專利名稱：：雞新城疫抗體免疫膠體金快速檢測試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于免疫應用領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領域。具體的講，本發(fā)明屬于一種雞傳染病抗體快速檢測試劑盒，用于雞血清中雞新城疫抗體的檢測，以確定被檢雞是否感染過雞新城疫病毒或免疫過的雞體內(nèi)是否產(chǎn)生了相應的抗體。
背景技術：
：新城疫(Newcastledisease,ND)又名為雞瘟、亞洲雞瘟等，是目前危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要禽類傳染病之一，主要侵害雞、火雞，其它禽類和野禽類，引起呼吸道感染及免疫抑制，多年來一直在各類禽群中廣泛存在，雖然各有疫苗進行免疫接種，但免疫雞群仍頻頻發(fā)病，致使病情延綿不絕，給我國養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。國內(nèi)絕大多數(shù)雞場在進行了新城疫疫苗的免疫后，進行抗體監(jiān)測的很少，主要是因為沒有簡便快捷的方法。針對雞新城疫的監(jiān)測和檢測仍停留在原有的經(jīng)典方法上，如瓊脂擴散試驗(Agarosegelimmunodiffusion;AGID)、血凝抑制試驗(Hemagglutinationinhibition;HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay;ELISA)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(Neuraminidaseinhibitortest;NIT)、病毒中和試驗(VirusNeutralizationTest;VNT)等，這些方法有的耗費時間長(如瓊脂擴散試驗需2448小時；血凝抑制試驗需23小時；ELISA試驗需35小時等)，有的需要昂貴的儀器設備和繁瑣的操作步驟，較高的技術操作人員，只能在實驗室完成，不便于適時和快速診斷。免疫層析(immunochromatography)是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨特的免疫分析方法，該方法的核心技術是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細管作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應。膠體金免疫層析分析(gold-immunochromatographyassay;GICA)是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，應用于抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術(OsikowiczGetal.One-stepchromatographicimmunoassayforqualitativedeterminationofchoricogonadotropininurine.ClinChem.1990,36,1586)。層析過程中，金標記物與事先固相化于層析材料(例如硝酸纖維素膜，即NC膜)上的抗原或抗體(檢測線)發(fā)生特異性的免疫反應而被截留，進一步富集，形成肉眼可見的紫紅色條帶，從而得到直觀的實驗結果，達到快速檢測的目的。這種方法對所使用的抗原抗體的要求較高，要求具有好的特異性和高純度。依據(jù)這種原理，已經(jīng)研制出了很多膠體金免疫層析快速檢測試紙條。在人醫(yī)應用方面，國內(nèi)外已在激素、傳染病病原的抗原和抗體、性病病原、細菌、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病標志物、藥物以及其他一些蛋白質(zhì)等方面應用了金標免疫層析試紙條。在獸醫(yī)應用方面，例如在豬瘟、犬細小病毒病等方面也應用了金標免疫層析試紙條。在雞疫病診斷和檢測方面，中國發(fā)明專利(專利號ZL99101537.1)，公開了一種畜禽疫病快速診斷試紙條的制備及應用，但該發(fā)明的要點是針對畜禽疫病病原的檢測，并未涉及對雞新城疫抗體的檢測。新城疫抗體半定量快速檢測金標試紙條制造方法專利申請(申請?zhí)?00610042408.0)，是采用膠體金標記新城疫病毒作為金標墊，新城疫病毒作為檢測線，該方法一些弊端病毒的純化不易標準化，而且，容易散毒，生物安全性較差；其特異性、靈敏度也不易控制，批間、批內(nèi)差異也較大，很難標準化生產(chǎn)，且未公開其采用的生物材料樣品，也沒有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，本領域的技術人員無法實施該發(fā)明并達到該發(fā)明所示的效果。而本發(fā)明采用的原理與專利申請200610042408.0不同，我們采用膠體金標記抗雞IgG的Fc段單抗作為金標墊，基因工程方法表達的蛋白作為檢測線，這樣具有一些明顯的優(yōu)點特異性較好、靈敏度較高，批間差異也較小，不存在散毒的問題，生物安全性好，生產(chǎn)也很容易標準化(表1)。表1本發(fā)明的試劑盒與專利申請200610042408.0的比較<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷。其第一個目的是組裝一種用于檢測雞新城疫抗體的試劑盒；第二個目的是本發(fā)明的試劑盒在雞新城疫抗體檢測中的應用。本發(fā)明的總體技術路線圖見圖1所示。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的試劑盒是由盒體和包含在盒體內(nèi)的試紙卡、樣品稀釋液組成。試紙卡(結構圖如圖2、3所示)是本發(fā)明的試劑盒的核心，由試紙條與測試卡組成。試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標墊(2)、樣品墊(1)的依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構成。金標墊(2)上包被有膠體金標記的抗雞IgGFc單克隆抗體(分泌該抗體的雜交瘤細胞系BDRPDP專利號ZL200510011521.8，保藏編號為CCTCCNO:C200501);硝酸纖維素膜(NC膜)(3)上分別包被有重組雞新城疫病毒重組血凝素神經(jīng)氨酸酶HN蛋白，構成的檢測線(T線)(5)和兔抗鼠IgG構成的質(zhì)控線(C線)(6);將試紙條裝入測試卡(8)中構成試紙卡。樣品稀釋液為0.8%氯化鈉溶液。所述硝酸纖維素膜(NC膜)、吸收墊、金標墊、樣品墊、不吸水的支撐薄片均購自Millipore公司。所述親和層析柱購自AmershamBiosciences公司。包含重組質(zhì)粒pKG-6p-l-HN的大腸桿菌(&c/^n'cWaco/z')BL21/pKG-6p-l-HN已于2007年12月20日保藏在位于中國湖北省武漢市武漢大學內(nèi)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M207205。本發(fā)明的原理是分別選用親和層析純化的雞新城疫病毒重組血凝素(HN)蛋白，作為檢測線，抗雞IgGFc片斷單克隆抗體作為膠體金標記的抗體，利用間接法(ShyuRH等，Colloidalgold-basedimmunochromatographicassayfordetectionofricinJToxicon2002,40(3):255-258)來檢測被檢材料中是否含有雞新城疫抗體。檢測時，樣品中所有的雞IgG分子的Fc片段先和金標記抗雞IgGFc段單克隆抗體結合，由于毛細管作用，反應復合物沿包被膜向前泳動，若樣品中有抗雞新城疫的特異性抗體，到達檢測線時，遇到包被在硝酸纖維素膜上的重組蛋白，就會形成重組蛋白-抗體-金標記單克隆抗體復合物，從而富集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線；若不是抗雞新城疫的特異性抗體形成的抗體-金標記單克隆抗體復合物則會直接通過檢測線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陽性結果。若樣品中不含雞新城疫病毒抗體，反應復合物到達檢測線時，遇到捕獲抗原就不會形成重組蛋白-抗體-金標記單克隆抗體復合物，反應復合物通過檢測線，富集在質(zhì)控線上，形成紅色沉淀線，即判為陰性結果。本發(fā)明優(yōu)點1、本發(fā)明的優(yōu)點之一是生物安全性高。本發(fā)明所涉及到的表達載體pGEX-KG是分子生物學中常用的表達載體，沒有生物危險性，在此基礎上構建的表達載體pKG-6p-l-HN也沒有任何生物危險性。重組大腸桿菌BL21/pKG-6p-l-HN是將表達載體pKG-6p-l-HN轉(zhuǎn)化至分子生物學中常用的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得，也不具生物危險性。本發(fā)明中的試紙條檢測線包被的是本發(fā)明制備的雞新城疫病毒重組非結構蛋白，制備過程中不涉及雞新城疫活病毒，因此沒有雞新城疫活病毒逃逸、擴散的潛在危險。2、本發(fā)明的優(yōu)點之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的雞新城疫抗體檢測試劑盒所需的核心試劑是抗雞IgGFc單克隆抗體與雞新城疫病毒重組血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN蛋白)?？闺uIgGFc單克隆抗體可以通過將分泌抗雞IgGFc片斷的單克隆雜交瘤細胞系(專利號:ZL200510011521.8，保藏編號為CCTCCNO:C200501)注射Balb/C小鼠腹腔，誘生腹水，通過經(jīng)濟的辛酸-硫酸銨方法純化而大量獲得。HN蛋白可以通過重組大腸桿菌BL21/pKG-6p-l-HN在體外得到大量的表達，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。3、與已公開的用于雞新城疫抗體檢測的其他方法相比，本發(fā)明的試劑盒具有許多其他方法所不能比擬的優(yōu)點，如檢測快速(1015min);不需要任何特殊儀器、設備，可用于現(xiàn)場操作；操作簡便，只需一步反應，不需由專業(yè)人員操作；檢測成本低；檢測過程中只需一種試劑(0.8。/。NaCl溶液)，對人體無危害，對環(huán)境無污染；儲存方便，對溫度要求不高，在4。C下有效保存期可達一年；在室溫下可保存六個月。圖1:本發(fā)明的總體技術路線圖圖2:本發(fā)明試紙卡的側視圖，圖中-1樣品墊(樣品端)；2為金標墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端);5為檢測線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；7為不吸水的支撐薄片條；8為測試卡;9為加樣孔。圖3:本發(fā)明試紙卡的俯視圖，圖中1樣品墊(樣品端)；2為金標墊；3為硝酸纖維素膜(NC膜)；4為吸收墊(手柄端);5為檢測線，即T線；6為質(zhì)控線，即C線；8為測試卡；9為加樣孔。圖4:發(fā)明試紙卡結果判定示意圖，圖中&為陽性結果++++;13性結果+++;0為陽性結果++;d為陽性結果+;e為陰性結果;f、g為試紙卡失效圖5:本發(fā)明涉及的HN重組蛋白表達質(zhì)粒的物理構建圖具體實施方式實施例l雞新城疫病毒HN蛋白的制備所使用的分子生物學方法參見文獻薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁，黎孟楓等譯)，分子克隆實驗指南，第二版，北京科學出版社，1992中提供的方法進行。1、HN基因的克隆與測序本發(fā)明所涉及的HN基因是申請人根據(jù)GenBank收錄的NDVLaSota系HN基因序列自己克隆得到的，該序列與己知序列有98%的同源性。HN基因的克隆與測序具體方法是:用雞新城疫(NDV)Losota系毒株，從中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所購買，或者參照參考文獻孫淑娜，新城疫病毒F基因和HN基因的克隆表達及其ELISA抗體檢測方法的初步建立[D]，華中農(nóng)業(yè)大學，2006，中國知網(wǎng)，中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫，http:〃dlib.edu.cnki.net/kns50/detail.aspxQueryID=23&CurRec=l。尿囊腔接種于9-11日齡健康雞胚，棄24小時前死胚，收集24-96小時的雞胚尿囊液；4'C條件下4，000rpm離心30min，取上清；4。C條件下30,000rpm離心60min濃縮病毒。用pH7.2的PBS(DEPC處理水配制)溶解沉淀，分裝后-70'C保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank收錄的NDVLaSota系HN基因序列設計引物，擴增HN基因。引物序列如下上游引物P1:5'-ATAGGATCCGGGGCTAGCACACTTA陽3';下游引物P2:5'-AGCCTCGAGCTAGCCAGACTTGGCT-3'。Pl位于啟動子上游，加有5fl附iZ/位點，P2包含有終止密碼子，加入了，o/位點，兩酶切位點用下劃線標出。兩引物之間包含有缺失胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)序列的HN基因閱讀框架。取適量病毒懸液提取RNA，按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1說明書中提供的方法，擴增出DNA，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(E.Z.N.AGelExtractionKit)回收純化RT-PCR擴增產(chǎn)物，將回收的RT-PCR產(chǎn)物直接與購自TaKaRa公司的克隆載體pMD18-T進行連接反應，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到試劑盒(購自TaKaRa公司的商業(yè)試劑盒)中感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5a中，用a互補檢査轉(zhuǎn)化效果。挑取陽性克隆，采用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯，分子克隆實驗指南.第二版，北京科學出版社，1992版)提取重組質(zhì)粒DNA，并對重組質(zhì)粒DNA進行鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-HN，并送中國上海博亞生物技術公司進行測序，然后將序列測定結果與GeneBank中的有關數(shù)據(jù)進行同源性比較和分折。2、表達載體pKG-6P-l-HN的構建pMD-HN用BamHI和XhoI酶切后，回收1.6kb左右的片段，然后將此片段與用同樣的酶酶切的AmershamBiosciences公司的表達載體pGEX-6P-l-HN連接，構建表達載體。重組表達載體轉(zhuǎn)化新鮮制備的DH5a感受態(tài)細胞，并將轉(zhuǎn)化菌涂布氨芐青霉素(氨芐青霉素60)ig/mL)的LB瓊脂平板37'C培養(yǎng)過夜。挑數(shù)個單菌落培養(yǎng)過夜后用堿裂解法小量制備質(zhì)粒，進行酶切分析和PCR擴增鑒定。將得到的陽性克隆命名為pKG-6P-l-HN(包含該質(zhì)粒的大腸桿菌于2007年12月20日保藏在中國湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:M207205)。對陽性克隆用堿裂解法(薩姆布魯克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主編(金冬雁等譯)，分子克隆實驗指南，第二版，北京科學出版社，1992)大量制備質(zhì)粒DNA，并分裝凍存于-20。C。重組表達質(zhì)粒pKG-6P-l-HN構建流程如圖5所示3、雞新城疫病毒HN蛋白的表達將構建好的表達質(zhì)粒pKG-6P-l-HN轉(zhuǎn)入表達用大腸桿菌的感受態(tài)細胞^c/^z'c/n'"co/!'BL21(DE3)(Esc/im'cWaco/z'BL21(DE3)購自Stratagene公司)中，涂布到含有抗生素(氨芐青霉素6(Hig/mL)的LB平皿上，37。C培養(yǎng)1012h，長出單菌落，挑取數(shù)個單菌落于加有抗生素(氨芐青霉素60ng/mL)的3mLLB中培養(yǎng)過夜，進行細菌活化。將過夜培養(yǎng)物按比例1:50(V/V)稀釋入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C中振蕩培養(yǎng)(250~300rpm)至i」OD600=0.60.8時，加入終濃度為lmmol/L異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)培養(yǎng)誘導表達4h。4。C條件下8,000rpm離心15min，收集細菌。細菌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS配方140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04，pH7.2)洗滌一次后離心，反復快速凍融34次，用適量緩沖液STE(配方100.0mmol/LNaCl，10.0mmol/LTris-Cl,1.0mmol/LEDTApH8.0)重懸。用大超聲頭，設定功率400瓦、20個循環(huán)和破碎5秒、間隔10秒，在冰浴中超聲破碎。4。C條件下12,000rpm離心15min，棄沉淀，將上清用O.OIMpH7.2PBS充分透析后，濃縮至體積為5mL，按蛋白純化柱(GlutathioneSepharose4BHiTrapaffinitycolumns,AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)說明書提供的程序進行親和層析純化，得到純化的HN蛋白。該蛋白可用于制備檢測雞新城疫病毒抗體的試劑。實施例2兔抗鼠IgG抗體的制備1、Balb/C小鼠IgG的提取IgG的提取和純化按沈關心等(沈關心等，現(xiàn)代免疫學實驗技術(第二版)[M]，湖北科學技術出版社，2002)等所述方法進行取IO.OmL健康Balb/C小鼠血清與等量0.8%氯化鈉溶液混合后，逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液20.0mL，使成50%飽和度的(NH4)2S04溶液。4。C靜置30min后取出；4。C下3,000r/min離心30min，棄上清，沉淀中加20.0mL0.8。/o氯化鈉溶液；待沉淀溶解后，緩慢加入10.0mL飽和(NH4)2S04溶液，使成33。/。飽和度的(NH4)2S(V溶液。4。C放置30min后取出；4"C下3，000r/min離心30min。棄上清，沉淀重復進行上述操作后，將沉淀溶于1.0mL0.8。/。氯化鈉溶液(原血清量體積的1/10)，裝入透析袋內(nèi)用0.8%氯化鈉溶液透析除鹽。用2XBaCl2溶液檢測(NH4)2S04是否已被透析完全。透析完全后，蛋白溶液用聚乙二醇(PEG)-20,000濃縮至適當體積，fC下12，000r/min離心10min，取上清，測定蛋白質(zhì)含量，即得到粗提的Balb/C小鼠IgG。2、Balb/C小鼠IgG的純化根據(jù)樣品的種類與容積及所選擇的層析柱來確定所選葡聚糖凝膠的種類和柱床的體積。柱床的體積按如下公式計算<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(Vt—柱床的體積；兀一圓周率；r一半徑；h—柱床高)根據(jù)樣品的種類，本發(fā)明用葡聚糖凝膠(SephadexG-200)作為層析材料。純化的具體過程如下稱取3.0gSephadexG-200倒入數(shù)倍體積的蒸餾水中混合均勻，置室溫浸泡3d，每天換蒸餾水2次，慢慢將上層含漂浮顆粒的部分倒掉后，再加入原體積的蒸餾水，凝膠浸泡好后置4'C冰箱保存?zhèn)溆谩崈舻膶游鲋怪惫潭ㄓ趯嶒灱苌?，加少量洗脫?0.01mol/L,pH7.2PBS)，檢查出液管的通暢性，合格后，關閉出液口。從4'C冰箱取出浸泡好的SephadexG-200，平衡至室溫后灌裝層析柱。在裝好的層析柱凝膠上輕輕放上與柱內(nèi)徑相當?shù)臑V紙片，0.01mol/L的磷酸緩沖液(艮卩PBS，配方如下140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04,pH7.2)平衡過夜，在凝膠的上方留出lcm2cm高的液層，準備加樣。加樣時，將凝膠上方的液層放出，待剛露出濾紙片時，立即關閉出液口。用滴管吸取樣品，在接近濾紙?zhí)幯毓鼙诹飨拢∩僭S0.8。/。氯化鈉溶液沖洗樣品瓶，將洗液加入，最后用洗脫液清洗管壁。打開出液口，在樣品全部進入柱床且剛出現(xiàn)濾紙時，立即加入洗脫液，使柱床上部形成5cm10cm厚的液層。樣品上柱后，不時以20%磺基水楊酸液檢測洗出液，當洗出液出現(xiàn)輕微乳濁反應時，立即用已經(jīng)編號的1.5mLEP管收集洗出液，每管lmL，直至洗出液用20%磺基水楊酸檢測不出渾濁時結束收集。結束收集后，用紫外分光光度計測定每管流出液中蛋白質(zhì)含量，以EP管編號為橫坐標，管內(nèi)流出液蛋白質(zhì)含量為縱坐標繪制曲線圖，根據(jù)蛋白濃度分布收集所需溶液，裝入透析袋中，PEG-20,000濃縮至適當體積。4。Cl2,000r/min離心10min，收集上清，用紫外分光光度計測定經(jīng)過濃縮后的Balb/C小鼠IgG蛋白含量，置-2(TC凍存。3、家兔的免疫及兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化選取體重在2.5kg左右的成年雄性健康家兔，用1和2中制備的抗原，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG，免疫劑量為2mglgG/只家兔，以后各次用弗氏不完全佐劑乳化的Balb/C小鼠IgG免疫。除首免與二免間隔3周外，其余每次免疫間隔10天，且每次免疫劑量中Balb/C小鼠IgG的含量較前一次高0.8mg,每次免疫途徑全部采用皮下多點注射。免疫3次后，采血檢測血清效價，當血清AGID(瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agargelimmunodiffusion,AGID)簡稱瓊擴試驗)效價達到1:32時，再加強免疫1次，IO天后頸動脈放血，分離血清，用于兔抗Balb/C小鼠IgG的提取。按照1和2的方法進行兔抗Balb/C小鼠IgG的提取與純化。即可得到本發(fā)明所需高特異性、高效價的兔抗鼠IgG抗體。利用該抗體可作為本發(fā)明膠體金試紙卡的質(zhì)控線(C線)。實施例3硝酸纖維素膜的制備1包被緩沖液的配制含3y。甲醇的0.01MpH7.2PB緩沖液為包被緩沖液，0.22p膜濾過，置4'C備用，有效期一周。1000ml3n/。甲醇的0.(UMpH7.2PB緩沖液配方KC10.2g、Na2HP(V12H202.9g、KH2PO40.2g、甲醇30ml,雙蒸去離子水定容至1000ml。2硝酸纖維素膜的制備用包被緩沖液將HN蛋白稀釋到50100ng/ml，調(diào)整機器，劃線為T線，即為檢測線(T線)靠近金標墊端，距金標墊端約5mm;用包被緩沖液將兔抗鼠IgG抗體稀釋到50100嗎/ml，調(diào)整機器，劃線為C線，即為質(zhì)控線，C線靠近吸收墊，距吸收墊約3mm。兩線距離58mm，線應細致、均勻。37t:烘干，封裝備用。實施例4膠體金、金標記單克隆抗體的制備1、溶液的配制(1)氯金酸的配制用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1%溶液，置4'C備用，有效期四個月。1000ml1%氯金酸溶液配方10g氯金酸；雙蒸去離子水定容至1000ml。(2)1%檸檬酸三鈉的配制用雙蒸去離子水溶解檸檬酸三鈉，配成l。/。溶液，0.22nm膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)0.1Mol/L碳酸鉀的配制用雙蒸去離子水配制，0.22pm膜濾過，置4匸備用，有效期四個月。1000ml0.1Mol/L碳酸鉀溶液配方13.8g碳酸鉀；雙蒸去離子水定容至1000ml。(4)2。/。PEG-20000的配制用雙蒸去離子水配制，0.22^m膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml2。/oPEG-20000溶液配方20gPEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000ml。(5)標記洗滌保存液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、0.05%疊氮鈉(NaN3)、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22pm膜濾過，置4。C備用，有效期四個月。1000ml標記洗滌保存液配方20gBSA、0.5gNaN3、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2、膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01°/。，置電爐煮沸，按每100ml0.01。/。氯金酸加入2mll。/。檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。3、膠體金標記單克隆抗體的制備-用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按810嗎抗體/ml膠體金加入抗雞IgGFc段單克隆抗體，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1%，靜置1小時。13000rpm、4'C離心30min，棄上清，沉淀用標記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的標記洗滌保存液將沉淀重懸，置4'C備用，有效期一周。實施例5金標墊的制備1封閉液的配制2%牛血清白蛋白(BSA)、l%Tween-20、2.5%蔗糖、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PB溶液，0.22pm微孔濾膜濾過，置(C備用，有效期四個月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3、10mlTween-20、25g蔗糖、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2金標墊的制備將金標墊浸泡于封閉液中30min后，于37'C烘干。然后將制備好的金標記抗體均勻的鋪在金標墊上，每毫升溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4'C備用。實施例6試紙條樣品墊的制備1封閉液的配制2%BSA、0.5%Tween-20、2.5%蔗糖、0.05%NaN3、0.01MpH7.2PBS溶液，0.22nm微孔濾膜濾過，置4'C備用，有效期四個月。1000ml封閉液配方20gBSA、0.5gNaN3,5mlTween-20、2.5g蔗糖、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000ml。2樣品墊的制備將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37'C烘干，封裝，置4"C備用。實施例7試紙卡的組裝將硝酸纖維素膜、吸收墊、玻璃纖維、樣品墊按圖依次層疊起來，切成3.6mm寬的小條，然后裝入測試卡。每十個一包，加入干燥劑，真空封裝。48'C保存，有效期一年；常溫保存，有效期6個月。實施例81快速檢測雞新城疫病毒抗體的試劑盒包括①試紙卡一包(10個/包)②樣品稀釋液一瓶(10ml/瓶)2相關溶液的配制快速檢測雞新城疫病毒抗體的試劑盒的樣品稀釋液樣品稀釋液為0.8%NaCl溶液。配制方法8gNaCl，加蒸餾水定容至lOOOml。實施例9本發(fā)明試劑盒的使用方法1、樣品制備雞血清樣品的制備，將血清樣品用0.8。/。的氯化鈉溶液稀釋20倍。2、檢測取出試劑盒，室溫平衡20分鐘；打開包裝袋，取出試紙卡，取100^1制備好的樣品滴入試紙卡的加樣孔中，1015分鐘內(nèi)判定結果。3、結果判定如圖4所示，當試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陰性，記為"一"；當試紙卡出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，同時也出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陽性，記為"+";檢測線顏色深度與被檢血清中的抗體效價呈正相關，顏色越深說明被檢測樣品的抗體效價越高；檢測線顏色濃厚，與質(zhì)控線顏色一致或接近時判為++++，顏色深度介于+與++++之間時酌情判++或+++。達到+及以上的顏色深度時，判為該份被檢血清的抗體為陽性。質(zhì)控線無條帶出現(xiàn)則判為檢測試紙卡失效。實施例10快速檢測雞傳染性法氏囊抗體的試劑盒穩(wěn)定性考核設計溫度20°C、4°C設計時間0天、10天、20天、30天、2月、4月、6月、8月、10月、12月保存方法試紙卡真空封裝(貯存在4"C的冰箱內(nèi)或2(TC室溫中)考核指標敏感性表2本發(fā)明試劑盒試紙卡穩(wěn)定性測試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例11快速檢測雞新城疫抗體的試劑盒的制備及應用1、快速檢測雞新城疫抗體的試劑盒的制備按實施例1-9的方法制備快速檢測雞新城疫抗體的試劑盒。2、快速檢測雞新城疫抗體的試劑盒的應用2.1雞標準血清的檢測①特異性試驗分別將雞新城疫(ND)陽性血清、雞傳染性支氣管炎(IB)陽性血清、雞傳染性法氏囊(IBD)陽性血清(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、雞禽流感病毒H5、H7、H9亞型陽性血清(購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所)按本發(fā)明實施例9所述方法(GICA)進行試驗。結果見表3。表3顯示，本發(fā)明檢測試紙卡(GICA)與雞新城疫(ND)標準陽性血清試驗后質(zhì)控線及檢測線均出現(xiàn)明顯的紫紅色條帶；而與蒸餾水(空白)、SPF雞陰性血清、禽流感病毒H5、H7、H9亞型，雞傳染性法氏囊(IBD)、雞傳染性支氣管炎病毒(IB)等陽性血清試驗后，檢測線不出現(xiàn)紫紅色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)明顯紫紅色條帶。這表明本發(fā)明試紙卡特異性高，與雞的其他呼吸道疫病病毒抗體無任何交叉反應。表3本發(fā)明的試劑盒對雞標準血清檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>②敏感性試驗將雞新城疫標準陽性血清(購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所)用常規(guī)血凝抑制(HI)沈關心,周汝麟.現(xiàn)代免疫學實驗技術(第二版)[M]，湖北科學技術出版社，2002檢測其血凝抑制價為l:512，進行倍比稀釋。取IOO[xl稀釋好的樣品按本發(fā)明方法(GICA)進行試驗，當雞新城疫標準陽性血清稀釋至l:512時試紙卡仍判定為陽性。試驗結果見表4。結果表明，本發(fā)明檢測試紙卡法的靈敏度與血凝抑制法的效果相當。表4本發(fā)明試劑盒與常規(guī)檢測方法對雞新城疫抗體檢測的敏感性試驗結果GICA檢測HI檢測雞ND標準陽性血清1:5121:5122.2送檢雞血清樣品的檢測從湖北、河南等地的3個雞場共采集150份雞血清，按本發(fā)明方法(GICA)進行試驗。同時，用常規(guī)血凝抑制(HI)測定效價(結果見5)。表5顯示，本發(fā)明方法(GICA)檢出率為84.7。/。(127/150)，HI法為87.3%(131/150)，二者符合率為97.33%((127+19)/150，(HI和GICA同為陽性+HI和GICA同為陰性)/總樣品數(shù))。表5本發(fā)明的試劑盒與常規(guī)方法檢測效果的比較陽性陰性陽性率本發(fā)明的方法(GICA)1272384.7%血凝抑制(HI)1311987.3%盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。權利要求1、一種適用于檢測雞新城疫抗體的試劑盒，它包含盒體、設在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其特征在于，其中的試紙卡由試紙條與測試卡組成；試紙條由吸收墊(4)、硝酸纖維素膜(3)、金標墊(2)、樣品墊(1)依次粘貼在不吸水的支撐薄片(7)上構成。所述的金標墊(2)上包被有膠體金標記的抗雞IgGFc片段單克隆抗體；所述的硝酸纖維素膜(3)上分別包被有雞新城疫病毒重組血凝素HN蛋白構成的檢測線(5)和兔抗鼠IgG構成的質(zhì)控線(6)；所述的樣品稀釋液為0.8％氯化鈉溶液。2、權利要求l中所述的試劑盒在檢測雞新城疫抗體中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于免疫應用領域，涉及動物分子生物學、免疫學等相關領域。公開了一種用于快速檢測雞新城疫抗體的試劑盒。該試劑盒包含盒體、設在盒體內(nèi)的試紙卡和樣品稀釋液。其中的試紙卡是由樣品墊、吸收墊、分別包被有雞新城疫HN重組蛋白作為檢測線和包被有抗鼠IgG作為質(zhì)控線的硝酸纖維素膜依次按吸收墊、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊的順序粘貼在不吸水的支撐薄片上構成。所述試劑盒檢測相應的抗體具有特異性強、靈敏度高、操作簡便和診斷快速的顯著優(yōu)點。文檔編號G01N33/577GK101196522SQ20071016910公開日2008年6月11日申請日期2007年12月29日優(yōu)先權日2007年12月29日發(fā)明者梅劉,張展英,張文通,張進良,李自力,畢丁仁,政王,王喜亮,石德時,肖運才,胡思順,許青榮申請人:華中農(nóng)業(yè)大學