專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶 活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
單胺氧化酶(MAO)測定可分為化學分光光度法、熒光法、免疫抑制法及現(xiàn) 在申請專利的酶法。 一般多用化學分光光度法，單胺氧化酶反應底物以芐胺 (Benzylamine)和對苯甲胺-3 -偶氮萘酚，也可應用單胺氧化酶催化胺類釋放 出的仏02氧化發(fā)色劑，如10-N-甲基氨基甲?；?3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪 (MCDP)。除此之外，單胺氧化酶反應底物還有丁基胺(butylamine)、戊基胺 (amylamine)、 苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine: 3-對羥 基苯乙胺3-parahdroxyphenylethylamine)、 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine) 等，丁基胺、戊基胺、苯乙基胺約為3-對羥基苯乙胺活性的30%,通常應用 苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要高。目前單胺氧化酶測定多用芐 胺和對苯甲胺-P -偶氮萘酚為底物，但對苯甲胺-P -偶氮萘酚芐胺法需要用環(huán)乙 垸提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動生化儀分析；芐胺法的原理 是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝 基苯肼反應，生成醛苯腙，在生化儀上測定也較困難。
熒光法檢測單胺氧化酶是以P -苯乙胺作為底物，其在1(Tl00mg時Km最大， 高于芐胺和5-羥色胺的Km值。
免疫學方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應，作用后進行單 胺氧化酶同工酶測定。目前應用較多的單克隆抗體是MA0-A3C9、 MA0-A4F10、MA0-A7B10 、 MA0-A7E10和MA0-B1C2等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶 (還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度 的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷試劑盒，采用 該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行單胺氧 化酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫 二氧化碳+乙酰磷酸+過氧化氫丙酮酸氧化酶磷酸根+
丙酮酸+氧+水
丙酮酸+輔酶A十輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A
+還原型輔酶
這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase; EC 1.4,3.4; EC 1.4.3.6)酶(偶) 聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶酶解胺類化合物 反應產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最 終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm 處吸光度上升的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑較為理想 緩沖液 lOOmmol/L輔酶 3 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
丙酮酸脫氫酶 8000 U/L
胺類化合物 10mmol/L
碳酸氫鈉(二氧化碳) 15mmol/L
乙酰磷酸 7 mmol/L
輔酶A 6 mmol/L
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳
酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷
酸、輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。 輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、 乙酰磷酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀 態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷
酸、輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶。
輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、 乙酰磷酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是 干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其輔 酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
丙酮酸脫氫酶 8000 U/L
胺類化合物 10mmol/L
碳酸氫鈉(二氧化碳) 15mmol/L
乙酰磷酸 7mmol/L
輔酶A 6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定:溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例 為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間 2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340mn吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。 實施例二
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
3 mmol/L 10 mmol/L 15 mmol/L 7 mmol/L 6 mmol/L
胺類化合物 碳酸氫鈉(二氧化碳) 乙酰磷酸 輔酶A
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶 丙酮酸脫氫酶
100mmol/L 500 mmol/L
6000 U/L
8000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用,在全自動生化分析儀上設定:溫度37'C ，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1 ，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2 的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左 右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。 實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
胺類化合物 碳酸氫鈉(二氧化碳) 乙酰磷酸 輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 15 mmol/L 7 mmol/L 6 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應 時間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為 正反應(上升反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K 值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度火小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本 發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得 出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0005;吸光度時間 反應曲線應呈直線上升；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達500U/L;試劑 測試的不準確度，其相對偏差不超過士3 %;試劑測試的精密度(重復性)的變 異系數(shù)(CV)《2%;試劑在2—8'C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明
靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法原理如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫二氧化碳+乙酰磷酸+過氧化氫丙酮酸氧化酶磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶丙酮酸氧化酶丙酮酸脫氫酶胺類化合物碳酸氫鈉(二氧化碳)乙酰磷酸輔酶A20-500 mmol/L1-糊O mmol/L1- 6 mmol/L1000-80000 U/L1000——80000 U/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L1- 50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍 外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳 酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳 酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、 丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶組成。輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。
6. 根據(jù)權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、輔酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620083SQ200810122878
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司