專利名稱：一種可原位同時檢測多種常見小分子藥物的酶標(biāo)芯片法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種可原位同時檢測多種常見小分子藥物的酶標(biāo)芯片(Enzyme-link immunosorbentassay array，簡稱ELISA-array)技術(shù)，屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
興奮劑(Dope)的原義是一種供賽馬使用的鴉片類麻醉混合劑。當(dāng)今體育界對興奮劑的定義是能起到增強或輔助增強自身體能或控制能力，達(dá)到提高比賽成績的某些藥物或生理物質(zhì)的總稱。對于判定是否使用興奮劑，國際上的通常慣例是如果在比賽中運動員把違禁藥物以任何形式攝入體內(nèi)，或者以不正常的方法應(yīng)用了非正常量的生理物質(zhì)，這種人為的非法提高運動成績的做法就稱為使用興奮劑。當(dāng)今世界上濫用興奮劑的情況非常嚴(yán)重，以至于連前奧委會主席薩馬蘭奇都認(rèn)為服用違禁藥品是世界性問題，服用禁藥者擁有更先進(jìn)的科技水平，反禁藥的斗爭最多只能取得局部勝利，永遠(yuǎn)取得不了全面勝利。
另一方面，毒品濫用情況泛濫全球，吸毒者超過2億，每年死亡人數(shù)20多萬，因吸毒喪失勞動能力的1000多萬人，全球每年銷售總額大于10000億美元，成為僅次于軍火交易的世界第二大貿(mào)易。嚴(yán)峻的毒品泛濫對人類的生存和發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，成為世界性公害。近年來，在國際毒潮的影響下，早在建國初期就已絕跡的毒品問題再次殃及我國，已呈蔓延之勢，吸毒人群波及社會各階層，據(jù)不完全統(tǒng)計，中國的吸毒人數(shù)已達(dá)100多萬，我國已由毒品過境國轉(zhuǎn)變?yōu)槎酒愤^境與毒品消費并存的毒品受害國。毒品泛濫使毒品犯罪日趨嚴(yán)重，不僅發(fā)案率逐年上升，毒品數(shù)量越來越多，涉及地域越來越廣，而且向國際性毒品犯罪發(fā)展，嚴(yán)重地危害著我國的社會治安和現(xiàn)代化建設(shè)事業(yè)的順利發(fā)展。因此研究開發(fā)查禁毒品的新技術(shù)、新方法，不斷增強和提高對毒品犯罪的發(fā)現(xiàn)和控制能力是十分必要的。
現(xiàn)有的小分子藥物檢測(如毒品檢測或者興奮劑檢測)一般采用色譜、液譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法。藥物經(jīng)過機體的吸收、分布和代謝等過程，殘存于生物樣品中的藥物及其代謝物不僅含量低，而且與多種雜質(zhì)共存，為微量分析。要進(jìn)行分析首要的第一個難題就是生物樣品的前處理，不僅要選擇合理的提取方法，還要經(jīng)過分離和凈化，盡可能地除去雜質(zhì)后才能進(jìn)行儀器分析。目前，世界上多采用聯(lián)用儀器分析技術(shù)，就是對多組分有機化合物既要有分離又要有定性、定量鑒別功能，那就是氣/質(zhì)(Gas chromatography/Mass spectrometry，GC/MS)、液/質(zhì)(Liquid chromatography/Mass spectrometry，Lc/Ms)、氣/質(zhì)/質(zhì)(Gaschromatography/Mass spectrometry/Mass spectrometry，GC/MS/Ms)等分析法。這些大型分析儀器不僅價格昂貴，操作與維護(hù)復(fù)雜、難度大，而且一次只能分析一個樣品，分析過程長，難以實現(xiàn)高通量并行檢測的客觀需求。因此，當(dāng)前國際通行的興奮劑檢測一般并不能檢查所有參加比賽的運動員，而不得不采用隨機抽檢的方式。這種方式顯然不能體現(xiàn)公平競爭的運動精神。
生物芯片是于20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，它的核心思想和優(yōu)勢就是利用各種手段以實現(xiàn)高通量并行檢測的目的。生物芯片種類繁多，其中一個研究方向就是蛋白質(zhì)芯片。國內(nèi)外已經(jīng)有很多生物技術(shù)公司和制藥公司認(rèn)識到了蛋白質(zhì)芯片研究的重要意義和前景，正在從不同角度和方向進(jìn)行著與此相關(guān)的研發(fā)工作。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)簡稱酶標(biāo)法，是根據(jù)酶免疫測定原理發(fā)展的一種技術(shù)，可以用于各種抗原、抗體的檢測。酶標(biāo)方法應(yīng)該說是一種常規(guī)的方法，早在1959年Berson等人就發(fā)明了檢測胰島素含量的放射免疫方法，并因此獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。1987年有人用放免方法檢測了740名運動員的hCG含量，21人超標(biāo)，此舉引起國際奧委會注意并很快將hCG列入禁藥名單。2002年，用光刻掩膜真空沉積技術(shù)和ELISA法對免疫球蛋白進(jìn)行分析，研制了適合于快速微量分析的金自組膜免疫芯片。2003年，通過表面等離子體諧振為基礎(chǔ)的生物傳感器芯片和競爭性ELISA法，用于檢測嗎啡和海洛因的主要代謝產(chǎn)物嗎啡-3-葡萄糖苷酸。一般來說，免疫學(xué)反應(yīng)大體可以分為兩個主要類別，即競爭法和夾心法。夾心法具有很大的自身優(yōu)勢如靈敏準(zhǔn)確、可多次放大，對所使用的抗體要求不高(不需要太高的親和力)。但在使用競爭法時要求必須同時擁有兩種可識別抗原分子不同免疫位點的抗體，這一要求對蛋白質(zhì)類抗原來說很容易實現(xiàn)，因為一個蛋白分子常有多達(dá)幾十個甚至數(shù)百個免疫識別位點；而對一些小分子物質(zhì)，例如我們所研究的興奮劑分子來說，這一要求往往難以實現(xiàn)。
小分子藥物的分子量大多不足1000，本身僅具有抗原性，而不具有免疫原性(分子量低于10000的物質(zhì)沒有免疫原性)。小分子藥物必須與大分子的免疫載體(BSA，KLH)相連接，才能夠進(jìn)行動物免疫。在小分子藥物-大分子載體的連接物中，小分子本身位點是否能夠有效暴露是一個很大問題，迄今為止尚未得到較好的解決，因此高特異性抗小分子抗體的制備非常困難。早期的競爭法一般以放射性同位素作為標(biāo)記物，標(biāo)記待檢測分子的標(biāo)準(zhǔn)品。利用待測分子與標(biāo)記分子競爭結(jié)合同一抗體位點的特性，根據(jù)放射性強度下降的值來反映被測物濃度。放射性強度越高，則說明體系中的競爭物越少；越低，則說明體系中競爭物越多。當(dāng)然，人們并不希望過多使用同位素，所以這種方法現(xiàn)在出現(xiàn)了其它一些檢測形式，如使用熒光方法、化學(xué)發(fā)光方法、電致化學(xué)發(fā)光方法等。但無論使用何種檢測形式，為了達(dá)到一定的靈敏度要求，所有的競爭方法都共同需要一個高親和力的特異抗體作為捕獲分子，這對抗體的制備提出了較高的要求。

發(fā)明內(nèi)容
1)整體結(jié)構(gòu)一種在96孔酶標(biāo)板孔底粘貼點樣后薄膜進(jìn)行檢測生物分子的新型裝置。特征為采用三維高分子多聚物薄膜或無機聚合物膜，將生物探針分子用機械手按照設(shè)計點陣進(jìn)行點樣，經(jīng)切割后粘貼于酶標(biāo)板孔底，用抗體、配體、配對核酸等進(jìn)行特異識別，然后用原位顯色方法結(jié)合圖像采集設(shè)備判定被測物的濃度。
由于本方法采用通用的96孔酶標(biāo)板，因此在加樣和操作上易于被人接受并廣泛推廣應(yīng)用。同時又增加了生物芯片高通量的優(yōu)勢，通過機械手在一個孔中同時點多個樣品點，同時檢測多種代測物質(zhì)，使得酶標(biāo)板的檢測通量大大提高。
2)基底材料與DNA芯片不同，蛋白芯片不能直接在原位合成，只能采用點樣或噴墨方法制作。制作蛋白芯片最大的難題在于如何將蛋白與基底材料有效結(jié)合的同時，仍能保持其原有的生物活性(免疫原性、抗體特異性)不變。可用于蛋白質(zhì)芯片的基底材料有很多種，其選擇的基本要求為①靶標(biāo)蛋白以共價鍵形式與基底表面連接；②其它蛋白、配體或小分子物質(zhì)能夠特異性地與所固定的蛋白發(fā)生反應(yīng)；③非特異性吸附低；④穩(wěn)定性好，有較長的保存期。而且蛋白又很容易被自然降解或被細(xì)菌吞噬從而導(dǎo)致失活、變性，因此選擇一個好的固定基底材料在制作蛋白芯片過程中就顯得尤為重要。目前常用的基底材料有聚丙烯酰胺凝膠、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、硝酸纖維素膜(NC膜)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯塑料、納米陶瓷、瓊脂糖凝膠、載玻片等。
以載玻片為基底的特點①無滲透性，不同抗體可以在玻片不同區(qū)域發(fā)生特異反應(yīng)；②低濃度下即可發(fā)生相互作用，目前最低可達(dá)100pg/ml；③干燥保存不影響原有免疫活性。
以聚丙烯酰胺為基底也有諸多優(yōu)勢①分離范圍廣，最大可用于400Kd；②電泳過程可有效提高抗原和抗體的反應(yīng)速度；③穩(wěn)定性好，可多次使用。
以聚苯乙烯為基底的反應(yīng)在96孔板底部點4*36方陣，外覆聚四氟乙烯(Teflon)，然后用電荷耦聯(lián)裝置(Charge-Coulpled Device，CCD)檢測。該類芯片在反應(yīng)形式上類似高通量的酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)，可一次檢測大量樣本。
一般認(rèn)為，以固體為基底材料只能檢測固相與液相間的反應(yīng)，但少數(shù)情況下也可用來研究固相與氣相間的反應(yīng)。如用來檢測乙醇、酯類、硫類等物質(zhì)的氣體形式。
3)檢測形式將小分子藥物和大分子載體蛋白進(jìn)行偶連，制備成為可用于點樣的溶液。點樣采用機械手進(jìn)行，樣品點直徑可以介于75微米到300微米之間，每個酶標(biāo)孔可以容納的樣品點為1-81個。這種芯片既可以用于單一被測物的檢測，如檢測海洛因；也可以在復(fù)雜情況下同時檢測多種被測物。目前以各種基底材料為基礎(chǔ)的蛋白芯片分辨率多在ng/mL水平，已能基本滿足臨床檢測的實際需要。
4)芯片切割在點樣后的高分子薄膜上進(jìn)行機械切割，制得與酶標(biāo)孔直徑吻合的均勻的圓形芯片，使用粘貼方式將圓形芯片粘貼于酶標(biāo)板底部，制成酶標(biāo)芯片。
5)顯色本檢測方法為原位顯色。加入被檢測樣本，然后通過特異抗小分子藥物抗體和辣根過氧化物酶(HRP)等的標(biāo)記二抗或者是標(biāo)記核酸，利用直接法或競爭抑制法進(jìn)行檢測。采用可以原位呈色反應(yīng)的底物，如二胺基聯(lián)苯胺(DAB)等，使陽性點出現(xiàn)有顏色的斑點(直接法)或使陽性點出現(xiàn)無顏色的斑點(競爭抑制法)。
6)檢測設(shè)備本方法所使用的圖像采集設(shè)備包括數(shù)碼相機、CCD等，根據(jù)灰度值和配套軟件，判定檢測樣品中含有代測生物分子的濃度。
7)普適性本方法可以適合多種檢測領(lǐng)域，如毒品、自身免疫原、腫瘤標(biāo)志物的檢測等。
具體實施例通過海洛因吸毒致死者頭發(fā)樣本的檢測，驗證本方法的實際檢測效果。
我們對數(shù)十例海洛因中毒致死者的頭發(fā)進(jìn)行了初步實驗，一方面我們優(yōu)化出了提取、分離條件，摸索了GC/MS的檢測條件；另一方面我們通過選擇高分子膜、油性膠、優(yōu)化抗原點樣濃度等，已經(jīng)用酶標(biāo)芯片技術(shù)檢測出了中毒致死者的頭發(fā)、血及尿中海洛因的代謝物嗎啡，基本掌握了本方法的關(guān)鍵技術(shù)。在此工作基礎(chǔ)上順延，不斷增加檢測品種，選擇合適的抗體配對、降低交叉反應(yīng)，即有可能研制出可以同時檢測多種常見小分子藥物的全新方法。酶標(biāo)芯片技術(shù)既具有樣品前處理簡便、靈敏快速、又具有高通量的特點，可用于多人、多種常見毒品的定性、定量測定，以滿足毒品案件鑒別、禁毒和防毒的需要，同時也力爭為2008年北京奧運會增添一項新的興奮劑檢測技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種在96孔酶標(biāo)板孔底粘貼點樣后薄膜進(jìn)行檢測生物分子的新型裝置。特征為采用三維高分子多聚物薄膜或無機聚合物膜，將生物探針分子用機械手按照設(shè)計點陣進(jìn)行點樣，經(jīng)切割后粘貼于酶標(biāo)板孔底，用抗體、配體、配對核酸等進(jìn)行特異識別，然后用原位顯色方法結(jié)合圖像采集設(shè)備判定被測物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薄膜包括聚丙烯酰胺凝膠、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、硝酸纖維素膜(NC膜)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯塑料、納米陶瓷、瓊脂糖凝膠等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的點樣采用機械手進(jìn)行，樣品點直徑可以介于75微米到300微米之間，每個酶標(biāo)孔可以容納的樣品點為1-81個。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薄膜經(jīng)過點樣后進(jìn)行機械切割，制得與酶標(biāo)孔直徑吻合的均勻的圓形芯片，使用粘貼方式將圓形芯片粘貼于酶標(biāo)板底部，制成酶標(biāo)芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法為原位顯色。加入被檢測樣本，然后通過特異抗小分子藥物抗體和辣根過氧化物酶(HRP)等的標(biāo)記二抗或者是標(biāo)記核酸，利用直接法或競爭抑制法進(jìn)行檢測。采用可以原位呈色反應(yīng)的底物，如二胺基聯(lián)苯胺(DAB)等，使陽性點出現(xiàn)有顏色的斑點(直接法)或使陽性點出現(xiàn)無顏色的斑點(競爭抑制法)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的圖像采集設(shè)備包括數(shù)碼相機、CCD等，根據(jù)灰度值和配套軟件，判定檢測樣品中含有代測生物分子的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法采用通用的96孔酶標(biāo)板，因此在加樣和操作上易于被人接受并廣泛推廣應(yīng)用。同時又增加了生物芯片高通量的優(yōu)勢，通過機械手在一個孔中同時點多個樣品點，同時檢測多種代測物質(zhì)，使得酶標(biāo)板的檢測通量大大提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法可以適合多種檢測領(lǐng)域，如常見毒品、自身免疫原、腫瘤標(biāo)志物、細(xì)胞因子系列的檢測等。
全文摘要
一種可原位同時檢測多種常見小分子藥物的酶標(biāo)芯片技術(shù)屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。本研究巧妙結(jié)合生物芯片技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析方法各自的優(yōu)勢，開發(fā)一種全新的酶標(biāo)芯片技術(shù)，可高通量多人份同時對血、尿等中的多種常見毒品進(jìn)行檢測，以滿足毒品案件鑒別、禁毒和防毒的需要，同時也力爭為2008年北京奧運會增添一項新的興奮劑檢測技術(shù)。本研究使用高分子多聚物薄膜為基質(zhì)材料，通過機械手進(jìn)行點樣，制得酶標(biāo)芯片。然后通過特異二抗和酶促反應(yīng)，根據(jù)陽性點灰度值判定檢測樣品中毒品的種類和濃度。本研究的檢測結(jié)果可用氣－質(zhì)、液－質(zhì)聯(lián)用等方法進(jìn)行比對和驗證。
文檔編號G01N33/547GK101078730SQ200610145038
公開日2007年11月28日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者杜宏武, 魏玉芝, 李紹旭 申請人:杜宏武, 魏玉芝, 李紹旭