利要求3所述的方法，其中將用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的所述方法與分析患者的雌激素受體或孕酮受體狀態(tài)相結(jié)合。
20.權(quán)利要求3所述的方法，其中用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的所述方法獨(dú)立于患者的雌激素受體狀態(tài)。
21.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的方法用于評(píng)價(jià)雌激素受體-陽(yáng)性或雌激素受體-陰性乳腺癌患者的預(yù)后。
22.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的乳腺癌患者具有早期乳腺癌。
23.用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括a)從所述患者中獲得樣品；b)使所述樣品接觸至少一種抗體，其中所述的抗體特異性結(jié)合生物標(biāo)記蛋白，其中所述的生物標(biāo)記蛋白選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6組成的組；c)檢測(cè)所述抗體與所述生物標(biāo)記蛋白的結(jié)合；d)測(cè)定所述生物標(biāo)記蛋白是否在所述樣品中超表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記蛋白的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差；和e)由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的生物標(biāo)記選自由E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9組成的組。
25.用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的方法，所述的方法包括a)從所述患者中獲得樣品；b)使所述樣品接觸至少兩種抗體，其中所述的抗體各自特異性結(jié)合不同的生物標(biāo)記蛋白；c)檢測(cè)所述抗體與所述生物標(biāo)記蛋白的結(jié)合；d)測(cè)定所述生物標(biāo)記蛋白是否在所述樣品中超表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記蛋白中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示預(yù)后差；和e)由此評(píng)價(jià)所述乳腺癌患者的預(yù)后。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的生物標(biāo)記選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6組成的組。
27.包含至少兩種抗體的試劑盒，其中所述抗體各自特異性結(jié)合預(yù)示乳腺癌患者預(yù)后差的不同的生物標(biāo)記蛋白。
28.權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述的生物標(biāo)記蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、侵入、編程性細(xì)胞死亡、蛋白水解或轉(zhuǎn)移。
29.權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述的生物標(biāo)記蛋白選自由SLPI、p21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6組成的組。
30.權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述的生物標(biāo)記蛋白選自由E2F1、SLPI、MUC-1、src、p21ras和PSMB9組成的組。
31.權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中該試劑盒進(jìn)一步包含用于檢測(cè)結(jié)合所述生物標(biāo)記蛋白的抗體的化學(xué)品。
32.權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中該試劑盒用于商品抗體結(jié)合檢測(cè)系統(tǒng)。
33.權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中該試劑盒進(jìn)一步包含陽(yáng)性對(duì)照樣品。
34.權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中該試劑盒進(jìn)一步包含使用說(shuō)明書(shū)。
35.預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)所選治療的反應(yīng)的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示陽(yáng)性治療反應(yīng)，且由此預(yù)測(cè)所述乳腺癌患者對(duì)所述治療的反應(yīng)。
36.預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)所選治療的反應(yīng)的方法，所述的方法包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示陰性治療反應(yīng)，且由此預(yù)測(cè)所述乳腺癌患者對(duì)所述治療的反應(yīng)。
37.預(yù)測(cè)乳腺癌患者存活可能性的方法，包括檢測(cè)來(lái)自所述患者的樣品中的至少五種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中所述生物標(biāo)記中無(wú)一超表達(dá)預(yù)示存活可能性增加，并且其中所述生物標(biāo)記中至少兩種的超表達(dá)預(yù)示存活可能性下降。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中增加數(shù)量的所述生物標(biāo)記的超表達(dá)預(yù)示存活可能性下降。
39.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的生物標(biāo)記選自由SLPI、D21ras、MUC-1、DARPP-32、磷酸-p27、src、MGC 14832、myc、TGFβ-3、SERHL、E2F1、PDGFRα、NDRG-1、MCM2、PSMB9和MCM6組成的組。
全文摘要
提供了用于評(píng)價(jià)乳腺癌患者，特別是早期階段乳腺癌患者預(yù)后的方法和組合物。本發(fā)明的方法包括檢測(cè)身體樣品中至少一種，更特別的是至少兩種生物標(biāo)記的表達(dá)，其中生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的組合的超表達(dá)預(yù)示乳腺癌預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，所述的身體樣品為乳腺組織樣品，特別是原發(fā)性乳腺腫瘤樣品。本發(fā)明的生物標(biāo)記為蛋白質(zhì)和/或基因，其超表達(dá)預(yù)示良好或差的癌癥預(yù)后。所關(guān)注的生物標(biāo)記包括參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、侵入、蛋白水解或轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)和基因。在本發(fā)明的某些方面中，使用生物標(biāo)記－特異性抗體在蛋白質(zhì)水平上或使用核酸雜交技術(shù)在核酸水平上檢測(cè)所關(guān)注的生物標(biāo)記的超表達(dá)。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101057144SQ200580038980
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者T·J·費(fèi)希爾, C·M·懷特黑德, D·P·馬利諾斯基, R·馬塞爾普瓦爾, D·莫雷爾 申請(qǐng)人:三路影像公司