專利名稱：用于檢測(cè)真菌毒素的設(shè)備和方法
用于檢測(cè)真菌毒素的設(shè)備和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)真菌毒素的設(shè)備和方法并涉及適于實(shí)施所述 方法的試劑盒。
真菌毒素的檢測(cè)包括很多領(lǐng)域的應(yīng)用，例如用于食品和飼料方面， 用于環(huán)境分析，用于農(nóng)作物保護(hù)和用于生化研究。
真菌毒素是真菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，它們具有非常不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 真菌毒素在諸如谷物、含油種子和水果的收獲產(chǎn)物中被找到，而且可導(dǎo)
致人和動(dòng)物中毒。到現(xiàn)在已有超過(guò)300種不同的真菌毒素^:鑒定出來(lái)，
其被分成約25種結(jié)構(gòu)類型并表現(xiàn)出不同的毒性作用。根據(jù)毒素類型，
真菌毒素可導(dǎo)致急性或慢性中毒。真菌毒素的常規(guī)種類有黃曲霉毒素、 赭曲毒素、麥角生物堿、棒曲霉素和鐮刀霉毒素。鐮刀霉毒素中特別重
要的有脫氧瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、瓜萎鐮菌醇、T-2-mT2-毒素和 伏馬菌素，因?yàn)樗鼈兘?jīng)常在谷物產(chǎn)品中被發(fā)現(xiàn)。因此，在谷倉(cāng)、谷物貿(mào) 易和谷物加工部分(例如磨坊、麥芽坊、飼料生產(chǎn)商、農(nóng)場(chǎng)、咨詢中心、 大學(xué)或政府部門，例如為了保證食品質(zhì)量的消費(fèi)者保護(hù)部門)中應(yīng)當(dāng)實(shí) 現(xiàn)針對(duì)真菌毒素的測(cè)試，例如針對(duì)田間真菌毒素(例如鐮刀霉毒素)或 針對(duì)貯藏真菌毒素的測(cè)試。
現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開(kāi)了用于檢測(cè)真菌毒素的許多方法。例如通過(guò)色 譜方法(如HPLC),其可與基于熒光的吸收或質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)用，來(lái)檢測(cè) 真菌毒素。例如，HPLC分析谷物樣品前，通常通過(guò)免疫親和柱濃縮并 純化分析物。所有基于HPLC的方法都投資額高、樣品處理相對(duì)復(fù)雜和 時(shí)間分析長(zhǎng)的缺點(diǎn)。由于所述缺點(diǎn)，基于HPLC的檢測(cè)方法不適于快速、 廉價(jià)并簡(jiǎn)單地分析諸如生產(chǎn)、存放、貿(mào)易或加工的谷物中的谷物樣品。
代之以在專門的分析實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行基于HPLC的分析。結(jié)果，在實(shí)踐中， 只能延遲幾天得到結(jié)果。
檢測(cè)真菌毒素的備選方法是ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試)技術(shù)。在 微滴定板上進(jìn)行ELISA,微滴定板的孔用諸如特異性結(jié)合真菌毒素的捕 獲抗體涂覆。ELISA測(cè)試的缺點(diǎn)是有許多移液、洗滌和溫育步驟，這會(huì) 使分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，超過(guò)30分鐘。這限制了該測(cè)試在分析實(shí)驗(yàn)室之 外的地點(diǎn)快速進(jìn)行。而且，該測(cè)試不能同時(shí)檢測(cè)多種分析物，因?yàn)槊總€(gè)
微滴定板上通常只涂覆以 一種抗體。
檢測(cè)真菌毒素的另一種方法是側(cè)向流動(dòng)測(cè)試(LFA)。通過(guò)LFA可檢 測(cè)真菌毒素，例如在硝化纖維條上進(jìn)行直接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試，其中通過(guò) 毛細(xì)管力使要分析的樣品經(jīng)過(guò)整個(gè)硝化纖維條。不利的是，該方法4義能 進(jìn)行定性真菌毒素檢測(cè)。該測(cè)試的另一個(gè)缺點(diǎn)是每種真菌毒素需要單獨(dú) 的條。
現(xiàn)有技術(shù)還包括開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)真菌毒素的方法的研究，例如M. M. Ngundi等，Anal. Chem. 2005, 77, 148-154所述的。該方法包括通過(guò) 將赭曲毒素A固定在玻璃載片上來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)赭曲毒素A的間接竟?fàn)幮?免疫測(cè)試。熒光標(biāo)記的赭曲毒素A抗體和要確定的樣品的混合物上樣 于玻璃載片上，在通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的抗體后對(duì)其讀數(shù)。不利的是， 該方法需要洗滌步驟和10至20分鐘的溫育時(shí)間，還需要復(fù)雜的熒光成 像系統(tǒng)來(lái)讀出結(jié)果。結(jié)果，在此基礎(chǔ)上不可能開(kāi)發(fā)出能在分析實(shí)-瞼室外 的地點(diǎn)上進(jìn)行的快速測(cè)試。
因此，由于要復(fù)雜的讀數(shù)設(shè)備，現(xiàn)有技術(shù)已知的檢測(cè)真菌毒素的方 法需要巨大投資額，包括許多手工步驟或不能在分析實(shí)驗(yàn)室以外使用。
因此，本發(fā)明的目的是提供克服至少一個(gè)上述現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的方 法，尤其是能以快速、廉價(jià)和容易實(shí)現(xiàn)的方式在樣品中檢測(cè)真菌毒素的 方法。
該目的通過(guò)用于快速檢測(cè)真菌毒素的方法實(shí)現(xiàn)，其包括以下步驟
a) 提供薄膜波導(dǎo)，其包括在第二光透明層(b)上的第一光透明波導(dǎo) 層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結(jié)合配偶體作 為真菌毒素和/或結(jié)合配偶體的化學(xué)或生化識(shí)別元件以空間分離的方式 固定在該薄膜波導(dǎo)上，
b) 將含一種或多種真菌毒素的樣品和結(jié)合配偶體施加于所述薄膜 波導(dǎo)上固定的結(jié)合配偶體上，
c) 檢測(cè)由薄膜波導(dǎo)上固定的結(jié)合配偶體與樣品中的真菌毒素和/或 與結(jié)合配偶體的相互作用產(chǎn)生的消逝場(chǎng)中的信號(hào)，
d) 確定樣品中存在的一種或多種真菌毒素的量。 本發(fā)明的另一主題在于用于實(shí)施檢測(cè)真菌毒素的方法的設(shè)備。 進(jìn)一步的主題是適于實(shí)施用于檢測(cè)真菌毒素的方法的試劑盒。 本發(fā)明其他有益的實(shí)施方案來(lái)源于從屬權(quán)利要求。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明用于檢測(cè)真菌毒素的方法可容易地并在 專門的分析實(shí)驗(yàn)室以外進(jìn)行。這使本發(fā)明的方法能通過(guò)快速測(cè)試來(lái)進(jìn) 行，而無(wú)需將樣品轉(zhuǎn)送分析實(shí)驗(yàn)室。而且有利的是，根據(jù)本發(fā)明方法所 述的真菌毒素檢測(cè)僅需很少或者無(wú)需洗滌步驟。這是特別有利的，因?yàn)?進(jìn)行洗滌步驟是耗時(shí)的，推遲了分析結(jié)果的獲得，并可能歪曲分析結(jié)果， 或者尤其在較不小心或不適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行后者的時(shí)候，甚至使沖企測(cè)完全不可 能進(jìn)行。
綜合本發(fā)明方法的有利性質(zhì)，使得能在諸如谷倉(cāng)、谷物貿(mào)易和谷物 加工場(chǎng)所中的食品中檢測(cè)真菌毒素。該方法尤其能方便而快速地進(jìn)行， 這甚至能使不是專家實(shí)驗(yàn)室的專門分析員的個(gè)人都能實(shí)現(xiàn)所迷方法。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，作為薄膜波導(dǎo)使用基于薄膜波導(dǎo)的消 逝場(chǎng)生物芯片(優(yōu)選是基于薄膜波導(dǎo)的平面光波導(dǎo)生物芯片)。
光波導(dǎo)是一類信號(hào)換能器，其能用于檢測(cè)與波導(dǎo)層(通常是電介質(zhì)) 接觸的介質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)的改變。當(dāng)光以引導(dǎo)模式傳入波導(dǎo)層時(shí)，光場(chǎng)在 介質(zhì)/波導(dǎo)分界面上并不陡然下降，而是在鄰接于波導(dǎo)的所謂檢測(cè)介質(zhì)中 指數(shù)衰減。該指數(shù)衰減的光場(chǎng)被稱為消逝場(chǎng)。用合適的測(cè)量裝置能檢測(cè) 消逝場(chǎng)內(nèi)與波導(dǎo)層接觸的介質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)的改變。
波導(dǎo)用作信號(hào)換能器是有利的，因?yàn)閷?duì)于在波導(dǎo)分界面上固定的識(shí) 別元件的情況，在波導(dǎo)內(nèi)的分界面上檢測(cè)介質(zhì)光學(xué)性質(zhì)改變的時(shí)候，能
;險(xiǎn)測(cè)所述識(shí)別元件的結(jié)合或反應(yīng)。
因此，在實(shí)施所述檢測(cè)時(shí)可能節(jié)約時(shí)間并簡(jiǎn)化過(guò)程。
因此，通過(guò)改變直接在信號(hào)換能器或薄膜波導(dǎo)表面上的例如要分析
的樣品的介質(zhì)光學(xué)性質(zhì)，例如通過(guò)吸收、熒光、磷光、發(fā)光等的變化，
能檢測(cè)到信號(hào)或標(biāo)記的元件。
優(yōu)選檢測(cè)消逝場(chǎng)中的熒光信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明用于標(biāo)記結(jié)合配偶體 (例如真菌毒素、真菌毒素綴合物、抗體綴合物或抗體)的標(biāo)記元件優(yōu)
選是有機(jī)熒光團(tuán)、納米顆粒、熒光納米顆粒、珠、熒光珠、熒光蛋白質(zhì)
或其他發(fā)出信號(hào)分子或單位或者各種標(biāo)記元件的任意組合。優(yōu)選使用以
能發(fā)光的方式標(biāo)記的結(jié)合配偶體。優(yōu)選的標(biāo)記元件是有機(jī)熒光團(tuán)和/或萸
光蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選熒光標(biāo)記的結(jié)合配偶體可受消逝場(chǎng)激發(fā)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，消逝場(chǎng)由Duveneck等的US 5, 959， 292所述的
平面光波導(dǎo)產(chǎn)生。用合適的裝置能檢測(cè)各向同性發(fā)出的熒光。在其他實(shí)
可通過(guò)合適的光學(xué)裝置來(lái)檢測(cè):'' 尤其有利的是，優(yōu)選在檢測(cè)信號(hào)前可限制或甚至完全省去洗掉熒光 標(biāo)記的結(jié)合配偶體或者含標(biāo)記的結(jié)合配偶體的樣品或溶液。因?yàn)橐部墒?去提供的洗滌規(guī)程中通常使用的各種緩沖溶液，所以這能節(jié)約時(shí)間并以 簡(jiǎn)化的方式檢測(cè)真菌毒素。
可用的薄膜波導(dǎo)優(yōu)選包括光透明波導(dǎo)層(a),其包括氧化物，選自包 括Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組，優(yōu)選選自包括 Ti02、 Ta205和/或1%205的組。光透明波導(dǎo)層(a)優(yōu)選由Ti02、 ZnO、 Nb2〇5、 Ta205、 Hf02或Zr02制成，優(yōu)選由Ti02, Ta205或Nb205制成。 五氧化鉭經(jīng)證實(shí)是特別有利的，尤其是用于檢測(cè)熒光信號(hào)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，向薄膜波導(dǎo)上，尤其向包括氧化物的光透 明波導(dǎo)層(a)上，所述氧化物選自包括Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205, 、 Hf02 和/或Zr02的組，施加單或多層下式(I)的有枳〃疇酸
R-OP03H2 (I)
和/或下式(II)的有機(jī)膦酸
R-P03H2 (n)
和/或它們的鹽，其中
R是Cio至C24貌基。
優(yōu)選可用的有有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸，更優(yōu)選有機(jī)磷酸鹽和/或有 機(jī)膦酸鹽，其中R選自包括無(wú)支鏈的 C1()至C2o烷基的組，優(yōu)選選自 包括無(wú)支鏈的C12至ds烷基的組，優(yōu)選選自包括十二烷基磷酸、十 二烷基磷酸鹽、十八烷基膦酸鹽和/或十八烷基膦酸的組。
優(yōu)選可用的是有機(jī)磷酸或有機(jī)磷酸鹽，其通過(guò)水溶液中的水溶性鹽 的形式來(lái)施加于薄膜波導(dǎo)上。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸(優(yōu)選有機(jī)磷酸鹽) 以單層的方式施加于薄膜波導(dǎo)，特別是消逝場(chǎng)生物芯片，優(yōu)選是平面光 波導(dǎo)生物芯片。它們可通過(guò)浸涂方法來(lái)施加。
該單層可作為粘著促進(jìn)層施加于由氧化物構(gòu)成的光透明層。有利的 是，有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸能與識(shí)別元件(尤其與蛋白質(zhì)或與蛋白質(zhì)偶 聯(lián)的識(shí)別元件)相互作用，并增強(qiáng)所述識(shí)別元件與生物芯片的結(jié)合。
可用的結(jié)合配偶體優(yōu)選選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒素抗體 綴合物、真菌毒素、真菌毒素綴合物、抗真菌毒素抗體片段、真菌毒素
結(jié)合肽、真菌毒素結(jié)合性抗運(yùn)載蛋白(Anticaline)、真菌毒素結(jié)合性適 體、真菌毒素結(jié)合性適配子和/或真菌毒素結(jié)合性印跡聚合物的組，優(yōu)選 選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒素抗體綴合物、真菌毒素和/或真菌 毒素綴合物的組。
結(jié)合配偶體在各種情況下特異地與和/或親和性地與各其他結(jié)合配 偶體相互作用。例如，施加于薄層波導(dǎo)上的抗真菌毒素抗體親和性地與 固定在所述薄膜波導(dǎo)上的真菌毒素結(jié)合。同樣，固定在薄膜波導(dǎo)上的抗 真菌毒素抗體親和性地與用于所述薄層波導(dǎo)上的真菌毒素或真菌毒素 綴合物結(jié)合。結(jié)合特異性在此取決于所用的親和性配偶體。因此，可用 的交叉反應(yīng)性抗真菌毒素抗體親和性地與諸如伏馬菌素類的相應(yīng)真菌 毒素結(jié)合，但特異性不如諸如抗伏馬菌素Bl的特定抗體。固定的結(jié)合 配偶體也被稱為識(shí)別元件或"捕獲分子"。
可從諸如蛋白質(zhì)和抗真菌毒素抗體或真菌毒素中形成抗真菌毒素 抗體綴合物和真菌毒素綴合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如在間接竟?fàn)幮詼y(cè)試中，固定的結(jié)合配偶 體是真菌毒素綴合物。真菌毒素綴合物優(yōu)選由結(jié)合至蛋白質(zhì)(例如牛血 清白蛋白(BSA))的真菌毒素形成。使用該真菌毒素-BSA綴合物的特 定益處是以下事實(shí)，即真菌毒素與薄膜波導(dǎo)的結(jié)合能通過(guò)蛋白質(zhì)和有機(jī) 磷酸和/或有機(jī)膦酸間的相互作用增強(qiáng)。這可改善識(shí)別元件與所述薄膜波 導(dǎo)的粘著。
標(biāo)記元件(例如熒光染料或熒光團(tuán))可直接與結(jié)合配偶體結(jié)合， 例如與抗真菌毒素抗體或真菌毒素結(jié)合，或通過(guò)間隔元件(例如蛋白質(zhì) 或烷基鏈或聚乙二醇鏈)連接。標(biāo)記元件(例如熒光染料或熒光團(tuán))優(yōu) 選通過(guò)蛋白質(zhì)與真菌毒素結(jié)合。合適蛋白質(zhì)的例子是BSA。熒光團(tuán)通過(guò) BSA與真菌毒素的結(jié)合可顯著改善標(biāo)記元件與結(jié)合配偶體(例如抗體) 的結(jié)合。另一個(gè)益處在于，可以由此避免用于將例如熒光團(tuán)直接結(jié)合到 真菌毒素的復(fù)雜方法。例如，用于直接竟?fàn)幮詼y(cè)試中的針對(duì)固定的抗真 菌毒素抗體的優(yōu)選結(jié)合配偶體是熒光標(biāo)記的真菌毒素-BSA綴合物。
真菌毒素原則上可在樣品、溶液或其他介質(zhì)中檢測(cè)，其都可施加于 薄膜波導(dǎo)上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品是人或動(dòng)物的食物。優(yōu)選根據(jù)
本發(fā)明的方法，在谷類、谷類產(chǎn)品、酒、果汁或水果和/或含谷類、酒、 果汁和/或水果的產(chǎn)品中檢測(cè)真菌毒素。要分析的樣品(例如食品或產(chǎn)品) 在本文中可施加于薄膜波導(dǎo)上，或用溶劑或溶劑混合物提取出來(lái)并使用 提取出的提取物。所迷提取物可以稀釋或濃縮的方式使用。
真菌毒素可通過(guò)與溶劑或溶劑混合物處理而從要研究的樣品(例如 谷物或其他食品)中取出。例如，真菌毒素可通過(guò)研磨并接著用水或有 機(jī)溶劑或溶劑混合物提取而從谷物樣品中取出，例如使用水(視需要可 以與緩沖物質(zhì)、鹽、酸或堿和其他添加劑混合)和有機(jī)溶劑的混合物， 例如使用水和甲醇或乙醇或水和乙腈的混合物。其他提取真菌毒素的方 法對(duì)普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。然后所得的溶解的真菌毒素直接或在 稀釋或濃縮后在薄膜波導(dǎo)或芯片上分析。
可用的識(shí)別元件被稱為"捕獲分子"，其優(yōu)選選自包括抗真菌毒素抗 體、抗真菌毒素抗體綴合物、真菌毒素和/或真菌毒素綴合物的組，優(yōu)選 是兩種或更多的不同物質(zhì)，其可以共價(jià)或通過(guò)諸如疏水吸附非共i"介固定 于薄膜波導(dǎo)表面或芯片表面上。例如，將識(shí)別元件通過(guò)被稱為點(diǎn)的測(cè)量 場(chǎng)方式施加于薄膜波導(dǎo)表面或芯片表面，來(lái)固定它們，該方法也凈皮稱為 點(diǎn)樣。優(yōu)選進(jìn)行溶液(優(yōu)選含有作為識(shí)別元件的一種或多種結(jié)合配偶體 的緩沖溶液)點(diǎn)樣，其通過(guò)被稱為點(diǎn)樣儀的自動(dòng)應(yīng)用設(shè)備實(shí)施。優(yōu)選在 點(diǎn)樣后溫育薄膜波導(dǎo)或芯片至少1小時(shí)(優(yōu)選數(shù)小時(shí))，從而能使識(shí)別 元件粘附在所述薄膜波導(dǎo)或芯片上。
優(yōu)選在點(diǎn)樣后用蛋白質(zhì)溶液(優(yōu)選可用的封閉蛋白質(zhì)
(Blocking-Proteins)溶液，例如BSA)處理生物芯片至少1小時(shí)，優(yōu) 選2小時(shí)至6小時(shí)，特別優(yōu)選3小時(shí)至4小時(shí)。去除溶液后，干燥并 存儲(chǔ)薄膜波導(dǎo)或生物芯片。
樣品和優(yōu)選的熒光標(biāo)記的結(jié)合配偶體可同時(shí)或先后地施加于薄膜
波導(dǎo)(優(yōu)選消逝場(chǎng)生物芯片，優(yōu)選平面光波導(dǎo)生物芯片)上固定的識(shí)別 元件。因此在溫育樣品(例如芯片上的提取物)之前或期間，可能要加 入優(yōu)選的熒光標(biāo)記的結(jié)合配偶體，例如針對(duì)一種或多種真菌毒素的 一種 或多種優(yōu)選熒光標(biāo)記的真菌毒素、真菌毒素綴合物或抗體。例如，也可 能將要分析的樣品提取物以與針對(duì) 一種或多種真菌毒素的優(yōu)選標(biāo)記的、 更優(yōu)選熒光標(biāo)記的真菌毒素、真菌毒素綴合物或抗體的混合物形式施加 于芯片上。
特別有利的是，根據(jù)本發(fā)明的方法，樣品可與用作薄膜波導(dǎo)上化學(xué)
或生化識(shí)別元件的固定的結(jié)合配偶體和/或結(jié)合配偶體溫育小于15分 鐘，優(yōu)選小于IO分鐘，尤其優(yōu)選小于5分鐘，然后檢測(cè)信號(hào)。
這些使得大大優(yōu)于已知的方法，所述方法需要溫育時(shí)間，其中所施 加的真菌毒素綴合物與標(biāo)記的真菌毒素抗體溶液有時(shí)要花多至2小時(shí)， 或者大大優(yōu)于需要讓樣品與標(biāo)記的抗真菌毒素抗體預(yù)先溫育的方法。相 對(duì)于已知的方法，這能通過(guò)本發(fā)明的方法快得多地確定真菌毒素，更具 體的，溫育時(shí)間被顯著縮短。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，溫育時(shí)間可小 于10分鐘或甚至僅有5分鐘。尤其在綜合了能省去洗滌步驟的其他益 處的情況下，這能使本發(fā)明的方法在小于20分鐘(優(yōu)選小于15、特 別優(yōu)選小于IO分鐘)內(nèi)產(chǎn)生結(jié)果。
利用本發(fā)明的方法，可定量并優(yōu)選只有4艮小差異地測(cè)定真菌毒素。 例如，所謂"實(shí)驗(yàn)室間差異系數(shù)"——重復(fù)性的量度，可小于50%,優(yōu)選 小于40%。而且，所謂"實(shí)驗(yàn)室間差異系數(shù)"——重復(fù)性的量度，可小于 20%。這能使本發(fā)明的方法在標(biāo)準(zhǔn)化和簡(jiǎn)單的方法框架內(nèi)使用，來(lái)用于 確定食品(例如谷物、谷物產(chǎn)品或酒)中的真菌毒素。
可檢測(cè)的真菌毒素優(yōu)選選自包括黃曲霉毒素、赭曲毒素、麥角生物 堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒素的組，例如選自包括脫氧瓜萎鐮菌醇、 瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲毒素A和/ 或伏馬菌素的組。伏馬菌素優(yōu)選選自包括伏馬菌素Bl、伏馬菌素B2和 /或伏馬菌素B3的組。
因此，可用的結(jié)合配偶體優(yōu)選選自包括黃曲霉毒素、赭曲毒素、麥 角生物堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒素的真菌毒素組，例如選自包括脫氧 瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲 毒素A和/或伏馬菌素的組，而真菌毒素抗體選自包括黃曲霉毒素、赭 曲毒素、麥角生物堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒素的組，例如選自包括脫 氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素和/ 或伏馬菌素的組。
根據(jù)所用的免疫測(cè)試類型，將結(jié)合配偶體(例如間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè) 試情況下一種或多種真菌毒素)作為識(shí)別元件固定在薄膜波導(dǎo)上，而另 外的結(jié)合配偶體(例如間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試情況下一種或多種抗真菌毒 素抗體)在使用樣品前或與樣品同時(shí)上樣于薄膜波導(dǎo)。加入的結(jié)合配偶
體在此優(yōu)選經(jīng)可發(fā)光標(biāo)記，優(yōu)選經(jīng)熒光團(tuán)標(biāo)記。
可用的結(jié)合配偶體優(yōu)選選自包括脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉
米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲毒素A和/或伏馬菌素Bl、 伏馬菌素B2和/或伏馬菌素B3的組，而真菌毒素抗體選自包括脫氧瓜 萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲 毒素A和/或伏馬菌素Bl、伏馬菌素B2和/或伏馬菌素B3的組。
本文可優(yōu)選使用針對(duì)真菌毒素的單克隆抗體，例如抗伏馬菌素Bl、 抗伏馬菌素B2或抗伏馬菌素B3。也可用用于抗伏馬菌素類的抗體。 可用的結(jié)合配偶體(優(yōu)選針對(duì)真菌毒素的抗體)可單獨(dú)或混合使用，而 且還可能使用交叉反應(yīng)性抗體。
本發(fā)明方法的特定益處源于以下事實(shí)，即本發(fā)明的方法能以提高的 靈敏度檢測(cè)真菌毒素。例如，尤其在人或動(dòng)物食品中，例如在谷物、酒、 果汁、水果和/或其產(chǎn)品中，或在所述食品或產(chǎn)品的提取物中，甚至可以 檢測(cè)納摩爾或皮摩爾真菌毒素濃度范圍的真菌毒素。例如，在谷類提取 物中，甚至可以檢測(cè)0.1 pM至100nM真菌毒素范圍內(nèi)(優(yōu)選lpM至 lnM真菌毒素范圍內(nèi))的真菌毒素。更具體的，可以檢測(cè)的濃度小于1 nM，優(yōu)選小于100pM的真菌毒素，優(yōu)選小于10pM真菌毒素，尤其 優(yōu)選小于1 pM真菌毒素。
而且，在谷類提取物中可檢測(cè)lO"ppb至10 000 ppb真菌毒素范圍 內(nèi)的真菌毒素，在谷物中是10^ppb至10 000 ppb真菌毒素范圍內(nèi)的真 菌毒素。在谷類提取物中優(yōu)選可檢測(cè)^0.1 ppb真菌毒素范圍內(nèi)的真菌毒 素，優(yōu)選SO.Ol ppb真菌毒素范圍內(nèi)的，特別優(yōu)選^10^ppb真菌毒素 范圍內(nèi)的真菌毒素，在谷物中是SO.l ppb真菌毒素范圍內(nèi)的，優(yōu)選￡0.01 ppb真菌毒素范圍內(nèi)的，特別優(yōu)選^l()4ppb真菌毒素范圍內(nèi)的真菌毒 素。
這使得能在分析實(shí)驗(yàn)室外比迄今可能的方法更準(zhǔn)確地確定食品中 所含的真菌毒素。
本發(fā)明的方法使得能檢測(cè)至少2種真菌毒素，優(yōu)選2至IOOO種真 菌毒素，優(yōu)選5至IOO種真菌毒素。特別是可同時(shí)確定多種真菌毒素。 這大大優(yōu)于已知的方法，所述方法大部分僅能在同時(shí)檢測(cè)單一真菌毒 素。
用于檢測(cè)真菌毒素的方法的優(yōu)選實(shí)施方案提供了以空間分離的方
式在薄膜波導(dǎo)表面上固定特異性和/或親和性結(jié)合配偶體作為真菌毒素 和/或結(jié)合配偶體的化學(xué)或生化識(shí)別元件，所述薄膜波導(dǎo)包括在第二光透
明層(b)上的第一光透明波導(dǎo)層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率。然后， 同時(shí)或先后加入要分析的樣品和優(yōu)選的熒光團(tuán)標(biāo)記的結(jié)合配偶體。固定 在薄膜波導(dǎo)上的結(jié)合配偶體、樣品中的真菌毒素和/或優(yōu)選的熒光團(tuán)標(biāo)記 的結(jié)合配偶體之間的特異性和/或親和性相互作用，可以作為消逝場(chǎng)中的 信號(hào)編號(hào)而檢測(cè)。樣品中存在真菌毒素導(dǎo)致在消逝場(chǎng)產(chǎn)生信號(hào)的變化。
根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)測(cè)試來(lái)檢測(cè)真菌毒素，例如在芯片上的免疫測(cè) 試。優(yōu)選通過(guò)免疫測(cè)試(優(yōu)選竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試)來(lái)實(shí)施真菌毒素的檢測(cè)， 例如有直接或間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試，尤其優(yōu)選通過(guò)間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試 來(lái)實(shí)施。
用于通過(guò)直接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試檢測(cè)真菌毒素的方法的優(yōu)選實(shí)施方 案可以構(gòu)思為以空間分離的方式在薄膜波導(dǎo)表面上固定抗真菌毒素抗 體作為真菌毒素的化學(xué)或生化識(shí)別元件，所述薄膜波導(dǎo)包括在第二光透 明層(b)上的第一光透明波導(dǎo)層(a)，其中(b)具有比(a)低的折射率。然后， 與要分析的樣品同時(shí)或在其之前加入優(yōu)選的熒光團(tuán)標(biāo)記的真菌毒素或 優(yōu)選的熒光團(tuán)標(biāo)記的真菌毒素-BSA綴合物。固定在薄膜波導(dǎo)上的抗真 菌毒素抗體、樣品中的一種或多種真菌毒素和/或優(yōu)選用焚光團(tuán)標(biāo)記的真 菌毒素或真菌毒素-BSA綴合物之間的相互作用，可以作為消逝場(chǎng)中的 信號(hào)改變進(jìn)行檢測(cè)。
在直接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試的情況下，優(yōu)選在芯片表面上通過(guò)諸如點(diǎn)樣 來(lái)共價(jià)或非共價(jià)固定兩種或多種不同抗真菌毒素抗體。例如，如果將要 研究的樣品的提取物與優(yōu)選熒光標(biāo)記的真菌毒素或真菌毒素綴合物的 混合物上樣于芯片，就能使所述標(biāo)記的或未標(biāo)記的真菌毒素或真菌毒素 綴合物竟?fàn)幩鲂酒峡晒┦褂玫目贵w結(jié)合位點(diǎn)。在芯片上溫育提取物 之前或期間，可加入焚光標(biāo)記的真菌毒素。結(jié)合至固定的抗體的標(biāo)記的 真菌毒素的量與提取物中存在的真菌毒素的量成反比。
也可通過(guò)夾心測(cè)試(Sandwich-Assay)進(jìn)行^r測(cè)。在這種情況下，使用 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，而不是4吏用標(biāo)記的真菌毒素或真菌毒素綴合物，所述 經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合到由固定在芯片上的抗體和真菌毒素組成的固 定復(fù)合物上。在夾心測(cè)試中，結(jié)合至抗體的熒光團(tuán)的量與提取物中的真 菌毒素濃度成正比。
用于通過(guò)間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試檢測(cè)真菌毒素的方法的另 一種優(yōu)選
的實(shí)施方案可構(gòu)思為以空間分離的方式在薄膜波導(dǎo)表面上固定真菌毒 素或優(yōu)選用熒光團(tuán)標(biāo)記的真菌毒素-BSA綴合物作為化學(xué)或生化識(shí)別元 件，所述薄膜波導(dǎo)包括在第二光透明層(b)上的第一光透明波導(dǎo)層(a)，其 中(b)具有比(a)低的折射率。然后，與要分析的樣品同時(shí)或在其之前加入 優(yōu)選用熒光團(tuán)標(biāo)記的抗真菌毒素抗體。固定在薄膜波導(dǎo)上的真菌毒素或 優(yōu)選用熒光團(tuán)標(biāo)記的真菌毒素-BSA綴合物、樣品中的一種或多種真菌 毒素和/或優(yōu)選用熒光團(tuán)標(biāo)記的抗真菌毒素抗體之間的相互作用，可以作 為消逝場(chǎng)中的信號(hào)改變進(jìn)行檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明，也可通過(guò)間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試4企測(cè)真菌毒素。在這種 情況下，可在芯片上固定真菌毒素或真菌毒素綴合物，例如真菌毒素-蛋白質(zhì)綴合物，優(yōu)選真菌毒素-BSA綴合物。如果將要研究的樣品提取 物與優(yōu)選用熒光標(biāo)記的抗真菌毒素-抗體的混合物上樣于芯片，就能使固 定的真菌毒素和存在于溶液中的真菌毒素竟?fàn)師晒鈽?biāo)記的抗體可供使 用的結(jié)合位點(diǎn)。在芯片上溫育提取物之前或期間，可加入熒光標(biāo)記的抗 真菌毒素抗體。在這種情況下，被結(jié)合的標(biāo)記抗體的量與提取物中存在 的真菌毒素的量成反比。
另外有利的是，可通過(guò)讀數(shù)設(shè)備檢測(cè)消逝場(chǎng)中的信號(hào)。例如，所述 讀數(shù)設(shè)備可以是耐用而廉價(jià)的讀數(shù)設(shè)備。
可用合適的軟件評(píng)估信號(hào)強(qiáng)度(例如熒光強(qiáng)度)并計(jì)算樣品中存在 的真菌毒素的量。
尤其在綜合了方法易于實(shí)現(xiàn)、可能同時(shí)并定量地在耐用而廉價(jià)的讀 數(shù)設(shè)備上檢測(cè)數(shù)種真菌毒素的情況下，本發(fā)明的方法提供的益處使得能 在分析實(shí)驗(yàn)室以外簡(jiǎn)單而快速地檢測(cè)真菌毒素。
本發(fā)明的另 一主題在于用于實(shí)施用于檢測(cè)真菌毒素的方法的設(shè)備。
實(shí)施用于檢測(cè)真菌毒素的方法的設(shè)備有薄膜波導(dǎo)，優(yōu)選有基于薄膜 波導(dǎo)的平面光波導(dǎo)生物芯片，所述薄膜波導(dǎo)包括在第二光透明層(b)上的 第一光透明波導(dǎo)層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率。識(shí)別元件優(yōu)選固 定于層(a)上。
合適的平面光波導(dǎo)的例子在WO 01/92870或US 5, 959, 292中有描述。
在設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施方案中，薄膜波導(dǎo)(優(yōu)選平面光波導(dǎo)生物芯片)
的光透明層(b)，可由諸如玻璃或石英的硅酸鹽或由透明塑料(優(yōu)選選自 包括聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚曱基丙烯酸酯、聚苯乙烯、環(huán)狀聚烯烴和 /或環(huán)狀聚烯烴共聚物的組)制成，優(yōu)選由環(huán)狀聚烯烴或環(huán)狀聚烯烴共聚 物制成。適于制備光透明層(b)的塑料的例子在WO 03/020488中有描述。
優(yōu)選的是透明熱塑性塑料或可注射塑料，例如選自包括聚碳酸酯， 聚酰亞胺，丙烯酸酯(尤其是聚曱基丙烯酸甲酯)、或聚苯乙烯的組。
在設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施方案中，光透明波導(dǎo)層(a)可包括氧化物，所述 氧化物選自包括Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組， 優(yōu)選選自包括Ti02、 Ta205和/或Nb205的組。也可用幾種這類氧化物 的組合。優(yōu)選光透明波導(dǎo)層(a)由Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02或 Zr02 (優(yōu)選Ti02、 Ta20s或Nb205)制成。4吏用五氧化鉭經(jīng)證實(shí)是尤其 有益的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，薄膜波導(dǎo)，尤其在含選自包括丁102、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組的氧化物的光透明層上，包括單 或多層下式(I)的有機(jī)磷酸，
R-OP03H2 (I)
和/或下式(n)的有機(jī)膦酸
R-P03H2 (II)
和/或它們的鹽，其中 R是Cio至C24坑基。
優(yōu)選可用的是有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸，優(yōu)選是有機(jī)磷酸鹽和/或有
機(jī)膦酸鹽，其中R選自包括無(wú)支鏈的 C1Q至C2o烷基的組，優(yōu)選選自 包括無(wú)支鏈的C12至C!s烷基的組，優(yōu)選選自包括十二烷基磷酸、十 二烷基磷酸鹽、十八烷基膦酸鹽和/或十八烷基膦酸的基團(tuán)。
優(yōu)選的是有機(jī)磷酸或有機(jī)磷酸鹽，其通過(guò)水溶液中水溶性鹽的方式 施加于薄膜波導(dǎo)。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸(優(yōu)選有機(jī)磷酸 鹽)以單層方式施加于薄膜波導(dǎo)，尤其是消逝場(chǎng)生物芯片，優(yōu)選平面光 波導(dǎo)生物芯片。
該單層可以作為粘著促進(jìn)層施加于由氧化物制備的光透明層。有利 的是，有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸能與識(shí)別元件(尤其與結(jié)合在載體蛋白質(zhì) 上的識(shí)別元件)相互作用，并增強(qiáng)所述識(shí)別元件與生物芯片的結(jié)合。 在設(shè)備的優(yōu)選形式中，有機(jī)磷酸和/或有機(jī)膦酸(優(yōu)選有機(jī)磷酸鹽) 以粘著促進(jìn)層形式施加于薄膜波導(dǎo)，優(yōu)選施加于由氧化物制備的光透明 層。所述粘著促進(jìn)層可增強(qiáng)識(shí)別元件對(duì)薄膜波導(dǎo)或生物芯片的結(jié)合。
優(yōu)選粘著促進(jìn)層具有小于200nm、優(yōu)選小于20 nm的厚度。 激發(fā)光優(yōu)選通過(guò)使用一種或多種格柵結(jié)構(gòu)而耦合進(jìn)光透明波導(dǎo)層
(a)。
所述格柵結(jié)構(gòu)優(yōu)選是具有任何剖面的凹凸格柵(Reliefgitter)(例 如具有矩形、三角或半圓剖面)，或是在基本平的光透明層(a)中周期調(diào) 節(jié)折射率的相格柵或體積格柵。格柵結(jié)構(gòu)也可以是帶有一致周期的衍射
格柵，或可以是多衍射格柵。格柵結(jié)構(gòu)可具有周期性，其在垂直或平行 于耦合入光透明波導(dǎo)層(a)的激發(fā)光傳播方向的空間中變化。
優(yōu)選可用于耦合入激發(fā)光的格柵結(jié)構(gòu)具有200 nm至1000 nm,優(yōu)選 200 nm至400 nm的周期。而且，優(yōu)選格柵的調(diào)制深度(Modulatkmstief) 為3 nm至60 nm，優(yōu)選為10 nm至40 nm。優(yōu)選調(diào)制深度與第一光透明 波導(dǎo)層(a)厚度的比率等于或小于0.4。同樣，優(yōu)選折射率的調(diào)節(jié)發(fā)生在 層a和層b之間的分界面上以及在層a與分析介質(zhì)的分界面上。
優(yōu)選光透明波導(dǎo)層(a)具有40 nm至1000 nm的厚度，優(yōu)選40 nm 至300 nm,更優(yōu)選80 nm至200 nm。
層(a)和(b)間折射指數(shù)的差異優(yōu)選 2 0.2,優(yōu)選2 0.5,并更優(yōu)選是
0.56。
激發(fā)光優(yōu)選具有300 nm至1100 nm的波長(zhǎng)，優(yōu)選300 nm至 800 nm ,更優(yōu)選500 nm至700 nm。
合適的激發(fā)光可通過(guò)格柵結(jié)構(gòu)耦合進(jìn)入，在耦合入和在層(a)中傳導(dǎo) 的光的傳播方向上，下游連接有層(a)的非調(diào)節(jié)區(qū)，其設(shè)置有多個(gè)測(cè)量區(qū) 的陣列，在這些陣列上檢測(cè)各種真菌毒素。在傳導(dǎo)光傳播的方向上，可 有利地下游連接有一個(gè)或多個(gè)其他格柵結(jié)構(gòu)，其中其下游帶有另 一個(gè)測(cè) 量區(qū)陣列?；蛘撸?一個(gè)陣列或多個(gè)陣列的測(cè)量區(qū)可在層(a)的調(diào)節(jié)區(qū)域中。
列，分配有對(duì)于該陣列呈特異性的格1冊(cè)結(jié)構(gòu)、，來(lái)耦合出所:激發(fā)光，其 中對(duì)特定用于各陣列的格柵結(jié)構(gòu)垂直于耦合入的激發(fā)光的傳播方向構(gòu) 造，或者也可以該方向穿過(guò)整個(gè)薄膜波導(dǎo)而延伸。
設(shè)備可具有非常大量的單獨(dú)的測(cè)量場(chǎng)。在設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施方案中，
作為化學(xué)或生化識(shí)別元件的特異性和/或親和性結(jié)合配偶體以多至
100 000個(gè)測(cè)量場(chǎng)或點(diǎn)的形式以二維排列施加，其中單個(gè)測(cè)量場(chǎng)或點(diǎn)優(yōu) 選具有0.001 mm 至6 mm 的面積，優(yōu)選O. 1 mm2至1 mm范圍。優(yōu) 選每平方厘米大于10、優(yōu)選大于50個(gè)測(cè)量場(chǎng)施加于薄膜波導(dǎo)或生物芯 片上。
本發(fā)明的另 一主題是用于檢測(cè)真菌毒素的試劑盒。試劑盒包括至少 一個(gè)薄膜波導(dǎo)，所述薄膜波導(dǎo)包括在第二光透明層(b)上的第 一光透明波 導(dǎo)層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結(jié)合配偶體 作為生物毒素和/或結(jié)合配偶體的化學(xué)或生化識(shí)別元件以空間分離的方 式固定在該薄膜波導(dǎo)上。
試劑盒可另外包括至少 一種包含優(yōu)選標(biāo)記的結(jié)合配偶體的試劑。試 劑盒還可包括數(shù)種包含優(yōu)選標(biāo)記的結(jié)合配偶體的試劑或包含不同標(biāo)記 的結(jié)合配偶體混合物的試劑。試劑盒可另外包括用以實(shí)施如前述任意權(quán) 利要求所述檢測(cè)的緩沖液和/或溶劑。還設(shè)想了包括檢測(cè)單元的試劑盒。
試劑盒可用于快速檢測(cè)真菌毒素。
以下給出了用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1
建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用以在間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試中在消逝場(chǎng)生物芯片上 測(cè)量玉米赤霉烯酮
7個(gè)生物芯片(Unaxis 乂>司，Liechtenstein),其外尺寸為1 cm x 2 cm，由玻璃制成，玻璃中刻有18 nm格柵深度的光格柵，并提供有155 nm厚的五氧化鉭層，通過(guò)將生物芯片浸入含500 十八烷基膦酸的 正庚烷/異丙醇(9:1)溶液中來(lái)涂覆十八烷基膦酸。在"生物芯片陣列器" (PerkinElmer,德國(guó))型的點(diǎn)樣儀的幫助下，將玉米赤霉烯酮和牛血清白 蛋白的綴合物(ZEA-BSA, ZEA:BSA比率=50:1,由Biopure公司，Tulln, 奧地利制備)和標(biāo)記有染料DyLight 647 (Pierce,德國(guó))的BSA分子 (DyLight 647-BSA)上樣于生物芯片上。點(diǎn)樣溶液含濃度為5xl(T4 mg/ml DyLight 647-BSA,在含有0.1% BSA和0.1% Tween 20的PBS (137 mM NaCl, 2.8mMKCl， 10mMNa2HPO4， 1.8mMKH2P04, pH7.4)中，以 及0.5 mg/ml BSA-ZEA綴合物，在含有0.1% BSA和0.1% Tween 20的 PBS中。將點(diǎn)以兩個(gè)場(chǎng)(陣列)形式點(diǎn)樣到芯片上新的交替的行中，每
行有10個(gè)DyLight 647-BSA點(diǎn)和BSA-ZEA綴合物點(diǎn)。
高空氣濕度(40%)情況下溫育點(diǎn)過(guò)夜，然后用在PBS中的3% BSA 溶液處理生物芯片4小時(shí)。將測(cè)量室施加到芯片上，使得在每個(gè)芯片上 形成帶有分離的反應(yīng)室的兩個(gè)陣列。制備0 )Lig/1至31 pg/1的不同濃度 的玉米赤霉烯酮水溶液，并與用DyLight 647標(biāo)記的單克隆抗玉米赤霉 烯酮抗體(Biotez, Berlin)混合，由此在每種情況下制備出1 nM抗體溶 液。
在每種情況下，將不同濃度的混合物導(dǎo)入測(cè)量室中，在"Minifluo IV" 熒光讀數(shù)儀(Bayer Technology Services,德國(guó))上測(cè)量生物芯片最多10 分鐘，而不進(jìn)行其他處理步驟。每個(gè)玉米赤霉烯酮點(diǎn)上得到的熒光強(qiáng)度 除以特定點(diǎn)上下的DyLight 647-BSA點(diǎn)熒光強(qiáng)度的平均值。確定陣列中 所有40個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的平均值。得到的濃度依賴性熒光強(qiáng)度在Origin 7G (Origin Lab Corporation,美國(guó))計(jì)算機(jī)程序的輔助下通過(guò)S形擬合來(lái) 擬合。
可以發(fā)現(xiàn)，通過(guò)評(píng)估樣品的熒光強(qiáng)度，能在0.4ppb至4ppb玉米 赤霉烯酮范圍內(nèi)定量ZEA濃度，所述測(cè)量范圍分別對(duì)應(yīng)于擬合的S形 曲線中最大熒光強(qiáng)度的80%和20%,對(duì)應(yīng)于溶液中所用的ZEA濃度范 圍的1 nM至10nM 。
實(shí)施例2
建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用以測(cè)量脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)并測(cè)量污染的谷物 飼料樣品
15個(gè)生物芯片(Unaxis公司，Liechtenstein)，其外形尺寸為1 cm x 2 cm,由玻璃制成，玻璃中刻有(18 nm格柵深度的)光格柵，提供有五 氧化鉭層(155 nm),(通過(guò)將生物芯片浸入十八烷基膦酸的正庚烷/ 異丙醇9:1溶液中來(lái))涂覆十八烷基膦酸。在Nan叩lotter (GeSiM,德國(guó)) 型的點(diǎn)樣儀的幫助下，將脫氧瓜萎鐮菌醇和牛血清白蛋白的綴合物 (DON-BSA, DON:BSA比率=100:1,由Biopure公司，Tulln,奧地利 制備)和狗IgG (Rockland,美國(guó))上樣于生物芯片上。點(diǎn)樣溶液由含濃 度為0.2 mg/ml的狗IgG的含海藻糖的PBS (137 mM NaCl, 2.8 mM KC1, 10 mM Na2HP04, 1.8 mM KH2P04, pH 7.4)和含濃度為1 mg/ml的 BSA-DON綴合物的含海藻糖的PBS組成。以兩排每排有12個(gè)狗IgG點(diǎn)
的和它們之間一排12個(gè)BSA-DON綴合物點(diǎn)的方式將點(diǎn)通過(guò)兩個(gè)場(chǎng)(陣 列)上樣到芯片上。
將點(diǎn)于37。C溫育1 h,然后用PBS中的BSA溶液處理生物芯片多至 4小時(shí)。將測(cè)量室加到芯片上，使得在每個(gè)芯片上形成帶有分離的反應(yīng) 室的兩個(gè)陣列。通過(guò)與70Q/o曱醇的水溶液(v/v)—起搖動(dòng)5分鐘來(lái)提取5g 無(wú)污染的小麥粉。離心提取物，然后用含BSA、酪蛋白、干燥低脂奶粉、 Tween20,聚乙二醇和蔗糖的Tris檸檬酸緩沖液(pH 7.4)以l:4(v/v, 提取物:緩沖液)的比率稀釋。制備不同濃度(15至150 pg/l)的脫氧瓜萎鐮 菌醇，并與用DyLight 647標(biāo)記的單克隆抗脫氧瓜萎鐮菌醇抗體以及與 同樣標(biāo)記有DyLight 647的單克隆山羊抗狗IgG抗體混合，由此在每種 情況下制備出lnM抗體溶液。
在每種情況下，將不同濃度的溶液導(dǎo)入測(cè)量室中，在"MinifluoIV" 熒光讀數(shù)儀(Bayer Technology Services,德國(guó))上測(cè)量生物芯片最多10分 鐘，而不進(jìn)行其他處理步驟。每個(gè)脫氧瓜萎鐮菌醇點(diǎn)上得到的熒光強(qiáng)度 除以各點(diǎn)上下的狗IgG點(diǎn)熒光強(qiáng)度的平均值。確定陣列中所有12個(gè)DON 點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的歸 一化的平均值。得到的濃度依賴性的正態(tài)化的熒光強(qiáng) 度在計(jì)算機(jī)程序的輔助下通過(guò)指數(shù)擬合來(lái)擬合。
與以上所示提取方法相似，提取5gDON-污染的谷物并丑粉飼料樣品 (Coring公司，德國(guó)，被鑒定有526 ppb DON)并稀釋提取物。對(duì)于300 pl 稀釋的提取物，將用DyLight 647標(biāo)記的單克隆抗脫氧瓜萎鐮菌醇抗體 和同樣標(biāo)記有DyLight647的單克隆山羊抗狗IgG抗體加入，使得在每 種情況下得到lnM抗體溶液。在每種情況下，將100^1溶液導(dǎo)入測(cè)量 室中，在"Minifluo IV，，熒光讀數(shù)儀(Bayer Technology Services,德國(guó))上 測(cè)量生物芯片最多10分鐘，而不進(jìn)行其他處理步驟。每個(gè)脫氧瓜萎鐮 菌醇點(diǎn)上得到的熒光強(qiáng)度除以特定點(diǎn)上下的狗IgG點(diǎn)熒光強(qiáng)度的平均 值。確定陣列中所有12個(gè)DON點(diǎn)的焚光強(qiáng)度的歸一化的平均值。得到 的熒光強(qiáng)度在上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的幫助下轉(zhuǎn)化成谷物粗粉飼料中的DON濃 度，通過(guò)3次測(cè)量由此得到590 ppb的平均值。
權(quán)利要求
1. 用于快速檢測(cè)真菌毒素的方法，其包括以下步驟:a)提供薄膜波導(dǎo)，其包括在第二光透明層(b)上的第一光透明波導(dǎo)層(a)，其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結(jié)合配偶體作為真菌毒素和/或結(jié)合配偶體的化學(xué)或生化識(shí)別元件以空間分離的方式固定在該薄膜波導(dǎo)上，b)將含一種或多種真菌毒素的樣品和結(jié)合配偶體施加于所述薄膜波導(dǎo)上固定的結(jié)合配偶體上，c)檢測(cè)由于固定在薄膜波導(dǎo)上的結(jié)合配偶體與來(lái)自樣品的真菌毒素和/或與結(jié)合配偶體的相互作用產(chǎn)生的消逝場(chǎng)中的信號(hào)，d)確定樣品中存在的一種或多種真菌毒素的量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將單或多層下式(I)的 有機(jī)磷酸R-OP03H2 (I)和/或下式(n)的有機(jī)膦酸R-P03H2 (II)和/或它們的鹽施加到所述薄膜波導(dǎo)，其中 R是Cio至C24坑基。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于使用有機(jī)磷酸、有機(jī) 膦酸、有機(jī)磷酸鹽和/或有機(jī)膦酸鹽，其中R選自包括無(wú)支鏈的 do至 C20烷基的組，優(yōu)選選自包括無(wú)支鏈的C12至d8烷基的組，有機(jī)磷酸、 有機(jī)膦酸、有機(jī)磷酸鹽和/或有機(jī)膦酸鹽優(yōu)選選自包括十二烷基磷酸、十 二烷基磷酸鹽、十八烷基膦酸鹽和/或十八烷基膦酸的組。
4. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于使用包括光透明 波導(dǎo)層(a)的薄膜波導(dǎo)，該薄膜波導(dǎo)包括氧化物，所述氧化物選自包括 Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組，優(yōu)選選自包括Ti02、 Ta205和/或Nb205的組。
5. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于所述所述結(jié)合配 偶體選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒素抗體綴合物、真菌毒素、真 菌毒素綴合物、抗真菌毒素抗體片段、真菌毒素結(jié)合肽、真菌毒素結(jié)合 性抗運(yùn)載蛋白、真菌毒素結(jié)合性適體、真菌毒素結(jié)合性適配子和/或真菌 毒素結(jié)合性印跡聚合物的組，優(yōu)選選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒 素抗體綴合物、真菌毒素和/或真菌毒素綴合物的組。
6. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于所述標(biāo)記元件，優(yōu)選是熒光團(tuán)，通過(guò)蛋白質(zhì)，優(yōu)選通過(guò)牛血清白蛋白，與真菌毒素結(jié)合。
7. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于所述樣品是人或 動(dòng)物的食品，其優(yōu)選選自包括谷類、酒、果汁、水果和/或含谷類、酒、 果汁和/或水果的產(chǎn)品、或用溶劑或溶劑混合物提取的所述食品或產(chǎn)品的 提取物的組。
8. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，在檢測(cè)信號(hào)前， 樣品與作為化學(xué)或生化識(shí)別元件的固定結(jié)合配偶體和/或結(jié)合配偶體一起溫育小于15分鐘，優(yōu)選小于10分鐘。
9. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素 選自包括黃曲霉毒素、赭曲毒素、麥角生物堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒 素的組，例如選自包括脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、 T-2毒素、HT-2毒素和/或伏馬菌素的組，優(yōu)選選自包括赭曲毒素A、 脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、 伏馬菌素Bl、伏馬菌素B2和/或伏馬菌素B3的組。
10. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于在谷類提取物中 檢測(cè)甚至為0.1pM至100nM真菌毒素、優(yōu)選1 pM至1 nM真菌毒素 的真菌毒素。
11. 如前述權(quán)利要求之一所述的方法，其特征在于通過(guò)免疫測(cè)試、 優(yōu)選竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試、尤其優(yōu)選間接竟?fàn)幮悦庖邷y(cè)試，實(shí)施檢測(cè)。
12. 用于實(shí)施快速檢測(cè)真菌毒素的方法的設(shè)備，其特征在于，該設(shè) 備含有薄膜波導(dǎo)，該薄膜波導(dǎo)包括在第二光透明層(b)上的第 一光透明波 導(dǎo)層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率。
13. 如權(quán)利要求12所述的設(shè)備，其特征在于，所述薄膜波導(dǎo)的光 透明層(b)由諸如玻璃或石英的硅酸鹽或由透明塑料制成，所述透明塑料 優(yōu)選選自包括聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚曱基丙烯酸酯、聚苯乙烯、環(huán)狀 聚烯烴和/或環(huán)狀聚烯烴共聚物的組，更優(yōu)選由環(huán)狀聚烯烴制成，該薄膜 波導(dǎo)包括在笫二光透明層(b)上的第 一光透明波導(dǎo)層(a),其中(b)具有比(a) 低的折射率。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的設(shè)備，其特征在于，所述光透明波 導(dǎo)層(a)具有40nm至1000 nm的厚度，優(yōu)選40 nm至300 nm，更優(yōu) 選80 nm至200亂
15. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特征在于，通過(guò)使用一種 或多種格柵結(jié)構(gòu)將激發(fā)光耦合進(jìn)光透明波導(dǎo)層(a)。
16. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特征在于，用于耦合激發(fā) 光的祐4冊(cè)結(jié)構(gòu)具有200 nm至1000 nm的周期，優(yōu)選200 nm至400 nm。
17. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特征在于，所述格柵具有 3nm至60nm的調(diào)制深度，優(yōu)選10nm至40 nm。
18. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特征在于，所述激發(fā)光具 有300 nm至1100 nm的波長(zhǎng)，優(yōu)選300 nm至800 nm,更優(yōu)選500 nm 至700 nm。
19. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特征在于，將單或多層下 式(I)的有機(jī)磷酸R-OP03H2 ①和/或下式(n)的有機(jī)膦酸<formula>formula see original document page 4</formula>(II)和/或它們的鹽施加于薄膜波導(dǎo)，其中R 是 Cio 至C24坑基。
20. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特4正在于所述識(shí)別元件以 多至iooooo個(gè)測(cè)量場(chǎng)形式以二維排列施加，其中一個(gè)測(cè)量場(chǎng)具有優(yōu)選0週mm2至6 mm2的面積，更4尤選0.1 mm 至1 mm 。
21. 如前述權(quán)利要求之一所述的設(shè)備，其特征在于每平方厘米有大于10個(gè)、優(yōu)選大于50個(gè)測(cè)量場(chǎng)#:施加于薄膜波導(dǎo)。
22. 用于快速檢測(cè)真菌毒素的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括至 少一個(gè)薄膜波導(dǎo)，該薄膜波導(dǎo)包括在笫二光透明層(b)上的第 一光透明波 導(dǎo)層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結(jié)合配偶體 作為真菌毒素和/或結(jié)合配偶體的化學(xué)或生化識(shí)別元件以空間分離的方 式固定在該薄膜波導(dǎo)上。
23. 如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于它包含試劑，其優(yōu) 選包含熒光標(biāo)記的結(jié)合配偶體。
24. 如前述權(quán)利要求之一所述的試劑盒用于快速^^測(cè)真菌毒素的 用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)真菌毒素的設(shè)備和方法并涉及適于實(shí)施所述方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101384896SQ200680053201
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者I·多恩, I·豪瑟-哈恩, J·伯梅斯特, U·拉比 申請(qǐng)人:拜爾技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司;拜爾農(nóng)作物科學(xué)股份公司