專利名稱：一種高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶(SIase)的微生物菌株的選育方法。

背景技術(shù)：
蔗糖異構(gòu)酶是一類重要的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，它是制備功能性糖醇-異麥芽酮糖醇的關(guān)鍵酶。異麥芽酮糖醇(Isomalt)是近年來國際上新興的功能性糖醇，具有低能量、低吸收、防齲齒性能，可供糖尿病人群和減肥人士食用，食用安全性高，更值得一提的是異麥芽酮糖醇擁有極低的吸濕性和純正的口味，這是木糖醇和麥芽糖醇等其他功能糖醇難實現(xiàn)的。由于這些特點，異麥芽酮糖醇成為目前最受歡迎的蔗糖替代品。
異麥芽酮糖醇生產(chǎn)分兩步，第一步是由蔗糖異構(gòu)酶EC 5.4.99.11(Sucrose isomerase)，或叫異麥芽酮糖合成酶(Isomaltulose syntheses)，蔗糖葡萄糖基變位酶(Sucroseglucosylmutase)，α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖生成異麥芽酮糖，第二步是異麥芽酮糖在催化劑作用下氫化為異麥芽酮糖醇。已知有一些菌種能產(chǎn)生蔗糖異構(gòu)酶。美國專利4,390,627描述了從Protaminobacter rubrum(紅色精朊桿菌)固定蔗糖變位酶生產(chǎn)異麥芽酮糖的方法。美國專利4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici，Protaminobacter rubrum，Serratia plymuthica(粘質(zhì)沙雷氏菌)的固定化菌體生產(chǎn)異麥芽酮糖的過程，大約可以轉(zhuǎn)化70-95％蔗糖。美國專利4,857,461公開了從Protaminobacterrubrum，Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶連續(xù)生產(chǎn)異麥芽酮糖的過程。美國專利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Agrobacterium radiobacter(放射性土壤桿菌)的固定化菌體生產(chǎn)海藻酮糖和異麥芽酮糖的過程，異麥芽酮糖占10％以下。
雖然上述幾種細(xì)菌能夠把蔗糖轉(zhuǎn)變成異麥芽酮糖，但產(chǎn)量很不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率為8～85％。而且，除了主產(chǎn)物外，酶轉(zhuǎn)化液中還存在部分海藻酮糖和少量的異麥芽糖、異松三糖、葡萄糖和果糖等副產(chǎn)物，一般異麥芽酮糖與海藻酮糖的比例為3∶1～5∶1。產(chǎn)物特異性不高，一方面降低了目的產(chǎn)物的收率，另一方面使下游過程變得十分困難，生產(chǎn)成本大大增加。因此目前，異麥芽酮糖醇制備工藝的瓶頸主要在于蔗糖異構(gòu)酶催化制備異麥芽酮糖這一過程。
值得關(guān)注的是副產(chǎn)物海藻酮糖和異麥芽酮糖性質(zhì)類似，也是一種新型甜味劑。因此篩選獲得主產(chǎn)海藻酮糖的蔗糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌，對進一步開發(fā)新型甜味劑市場同樣也具有積極的意義。
篩選能夠高效生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的菌株，在提高SIase酶活的同時，研究影響SIase產(chǎn)物特異性的內(nèi)在因素并改善SIase產(chǎn)物特異性，對異麥芽酮糖及其糖醇的工業(yè)生產(chǎn)以及開發(fā)新型甜味劑具有重要意義。然而微生物菌株的篩選是一項繁重的工作，常規(guī)的篩選方法工作量很大，需要消耗大量的人力物力，篩選周期很長，而且往往得不到目的菌株，篩選的盲目性很大，因此建立一個高效、快速、微量、準(zhǔn)確的篩選方法是提高蔗糖異構(gòu)酶酶活、改善其產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵。
微孔板是一類在生物工程領(lǐng)域常用的實驗器皿，六十年代中期，微量培養(yǎng)板在臨床化學(xué)中是作為大容積試管的小巧微型替代物而被開發(fā)出來的，近年來已經(jīng)成功地被用作自動搜索活性成分的可靠平臺，主要用于PCR擴增、酶標(biāo)儀檢測、biolog鑒定系統(tǒng)等，常用規(guī)格有48孔板、96孔板、384孔板等，未見將微孔板應(yīng)用于菌株篩選的報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種方便快捷的高通量篩選方法，以篩選出高活力、高產(chǎn)物特異性的蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下 一種高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于該方法包括以下步驟 1、微培養(yǎng) 將待篩選的蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌(如經(jīng)過化學(xué)誘變的菌株或基因改造的工程菌)接入含有培養(yǎng)基的微孔板I中，25～35℃，轉(zhuǎn)速100～200rpm，振蕩培養(yǎng)8～20h。
2、酶轉(zhuǎn)化 將微孔板I離心去除上清液，每孔加入0.1～2mL，50～500g/L的蔗糖溶液進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
3、初篩 轉(zhuǎn)化結(jié)束后，微孔板I離心，將微孔板I中每孔的上清液稀釋50～100倍后依次轉(zhuǎn)移至另一微孔板II中。向微孔板II中加入顯色試劑，如DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)，將微孔板II置于沸水浴中反應(yīng)5分鐘，DNS與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成的3-氨基-5-硝基水揚酸在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成比例關(guān)系，根據(jù)這個原理棄去顏色淺的即總轉(zhuǎn)化率低的菌株。然后利用分光光度計檢測顯色較深的菌株轉(zhuǎn)化液的吸光值，選擇轉(zhuǎn)化率提高10％以上的菌株進行復(fù)篩。
4、復(fù)篩 將初篩后得到的菌株在搖瓶(或搖管)中培養(yǎng)，加入50～500g/L蔗糖溶液，蔗糖溶液的加入量為10～100mL/g濕菌，進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液點薄層色譜(TLC)，色譜條件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸。異麥芽酮糖和海藻酮糖在此條件下顯色不同，根據(jù)色斑顏色的深淺及斑點的大小篩選高產(chǎn)異麥芽酮糖或高產(chǎn)海藻酮糖的菌株(斑點越大、顏色越深，表明異麥芽酮糖或海藻酮糖的含量越多)。
對篩選出來的高產(chǎn)異麥芽酮糖或高產(chǎn)海藻酮糖的菌株的轉(zhuǎn)化液進行高效液相色譜定量檢測，確定菌株的異麥芽酮糖或海藻酮糖產(chǎn)量。色譜條件Agilent1200型HPLC，示差折光檢測器(Shodex R101)，色譜柱為Shodex SP0810，流動相為純水，流速為0.8mL/min，柱溫為80℃。該法可同時檢測異麥芽酮糖或海藻酮糖的濃度。
其中，步驟2或步驟3中所述的離心條件為使用酶標(biāo)板離心機，5000～10000rpm，10～30min。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明介紹了一種高活力、高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的篩選方法，綜合微培養(yǎng)板培養(yǎng)方式、酶學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)(微孔板快速檢測)及薄層色譜復(fù)篩法，建立了簡便、高效的高通量篩選方法。該篩選方法利用直觀的顯色反應(yīng)，以及酶標(biāo)板微培養(yǎng)、連續(xù)加樣器和排槍的作用，可達(dá)到每人200樣/日以上的處理量，為高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌的篩選提供了簡便、高效、微量的篩選方法。



圖1為本發(fā)明的高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法的流程圖。

具體實施例方式 實施例1篩選高產(chǎn)異麥芽酮糖的菌株。
將蔗糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體制成菌懸液(約108個)，加入化學(xué)誘變劑硫酸二乙酯原液0.2ml，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)30min后終止反應(yīng)，用磷酸鉀緩沖液(0.1mol/L，pH7.0)洗滌兩次，離心后取不同的稀釋度涂布平板，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。共獲得410株單菌落。
將單菌落接入含有液體培養(yǎng)基的96孔板中，30℃，轉(zhuǎn)速120rpm，振蕩培養(yǎng)12h。
將96孔板離心，去除上清液，每孔加入1mL、100g/L的蔗糖溶液進行轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心取上清液，依次稀釋50倍后，各取100uL轉(zhuǎn)至另一96孔板中，加等體積的無菌水和DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)，在沸水浴中充分反應(yīng)5分鐘，棄去顏色淺的即總轉(zhuǎn)化率低的菌株，初篩工作在一天內(nèi)完成，得到總轉(zhuǎn)化率較好的菌株112株。然后利用分光光度計檢測這112株轉(zhuǎn)化液的吸光值，選取55株總轉(zhuǎn)化率提高10％以上的菌株進行搖瓶復(fù)篩。
將初篩后得到的菌株在搖瓶中培養(yǎng)，加入100g/L蔗糖溶液5mL進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液點薄層色譜(TLC)，色譜條件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸。在此條件下，異麥芽酮糖顯綠色而海藻酮糖顯紅色，根據(jù)色斑顏色的深淺及斑點的大小，篩選獲得高產(chǎn)異麥芽酮糖或海藻酮糖的菌株19株，其中目的菌株即高產(chǎn)異麥芽酮糖的菌株11株。
最后對11株菌株進行液相色譜定量檢測，Agilent1200型HPLC，示差折光檢測器(Shodex R101)，色譜柱為Shodex SP0810，流動相為純水，流速為0.8mL/min，柱溫為80℃。最終獲得產(chǎn)生異麥芽酮糖∶海藻酮糖大于8∶1的菌株6株。整個篩選工作共計5天。實施例2篩選高產(chǎn)海藻酮糖的菌株。
設(shè)計一對引物，正向引物5′-TTAAGCTTCCATGGATTCTCAAGGATT-3′ 反向引物5′-TTGGATCCCTCGAGCGGATTAAGTTTATAAATG-3′ 通過PCR擴增反應(yīng)(PCR擴增條件95℃，3min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，5min，共30個循環(huán))得到Erwinia rhapontici NCPPB1579中的蔗糖異構(gòu)酶基因，經(jīng)過Nco I和Xho I雙酶切后，與載體PET-22b連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建正確表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶的基因工程菌，通過與其他菌屬的蔗糖異構(gòu)酶基因進行比對，并參考相關(guān)文獻，利用快速定點突變試劑盒(TAKALA)對該蔗糖異構(gòu)酶基因的多個保守序列進行隨機突變，然后在大腸桿菌DH5α中表達(dá)，得到有酶活的菌株317株。
將單菌落接入含有液體培養(yǎng)基的96孔板中，35℃，轉(zhuǎn)速200rpm，振蕩培養(yǎng)20h。
將96孔板離心，去除上清液，每孔加入0.2mL、500g/L的蔗糖溶液進行轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心取上清液，依次稀釋100倍后，各取50uL轉(zhuǎn)至另一96孔板中，加等體積的無菌水和DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)，在沸水浴中充分反應(yīng)5分鐘，棄去顏色淺的即總轉(zhuǎn)化率低的菌株，初篩工作在一天內(nèi)完成，得到總轉(zhuǎn)化率較好的菌株98株。然后利用分光光度計檢測這98株轉(zhuǎn)化液的吸光值，選取48株總轉(zhuǎn)化率提高10％以上的菌株進行搖瓶復(fù)篩。
將初篩后得到的菌株在搖管中培養(yǎng)，加入500g/L蔗糖溶液2mL進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化液點薄層色譜(TLC)，色譜條件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸。在此條件下，異麥芽酮糖顯綠色而海藻酮糖顯紅色，根據(jù)色斑顏色的深淺及斑點的大小，篩選獲得高產(chǎn)異麥芽酮糖或海藻酮糖的菌株15株，其中目的菌株即高產(chǎn)海藻酮糖的菌株7株。
最后對7株菌株進行液相色譜定量檢測，色譜條件Agilent1200型HPLC，示差折光檢測器(Shodex R101)，色譜柱為Shodex SP0810，流動相為純水，流速為0.8mL/min，柱溫為80℃。最終獲得產(chǎn)生海藻酮糖∶異麥芽酮糖大于8∶1的菌株3株。整個篩選工作共計5天。
權(quán)利要求
1、一種高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于該方法包括以下步驟
(1)將待篩選的蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌接入含有培養(yǎng)基的微孔板I中，振蕩培養(yǎng)；
(2)將微孔板I離心去除上清液，加入蔗糖溶液進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)；
(3)轉(zhuǎn)化結(jié)束后，微孔板I離心，將微孔板I中每孔的上清液稀釋后依次轉(zhuǎn)移至微孔板II中，向微孔板II中加入顯色試劑，并檢測吸光值，篩選出蔗糖異構(gòu)酶高產(chǎn)菌株；
(4)將蔗糖異構(gòu)酶高產(chǎn)菌株放大培養(yǎng)，加入蔗糖溶液進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，用薄層色譜檢測蔗糖轉(zhuǎn)化液中的產(chǎn)物比例，得到高產(chǎn)異麥芽酮糖的菌株或高產(chǎn)海藻酮糖的菌株。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(1)中所述的振蕩培養(yǎng)條件為25～35℃，轉(zhuǎn)速100～200rpm，振蕩培養(yǎng)8～20h。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(2)或步驟(3)中所述的離心條件為使用酶標(biāo)板離心機，5000～10000rpm，10～30min。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(3)中所述的顯色試劑為DNS試劑。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(3)中篩選出的蔗糖異構(gòu)酶高產(chǎn)菌株為轉(zhuǎn)化率提高10％以上的菌株。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(2)或步驟(4)中所述的蔗糖溶液濃度為50～500g/L。
7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(2)中蔗糖溶液每孔加入量為0.1～2mL。
8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(4)中蔗糖溶液的加入量為10～100mL/g濕菌。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，其特征在于步驟(4)中所述的菌株放大培養(yǎng)為搖瓶培養(yǎng)或搖管培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高活力高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，即將待篩選的蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌接入含有培養(yǎng)基的微孔板中振蕩培養(yǎng)，離心去除上清液，加入蔗糖溶液進行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將每孔的上清液依次轉(zhuǎn)移至另一微孔板中，加入顯色試劑，并檢測吸光值，篩選出蔗糖異構(gòu)酶高產(chǎn)菌株再進行搖瓶復(fù)篩，利用薄層色譜篩選產(chǎn)物特異性較好的菌株，最終得到高產(chǎn)異麥芽酮糖的菌株或高產(chǎn)海藻酮糖的菌株。該篩選方法利用直觀的顯色反應(yīng)，以及酶標(biāo)板微培養(yǎng)、連續(xù)加樣器和排槍的作用，可達(dá)到每人200樣/日以上的處理量，為高產(chǎn)物特異性蔗糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌的篩選提供了簡便、高效、微量的篩選方法。
文檔編號G01N30/36GK101289687SQ20081012384
公開日2008年10月22日 申請日期2008年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月10日
發(fā)明者虹 徐, 莎 李, 環(huán)民霞, 賁 任, 馮小海, 恒 蔡, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學(xué)