專利名稱：：一種檢測地塞米松的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，為食品安全，藥物檢測試劑。具體而言，本發(fā)明利用免疫反應(yīng)的高靈敏性和特異性，以及酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)和易檢測性，建立起來的一種檢測地塞米松的酶聯(lián)免疫測定試劑盒。技術(shù)背景地塞米松(dexamethasone，Dex)是糖皮質(zhì)激素可的松類的衍生物，也是醫(yī)學(xué)臨床運用最廣泛的強效皮質(zhì)激素?？傻乃深惣に赝ǔＳ脕碇委熯^敏性和嚴重感染性疾病，具抗炎和抗過敏的作用。這類激素尚有剌激食欲，增加肝糖原合成，高血糖等作用。但這種激素在食物中殘留，對人有潛在的危害，故歐盟等國都禁止地米松，氟美松等作為牲畜的促生長劑，在畜牧業(yè)中使用。歐盟禁用并且建立最大殘留限量(maximumresiduelimits,MRLs)，對地塞米松，為肝臟2ilg/kg;肌肉0.75ilg/kg;牛奶0.3ilg/L。糖皮質(zhì)激素類常用的檢測方法有薄層色譜、免疫分析法、液相色譜、氣相色譜、譜或氣_質(zhì)、液_質(zhì)、多級聯(lián)用技術(shù)等。薄層色譜靈敏度低，僅能檢測出微克(yg)級以上的樣品。不能滿足食品中殘留地塞米松的檢測要求。氣相色譜法(GC):由于糖皮質(zhì)激素中含有多個極性基團、不揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差，因此不適于直接進行GC分析。必須對糖皮質(zhì)激素結(jié)構(gòu)中基團進行的衍生化處理，包括硅烷化、?；群?，才能測定。液相色譜法(LC):液相色譜對糖皮質(zhì)激素的檢測通常用配有紫外檢測器的液相色譜，包括反相色譜和正相色譜，用來檢測血漿中的地塞米松。此外，也有用反相和正相色譜，同時檢測多種糖皮質(zhì)激素。最低檢出限一般可達10ug/kg。雖然該方法的靈敏度可以基本達到獸藥殘留檢測要求，但僅適用于部分化合物，同時不能進行定性確認。氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS):在激素的殘留檢測確認技術(shù)中，氣相色譜(GC)與質(zhì)譜(MS)的串聯(lián)技術(shù)是最常選用的技術(shù)。從上世紀90年代以后，絕大多數(shù)歐盟參考實驗室都引入了GC-MS方法，用于監(jiān)控畜禽產(chǎn)品中類固醇激素殘留。該技術(shù)集中了氣相色譜高的色譜分辨率和質(zhì)譜技術(shù)的特異性、選擇性。由于激素類物質(zhì)的揮發(fā)性不夠，因此，在選擇用GC-MS分析激素類物質(zhì)時，也必須進行衍生化處理。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS):液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)，或多級聯(lián)用技術(shù)(LC-MS-MS)其檢測靈敏度高，能對各糖皮質(zhì)激素微量殘留進行檢測，是目前檢測食品中糖皮質(zhì)激素殘留確證檢測的最佳方法之一。氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)都要求對樣品進行衍生化處理，樣品的前處理相對比較麻煩，而液相色譜技術(shù)對化合物的定性確認又比較困難。液相色譜_質(zhì)譜技術(shù)，不需要樣品衍生化，而且能夠定性確認，這已經(jīng)成為分析糖皮質(zhì)激素的主要手段。其檢測限可達0.5ug/L。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)或多級聯(lián)用技術(shù)如LC-MS-MS，其設(shè)備要求高，技術(shù)難度大，對技術(shù)人員要求高。本發(fā)明試劑盒利用酶聯(lián)免疫測定原理，定量檢測動物組織，血液，膽汁，尿液中的地塞米松殘留。用該試劑盒測定不需要昂貴的儀器投入，一般中等文化水平的人員，經(jīng)過短期培訓(xùn)，就可掌握其檢測方法。該試劑盒檢測多種樣品中的地塞米松，其線性范圍為0.lng/ml20ng/ml，最低檢測限可達0.lng/ml?？蓾M足食品中地塞米松殘留的快速監(jiān)測。為食品中地塞米松殘留，提供了一種高效，快速，特異的檢測方法
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種快速檢測地塞米松的酶聯(lián)免疫試劑盒。其生產(chǎn)的地塞米松試劑盒，線性范圍為0.lng/ml20ng/ml，IC5。為34ng/ml左右，靈敏度為0.lng/ml。穩(wěn)定期在6個月以上(4t:冰箱保存)。本發(fā)明公開免疫原的合成，動物的免疫，特異性抗體的制備，試劑盒的調(diào)試和裝配，試劑盒各種參數(shù)的確定及樣品的前處理和測定。地塞米松，化學(xué)名9a-氟-lie，17a，21-三羥基-16a-甲基孕甾-l，4-二烯-3，20-二酮。英文dexamethasone，縮寫為Dex，分子量392.45，為小分子物質(zhì)，不具有免疫原性而僅具有免疫反應(yīng)性，要生產(chǎn)地塞米松的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，必須要制備對地塞米松有高度特異性的抗體。要獲得對地塞米松有高度特異性的抗體，首要條件是要有一個能激發(fā)動物產(chǎn)生抗體的抗原。因此，免疫原的制備最為重要。其解決的方案是地塞米松共價連接上一個大分子物質(zhì)，通常是與一種蛋白質(zhì)交聯(lián)。常用的有牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲狀腺球蛋白，大鑰匙孔狀槭血藍蛋白等，本發(fā)明公開一種制備地塞米松免疫原的方法。首先用一羥胺化合物，羧甲基羥胺，修飾地塞米松，生成地塞米松_3-羧甲基肟，Dex-3-CM0，后者與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)，用二環(huán)己碳二亞胺(DCC)或水溶性碳二亞胺{1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺，N-Ethyl-N'-(3-dimethylami,ropyl)carbodiimide，EDAC;1-環(huán)己_3_(2_瑪啉-4-乙基)碳二亞胺對甲基苯亞磺酸鹽N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate，，CMEC}催化，使之活化，然后與載體蛋白分子中游離胺基相連，生成免疫原。有了免疫原，第二步就是用免疫原免疫動物，本發(fā)明是免疫1.52kg大小的新西蘭雌性家兔，獲得對地塞米松有特異性反應(yīng)的多克隆抗體。本發(fā)明提供一種能產(chǎn)生高滴度抗體的免疫方案。為了檢測特異性抗體，建立直接競爭酶聯(lián)免疫測定，必須合成地塞米松與一種酶交聯(lián)的抗原_酶交聯(lián)物(酶標抗原)，交聯(lián)的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，P_半乳糖苷酶等。本發(fā)明公開一種合成地塞米松與酶交聯(lián)的方法，是用活化的Dex-3-CM0與酶交聯(lián)，以制備酶標抗原。在以上基礎(chǔ)上，組裝檢測試劑盒。用聚苯乙烯96孔或48孔酶標板，包被二抗。(選用羊抗兔抗體，有商品供給。一般選用效價高，效價在l:10002000，穩(wěn)定性好的二抗。)。優(yōu)化包被濃度，抗體濃度，酶標抗原濃度，使之達到檢測要求。本發(fā)明提供組成試劑盒相關(guān)試劑的配制和組裝流程(1)用選購的二抗包被酶標板。(2)孵育后洗滌去未吸附上的多余二抗。(3)用另一種蛋白封閉板上未吸附二抗的多余位點，以減少測定時的非特異性吸附。(4)提供地塞米松抗體和酶標抗原濃縮液。(5)提供抗體和酶標抗原應(yīng)用稀釋液。(6)提供濃縮洗滌液(7)提供地塞米松的標準液，用樣品制備液配制7個標準0ng/m1，0.lng/m1，0.5ng/ml，1.0ng/ml，5.Ong/ml，10.0ng/ml，20.Ong/ml(8)提供酶顯色緩沖溶液和酶反應(yīng)底物液，本試4劑盒所用的酶反應(yīng)底物為H202和四甲基聯(lián)苯胺(TMP)，H202配于顯色緩沖溶液中，四甲基聯(lián)苯胺(TMP)單獨配制。(8)提供酶反應(yīng)終止液，終止液為2M硫酸。(9)提供樣品制備液。為配制地塞米松標準和測定時樣品的制備。以上試劑均放4°C冰箱保存。應(yīng)用本試劑盒檢測去甲睪酮的檢測步驟(1)按照測定樣品數(shù)和制作標準曲線所需孔數(shù)(每樣品和標準均作二個孔)，從冰箱取出所需用的孔條，放置使溫度平衡至室溫(25°C)。(2)將地塞米松抗體濃縮液用抗體稀釋液按1:100稀釋后，每孔加100iU，加蓋，室溫放置30分鐘。(3)將濃縮洗滌液用雙蒸餾水按1:9稀釋后，作為洗滌液，倒去孔中抗體液，用洗滌液洗滌3次，每次每孔250，每次加洗滌液后，靜置3分鐘，倒掉，甩干，再進行下一次洗滌。最后一次洗滌，盡量甩干。(4)各孔加入標準或樣品，各標準和樣品各加2孔，每孔加50ill，將酶標抗原濃縮液，用抗體稀釋液按i:100稀釋后，每孔加50ia，另取2孔，加o標準50ia和抗體稀釋液50iU作為空白孔，稍平行振蕩酶標板，混勻各孔中液體。加蓋，室溫放置30分鐘。[OO27](5)同(3)洗滌各孔，最后甩干。(6)各孔加顯色液100ii1，顯色液由顯色緩沖液與TMB液，以10:1配制。加入后加蓋，室溫暗處避光放置15分鐘。(7)每孔加終止液50ii1，混勻，于30分鐘內(nèi)，用酶標儀，在波長450nm下，測定其光密度。用各孔的0D45。減去空白孔的0D45。，得各孔的實際測定值。求出二平行孔的平均值，得各標準或樣品的測定值。按照下式求出各標準和樣品的抑制率各標準或樣品的抑制率％=(各標準或樣品的測定值/0標準的測定值)X100%用各標準濃度的對數(shù)值為X，其相應(yīng)的抑制率為Y，在坐標軸上作圖，得地塞米松濃度的半對數(shù)坐標標準曲線，在標準曲線上，找出樣品抑制率相對應(yīng)的X軸上的點，就可計算出樣品中地塞米松的濃度?；蚶肊LISA計算的相關(guān)軟件，只需輸入測定值，立即就可得出結(jié)果。本試劑盒所用的檢測方法，屬直接競爭酶聯(lián)免疫測定方法。96孔酶標板已預(yù)先包被了二抗，加入地塞米松的特異性抗體，此抗體與二抗結(jié)合后，固定在酶標板上。然后，加入標準抗原(Dex)或含有地塞米松的樣品，和酶標-地塞米松，標準或樣品中地塞米松與酶標-地塞米松，共同競爭與地塞米松抗體結(jié)合，經(jīng)孵育后，洗滌去未結(jié)合的酶標地塞米松，顯色測定。測定值與標準或樣品中地塞米松量的對數(shù)值呈反比，以此達到定量測定地塞米松的目的。圖例說明圖1載體蛋白BSA，免疫原地塞米松_BSA，地塞米松三者紫外掃描圖。圖2用制備的試劑盒測定，所得的地塞米松標準曲線圖以下具體實施例子，可進一步了解本發(fā)明。此處僅提供一種優(yōu)選方法，但對本發(fā)明5的內(nèi)容和權(quán)利要求不構(gòu)成任何限制。實施例1主要試劑和主要儀器1.1試劑地塞米松(購自Sigma)，羧甲基羥胺(Sigma)，吡啶；N_羥基丁二酰亞胺(NHS);N，N-二甲基甲酰胺(DMF);二環(huán)己碳二亞胺(DCC);(均購自國藥上?；瘜W(xué)試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA);卵清蛋白(OVA);四甲基聯(lián)苯胺(TMP);(購自華美生物工程公司，進口分裝產(chǎn)品)。辣根過氧化物酶(R.Z>3)(上海麗珠東風生物技術(shù)有限公司).羊抗兔多抗(上?？党缮锟萍脊举彽?.S印hadexG-25(Sigma)，其余均為分析純試劑.1.2主要儀器精密分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，Sartorius，BS124s，d=O.OOOlg);帶掃描PC紫外-可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)；高速臺式離心機(上海安亭實驗儀器廠)；酶標儀，P型可調(diào)移液器一套(熱電上海公司)；SZ_97自動三重水純水蒸餾(上海本波儀器有限公司)以及其他實驗室常用儀器.實施例2地塞米松免疫原和酶標抗原的合成2.1地塞米松-3-羧甲基肟，Dex-3-CM0，的合成稱取Dex118mg(0.3薩o1)溶于2ml無水妣啶，攪拌下，加入45mg(0.45,1)羧甲基羥胺，室溫攪拌24小時，最后，減壓抽干吡啶，得黃色油狀物。加2ml乙酸乙酯溶解，用蒸餾水洗三次，用分離出有機相，無水硫酸鈉干燥。加熱減壓去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。此為地塞米松-3-羧甲基肟，得約53mg。取少量，溶解于O.lmlDMF，用TLC鑒定。薄層層析中，Dex-3-CM0的Rf為0.2。接近原點.Dex則離開原點，隨層析液前移.Rf約0.852.2免疫原的制備地塞米松_牛血清白蛋白的合成取上制備的地塞米松-3-羧甲基肟40mg，溶于DMF液2.5ml，加入25mgDCC(約0.23mmol)，4。C攪拌下，加入NHS18mg(約0.15mmo1)，避光4。C攪拌過夜.次日，離心去沉淀.取上清為活化的Dex-3-CMO.稱取300mg牛血清白蛋白，加7.5mlpH89的蒸餾水和7.5mlDMF溶解，4。C攪拌下，加入上活化的Dex-3-CM01.8ml.4"攪拌過夜.次日，取出用O.01MPBS(pH7.5透析3日.每天換2次透析液.透析后，定蛋白濃度，并用uv掃描鑒定，計算交聯(lián)率.此法交聯(lián)率一般在此15左右.此為地塞米松-牛血清白蛋白(Dex-BSA)，作為免疫原。圖1為牛血清白蛋白(BSA)，地塞米松-BSA和地塞米松紫外掃描圖。2.3酶標抗原的合成地塞米松_辣根過氧化物酶(Dex-HRP)的合成稱取HRP10mg力B500ylpH89的蒸餾水和500y1DMF溶解，4。C攪拌下，加入活化的Dex-CMO100y1.4t:攪拌過夜.次日，取出用0.01MPBS(pH7.5)透析3日.每天換2次透析液.透析后，過S印hadexG25柱，收集有色峰.為Dex-HRP.實施例3地塞米松多克隆抗體的生產(chǎn)用3只新西蘭長耳雌兔，每只免4次.首次用Dex-BSA配成lmg/ml濃度，取3ml，加3ml弗氏完全佐劑，充分乳化后.每只兔用2ml(即lmg免疫原)背部，多點皮下注射為首次免疫.以后分別在第21天，51天，91天再免疫3次.第21天，51天，用3mllmg/ml濃度的免疫原，加3ml弗氏不完全佐劑乳化，每只兔用lml，于臀部肌肉二側(cè)注射.第51天免疫后10天，采血檢查抗體產(chǎn)生情況.第91天，免疫原用0.9%氯化鈉液配成0.5mg/ml溶液，每只免從耳靜脈注射lml免疫原.此次后，第IO天，就可從兔耳靜脈或心臟收獲血液.收集血液讓其自然凝結(jié).離心收集血清，此為抗Dex的抗血清.按照此免疫方案，一般都能收獲高滴度的抗血清.用二抗包被酶標板，利用合成的Dex-HRP，測定抗血清效價.下為測定結(jié)果稀釋倍數(shù)1!40001:80001:160001:320001:640001:1280001:2360001:472000抗血清0D4503.3082.9842.6122.0231.6310.7870.4200.213陰性血清0D4500.1310.1080.0570.0320.0120.0050.0010.001可見，生產(chǎn)抗血清效價達20萬.用則可按1:150001:30000稀釋用.實施例4優(yōu)化試劑盒組成，確定各試劑最終濃度用方陣法確定包被二抗，Dex多抗，Dex-HRP三者的最佳濃度。4.1包被酶標板二抗配成2mg/ml濃度，用0.OIM碳酸鹽緩沖溶液(pH9.6)按i:iooo(ioooiii緩沖液加iiii二抗)稀釋后，每孔加iooiii，加蓋，放入4t:冰箱過夜。次日用洗滌液洗3次，最后一次甩干后，每孔加200ia封閉液，封閉液為含2X卵清蛋白的O.OIM碳酸鹽緩沖溶液(pH9.6)。加入后，加蓋，放入4t:冰箱過夜。次日用洗滌液洗3次，最后一次甩干后，將酶標板放入37t:烘箱30分鐘，烘干。取出后用鋁箔真空包裝。4.2配抗體濃縮液以制備Dex多抗，1:2500稀釋(用抗體保存液)。測定時用抗體稀釋液按i:ioo稀釋應(yīng)用。4.3配Dex-HRP濃縮液合成的Dex-HRP，用酶保存液，按1:10稀釋。測定時用抗體稀釋液按l:ioo稀釋應(yīng)用。4.4配濃縮洗滌液0。5MPBS液(pH7.2)+0.5%體積的Tween-20為洗滌液。用時用蒸餾水或去離子水按l:9稀釋用。4.5配抗體稀釋液為0.1MPBS(pH7.2)加0.1%明膠。4.6配樣品配制液為0.1MPBS(pH7.2)力Q0.1%水楊酸鈉加0.05%吐溫-20。4.7配制Dex標準用樣品配制液配。共配制7個標準0ng/m1，0.lng/m1，0.5ng/ml，1.Ong/ml，5.Ong/ml，10.Ong/ml，20.Ong/ml。4.8配制顯色液顯色液由二部份組成，一是"顯色緩沖液"，另一是"TMB"液。顯色緩沖液:Na2HP041.84g+檸檬酸0.47g+H20100ml+30%H20250ii1，TMB液用95%的乙醇或用二甲亞砜配成lmg/ml濃度。4.9配終止液2M硫酸。濃硫酸按1:8用水稀釋則可。4.10試劑盒組成(1)已包被二抗的96孔或48孔酶標板(真空鋁箔包裝)(2)地塞米松(Dex)標準(共7個):Ong/ml，0.lng/ml，0.5ng/ml，1.Ong/ml，5.0ng/ml，10.0ng/ml，20.Ong/ml(3)Dex抗體濃縮液(用時按1:100稀釋應(yīng)用)(4)Dex-HRP濃縮液(用時按1:100稀釋應(yīng)用)(5)抗體稀釋液(6)顯色緩沖液(7)TMB液(8)終止液。(9)10X洗滌液(10)樣品制備液。實施5樣品處理和測定5.l測定樣品的處理尿樣2ml新鮮尿液加2ml0.1M醋酸鹽緩沖溶液(pH4.8)，加40蝸牛酶液，6ml蒸餾水，37t:保溫4小時。酶解。然后，沸水浴加熱5分鐘。離心，取上清lml加4ml預(yù)先用水平衡的三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合抽提10分鐘。離心，取下有機相2ml，N2氣吹干，殘渣加200y1樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合。室溫平衡30分鐘，作樣品測定液。脂肪，腎脂肪樣品:10g腎脂肪，在微波爐中加熱熔化(低火360W，23分鐘)。取lg于玻璃勻漿器中，加5.Oml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心，取下層lml三氯甲烷液，通風櫥中，用N2吹干，加200樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合，抽提15分鐘，為測定樣品液。肌肉，香腸10g加10ml含O.1%水楊酸鈉的0.15M，氯化鈉液，勻漿，沸水浴加熱5分鐘，離心，取1/10體積上清，加5ml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心，取下層三氯烷lml，用N2吹干，加200ill樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合抽提15分鐘，為測定樣品液。飼料10g力B10ml含0.1%水楊酸鈉的0.15M氯化鈉液，勻漿，沸水浴加熱5分鐘，取1/10體積上清，加5ml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心取下層三氯甲烷lml，用N2吹干，加2001樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合抽提15分鐘，為測定樣品液。飲料(包括牛奶，茶，咖啡等)取5ml飲料，沸水浴加熱5分鐘，離心上清lml，加5ml三氯甲烷，旋轉(zhuǎn)混合，抽提5分鐘。離心取下層三氯甲烷lml，用N2吹干，加2001樣品制備液，旋轉(zhuǎn)混合抽提15分鐘，為測定樣品液。尿樣品稀釋系數(shù)均為2。其余為1。5.2樣品和標準液的測定按照說明書第6，7頁所述的檢測步驟，用組裝好的試劑盒進行測定。測定所得標準品數(shù)椐如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>所繪的標準曲線如圖2所示。IC5。二2.779ng/ml實施6試劑盒各參數(shù)的測定試劑盒的特異性及交叉反應(yīng)地塞米松100%氟美松80%倍他米松30%孕酮<2%氫化可的松<1%用lng/ml標準做24個孔，重復(fù)測定。計算"板內(nèi)變異"CV=3.8%"板間變異"<15%。"靈敏度"為0.lng/ml。精確度用肝組織做添加試驗，分別添加0.lng/ml，0.5ng/ml，lng/ml，其回收率別是71%，85%，及89%分試劑盒穩(wěn)定性S(ng/ml)00.10.511002.0251.8141.5271.3560.70537度一周2.0051.7641.4811.290.68937度二周1.8821.5271.2891.1020.547837度三周1.6011.2110.9120.7750.298熱穩(wěn)定性試驗，37度3周保存，相當于4度保存7.4個月?？梢娫噭┖械姆€(wěn)定期在半年以上。權(quán)利要求本發(fā)明公開一種測定地塞米松的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒。其特征包括免疫原的制備，酶標抗原的制備，抗體制備和試劑盒各組份的配制及酶標板的包被。2.根據(jù)權(quán)利l所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，合成地塞米松免疫原的方法。用地塞米松溶于無水吡啶，攪拌下，加入羧甲基羥胺，地塞米松與羧甲基羥胺的摩爾比為`1:1.52左右，室溫攪拌24小時后，減壓抽干吡啶，得黃色油狀物。加乙酸乙酯溶解，用蒸餾水洗三次，分離出有機相。加熱減壓去乙酸乙酯近干，加3ml乙醚，置冰箱，得白色沉淀。為地塞米松-3-羧甲基肟，再與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)，用二環(huán)己碳二亞胺(DCC)或水溶性碳二亞胺{1-乙基_3-(3-二甲氨丙基)-碳二亞胺；1-環(huán)己-3-(2-瑪啉-4-乙基)碳二亞胺_對甲基苯亞磺酸鹽}催化，得地塞米松_3-羧甲基肟活化物，該活化物與載體蛋白在堿性條件下，與載體蛋白上氨基相聯(lián)，為地塞米松的免疫原。載體蛋白如牛血清白蛋白，卵清蛋白，甲狀腺球蛋白，大鑰匙孔狀槭血藍蛋白。3.根據(jù)權(quán)利l-2所述，其特在于，合成一種酶標抗原的方法用地塞米松-3-羧甲基肟活化物，在堿性條件下與酶相聯(lián)，其酶可為辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，P-半乳糖苷酶。4.根據(jù)權(quán)利l所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，試劑盒溶液的優(yōu)化配制標準溶液和樣品的配制，是用含O.1%0.5%水楊酸鈉和0.05%0.1%吐溫_20的O.10.01M的磷酸鹽緩沖溶液?？贵w稀釋液用含0.10.5%明膠的0.1`0.OIM磷酸鹽緩沖溶液。顯色液為二組份，其中，一組份為顯色緩沖液，由磷酸氫二鈉和檸檬酸組成，每毫升含0.20.5iU30%H202;另一組份為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液。TMB液用95%乙醇或二甲亞砜配制成lmg/ml濃度。5.根據(jù)權(quán)利1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，用采用羊抗兔抗體(二抗)包被96或48孔酶標板。用2%卵清蛋白液封閉孔中未吸附二抗的部位。6.—種用直接競爭酶聯(lián)免疫測定，測定各種樣品中地塞米松的方法。其特征在于(1)樣品的前處理方法。用溶劑抽提方法，大大簡化了測定過程。(2)用權(quán)利l-5所述工藝組裝的試劑盒測定，檢測過程為用包被有羊抗兔抗體的酶標板，加入地塞米松抗體，孵育后洗滌甩干，加入標準或樣品溶液和酶標抗原(地塞米松_辣根過氧化物酶)，孵育后洗滌甩干，加顯色劑顯色，終止，測定。標準或樣品地塞米松濃度的對數(shù)值與0045。值呈反比。以此達到定量測定地塞米松的目的。此直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒，檢測范圍為0.120ng/ml，靈敏度可達0.lng/ml。全文摘要本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。公開一種檢測地塞米松的直接競爭酶聯(lián)免疫測定試劑盒。本發(fā)明提供地塞米松抗原合成方案，首先用地塞米松合成地塞米松-3-羧甲基肟，后者在碳二亞胺催化下，用N-羥基丁二酰亞胺活化，與牛血清白蛋白結(jié)合，合成免疫原；與辣根過氧化物酶結(jié)合，合成酶標抗原。用免疫原，免疫新西蘭大白兔，獲得地塞米松多抗。測定時，用羊抗兔多抗(二抗)包被酶標板，二抗與地塞米松多抗結(jié)合，洗滌后加入樣品或標準和酶標抗原，顯色測定，就可得出結(jié)果。本發(fā)明試劑盒中配制的各試劑，使用方便。這為食品安全，藥物檢測中，地塞米松的檢測，提供一個快速，特異，靈敏的檢測方法。文檔編號G01N33/543GK101769922SQ200810204940公開日2010年7月7日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者徐基芳,王文卓,王武康申請人:王武康