專利名稱：齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備和檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測齒蘭環(huán)斑病毒的試劑盒及其制備和檢測方法，特別是涉及齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒及制備該試劑盒的方法與應用該試劑盒進行齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測的檢測方法。
背景技術：
齒蘭環(huán)斑病毒(Odntoglossum ringspot virus，ORSV)屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，是危害蘭科植物的兩種主要病毒之一，分布世界各地，主要危害齒蘭、建蘭等。蘭花一旦感染ORSV，其葉片常產(chǎn)生黃化條紋或不規(guī)則褪綠色斑塊，病株花部甚至出現(xiàn)畸形或褪色斑，紅色系花朵褪色斑尤為明顯，對蘭花的觀賞價值和經(jīng)濟價值造成嚴重影響。我國蘭花資源豐富，但研究表明，無論是盆栽的地生蘭花還是組培的蘭花，該病毒病均相當普遍。鑒于ORSV對我國蘭花產(chǎn)業(yè)的危害性，研究其檢測技術已十分重要。
植物病毒檢測常用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，酶免疫分析是將抗原抗體結(jié)合的特異性與酶的高效催化性相結(jié)合的技術，具有靈敏度高，特異性強等特點，但操作步驟多，耗時長，且需要相對昂貴的酶標抗體和96孔酶標板。
斑點酶聯(lián)檢測是以酶免疫吸附分析的原理為基礎近年來迅速發(fā)展起來的檢測方法，曾研究報道該方法用于快速檢測羊胴體中的沙門氏菌與常規(guī)分離培養(yǎng)檢測比較，不僅簡便，快捷，而且安全、可靠。而目前尚未有關斑點免疫酶聯(lián)用于檢測齒蘭環(huán)斑病毒的文獻報道以及用于檢測齒蘭環(huán)斑病毒的斑點酶聯(lián)檢測試劑盒產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供簡便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟實用的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測的試劑盒。
本發(fā)明的另一目的，在于提供制備齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒的方法。
本發(fā)明的再一目的，在于提供利用制備的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒進行斑點酶聯(lián)檢測齒蘭環(huán)斑病毒的檢測方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術解決方案是
齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒，主要由盒體，設在盒體內(nèi)的各種瓶裝用液和PVDF膜組成。
所述的各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶保溫液II 1瓶顯色緩沖液 1瓶顯色劑 1支陽性樣品 1支陰性樣品 1支樣品處理液 1瓶洗滌緩沖液 1瓶所述的保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
所述的顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩沖液。
所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
所述的陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
所述的洗滌緩沖液為0.005-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒的制備方法，它主要包括下列步驟1、齒蘭環(huán)斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩沖液，同時加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機中將病葉搗碎，過濾，將濾液分裝于離心管內(nèi)，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過夜；6000rmp離心20分鐘，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時，沉淀用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒制劑。此后進行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機上以30000rmp離心2.5小時，離心結(jié)束后將病毒帶取出。
2、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體。
3、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
4、各種用液的制備保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris緩沖液。
顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
洗滌緩沖液為0.005-0.05M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒的檢測方法為斑點酶聯(lián)檢測法，它包括以下步驟1、試劑準備根據(jù)檢測的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩沖液，備用；2、樣品處理取待測樣品加入樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3、點樣取處理后的樣品在PVDF膜上點樣，同時設立陽性對照和陰性對照；4、吸附將PVDF膜置于37℃恒溫箱干燥0-60min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡于保溫液I中，于37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡于保溫液II中，于37℃保溫30-90min。取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7、顯色將洗滌后的PVDF膜取出浸泡于顯色液中，顯色5-10min；
8、檢測判定根據(jù)檢測判定標準，判定檢測結(jié)果。
采用上述方案后，本發(fā)明由盒體，設在盒體內(nèi)的各種用液、PVDF膜組裝成經(jīng)濟實用的檢測試劑盒。試劑盒的制備方法簡便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟實用。樣品用量少，在較短的時間內(nèi)就可以完成檢測，且結(jié)果易于保存，應用該檢測試劑盒進行斑點酶聯(lián)聯(lián)檢測的方法與其他血清學檢驗方法相比具有簡單、快速、敏感、特異性強等特點，并具有較高的可重復性、經(jīng)濟實用等更多的優(yōu)點，且試劑盒使用不需特殊儀器，直接可用肉眼判定結(jié)果，所以便于在基層單位推廣應用。
具體實施例方式
本發(fā)明所用的主要試劑齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體為廈門華僑亞熱帶植物引種園制備；PEG6000(聚乙二醇6000)、2-巰基乙醇、Triton-100(曲拉通X-100)、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；羊抗兔酶標抗體、BCIP、NBT、DEAE離子交換填充物、IgG親合層析填充物購自Pierce公司；試驗中所使用的其他常規(guī)藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。
一、試劑盒齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒，主要由盒體，設在盒體內(nèi)的各種瓶裝用液和PVDF膜組成，各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶保溫液II 1瓶顯色緩沖液 1瓶顯色劑 1支陽性樣品 1支陰性樣品 1支樣品處理液 1瓶洗滌緩沖液 1瓶陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，其濃度為100μg/ml；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
顯色緩沖液為0.1M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris緩沖液。
顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
樣品處理液為2M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
洗滌緩沖液為0.01M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
二、制備方法本發(fā)明齒蘭環(huán)斑病毒檢測試劑盒的制備方法，它包括下列步驟1、齒蘭環(huán)斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩沖液，同時加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機中將病葉搗碎，過濾，將濾液分裝于離心管內(nèi)，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過夜；6000rmp離心20分鐘，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時，沉淀用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒制劑。此后進行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機上以30000rmp離心2.5小時，離心結(jié)束后將病毒帶取出。
2、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體。
3、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
4、各種用液的制備保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
顯色緩沖液為0.1M，pH9.5，含MgCl2 10g/L+NaCl 2g/L的Tris緩沖液；顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；樣品處理液為2M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)；
洗滌緩沖液為0.01M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
封閉緩沖溶液為20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉。
三、檢測方法實施例試劑盒的斑點酶聯(lián)(DIBA)檢測方法1、試劑準備根據(jù)檢測的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩沖液，備用；2、樣品處理取待測樣品0.1g加入1ml樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3、點樣取1μL處理后的樣品在PVDF膜上點樣，同時設立陽性對照和陰性對照；4、吸附將PVDF膜置于37℃恒溫箱干燥30min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡于保溫液I中，于37℃保溫45min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡于保溫液II中，于37℃保溫45min。取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7、顯色將洗滌后的PVDF膜取出浸泡于顯色液中，顯色5-10min；8、檢測判定根據(jù)檢測判定標準，判定檢測結(jié)果。
斑點酶聯(lián)檢測判定標準在陽性對照顯色、陰性對照不顯色的情況下，樣品檢測帶有斑點的判斷為陽性，否則為陰性。
1)待測樣品按以上標準，定性判斷待測樣品檢測結(jié)果的陰、陽性。
為檢驗斑點酶聯(lián)檢測試劑盒檢測效果，用該法檢測了40份蘭花樣品，檢測結(jié)果如下附表1 檢測結(jié)果

注“+”代表陽性；“-”代表陰性31份由RT-PCR檢測陽性的樣品，DIBA檢測陽性樣品30份，1份陰性；9份由RT-PCR檢測陰性的樣品，DIBA檢測陰性樣品份，陽性樣品1份；由檢測結(jié)果可知DIBA的敏感性為96.77％；特異性88.89％；檢測準確性為95％。
權利要求
1.齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒，主要由盒體，設在盒體內(nèi)的各種瓶裝用液和PVDF膜組成，其特征在于所述的各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶；保溫液II1瓶；顯色緩沖液 1瓶；顯色劑 1支；陽性樣品1支；陰性樣品1支；樣品處理液 1瓶；洗滌緩沖液 1瓶。
2.如權利要求書1所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒，其特征在于所述的顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩沖液；所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌緩沖液為0-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
3.如權利要求1或2所述的建蘭花葉病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒，其特征在于所述的保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒；所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
4.如權利要求3所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒，其特征在于所述的陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度為0.1μg-100μg/ml。
5.如權利要求1所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述的制備方法主要包括下列步驟1)、齒蘭環(huán)斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩沖液，同時加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機中將病葉搗碎，過濾，將濾液分裝于離心管內(nèi)，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過夜；6000rmp離心20分鐘，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時，沉淀用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒制劑，此后進行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機上以30000rmp離心2.5小時，離心結(jié)束后將病毒帶取出；2)、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔，每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴散法測定效價；通過辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體，用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過夜，透析除鹽，取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體；3)、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液；4)、各種用液的制備所述的保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩沖液；所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌緩沖液為0-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
6.如權利要求1所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法為斑點酶聯(lián)檢測法，它包括以下步驟1)、試劑準備根據(jù)檢測的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩沖液，備用；2)、樣品處理取待測樣品加入樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3)、點樣取處理后的樣品在PVDF膜上點樣，同時設立陽性對照和陰性對照；4)、吸附將PVDF膜置于37℃恒溫箱干燥0-60min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5)、孵育I取PVDF膜浸泡于保溫液I中，于37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6)、孵育II取PVDF膜浸泡于保溫液II中，于37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7)、顯色將洗滌后的PVDF膜取出浸泡于顯色液中，顯色5-10min；8)、檢測判定根據(jù)檢測判定標準，判定檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了齒蘭環(huán)斑病毒斑點酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法，試劑盒由盒體，設在盒體內(nèi)的各種用液和PVDF膜組裝成經(jīng)濟實用的檢測試劑盒。試劑盒的制備方法簡便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟實用。樣品用量少，在較短的時間內(nèi)就可以完成檢測，且結(jié)果易于保存，應用該檢測試劑盒進行斑點酶聯(lián)檢測的方法與其他血清學檢驗方法相比具有簡單、快速、敏感、特異性強等特點，并具有較高的可重復性、經(jīng)濟實用等更多的優(yōu)點，所以便于在基層單位推廣應用。
文檔編號G01N33/543GK1975426SQ20061016443
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權日2006年2月10日
發(fā)明者明艷林, 鄭國華, 童慶宣, 李梅, 陳良華 申請人:廈門華僑亞熱帶植物引種園