專利名稱：固定scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器及制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理，具體地說(shuō)是在大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠整體材 料基質(zhì)上固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)，制備一種新型的蛋白質(zhì)均衡器，用其處理復(fù)雜的 蛋白質(zhì)樣品，通過(guò)降低樣品中高低豐度蛋白質(zhì)的濃度差異，更好地對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)均衡器技術(shù)是一種有效地樣品預(yù)處理手段，通過(guò)降低樣品中高低豐度蛋白 質(zhì)濃度差異，富集低豐度蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)目，從而在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了廣 泛地應(yīng)用。與膜去除法相比，蛋白質(zhì)均衡器技術(shù)特異性更好；與染料配體去除和特異抗體去 除法相比，蛋白質(zhì)均衡器技術(shù)應(yīng)用范圍更廣；與液相、等電聚焦分級(jí)預(yù)處理方法相比，蛋白 質(zhì)均衡器技術(shù)操作更簡(jiǎn)便、快捷。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)均衡器技術(shù)是將合成的六肽庫(kù)鍵合于硅球表面，用于處理復(fù)雜的蛋 白質(zhì)樣品，發(fā)現(xiàn)未知蛋白質(zhì)。由于隨機(jī)合成的六肽庫(kù)中含有大量不同的六肽片段，致使樣 品中很多蛋白質(zhì)都能找到與之特異親和的六肽配體。樣品經(jīng)肽庫(kù)硅球均衡器處理后，很多 與六肽配體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)被保留在硅球表面，通過(guò)洗脫劑將其洗脫下來(lái)用于質(zhì)譜或二 維電泳的分析檢測(cè)。通過(guò)肽庫(kù)硅球均衡器技術(shù)可以有效地減少蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)濃度范圍，富 集低豐度蛋白質(zhì)，使更多低豐度蛋白質(zhì)得以檢測(cè)。Castagna等人曾用肽庫(kù)硅球均衡器技術(shù) 和質(zhì)譜檢測(cè)對(duì)人尿蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究，處理前后的人尿樣品分別檢測(cè)到134和383個(gè)蛋 白質(zhì)，證明肽庫(kù)硅球均衡器技術(shù)對(duì)提高蛋白質(zhì)檢出率有很大幫助(CaStagna，A. ；Cecconi, D. ；Sennels, L. ；Rappsilber, J. ；Guerrier, L. ；Fortis, F. ；Boschetti, E. ；Lomas, L.； Righetti, P. G. J. ProteomeRes. 2005,4(6)，1917-1930)。最近，Sennels 等人也用肽庫(kù)硅 球均衡器技術(shù)和LC-SELDI-TOF MS/MS檢測(cè)方法對(duì)人血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究，處理 后的人血清樣品共檢測(cè)出1559個(gè)蛋白質(zhì)，比之前有顯著提高(Sermels，L. ；Salek, M.； Lomas, L. ；Boschetti, E. ；Righetti, P. G. ；Rappsilber, J. J. ProteomeRes. 2007,6(10), 4055-4062)。此外，Carina等人也證明了肽庫(kù)硅球均衡器技術(shù)可以有效地用于低豐度蛋白 質(zhì)的檢測(cè)(Carina Sihlbom ；Ida Kanmert ；HeIena von Bahr ；Pia Davidsson. J. Proteome Res. 2008,7(9) ,4191-4198)。盡管蛋白質(zhì)均衡器技術(shù)已經(jīng)被越來(lái)越多地用于樣品蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，但是它仍 然存在某些不足之處，比如非特異結(jié)合和由于缺少適當(dāng)?shù)牧呐潴w導(dǎo)致的蛋白質(zhì)損失等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器及制 備和應(yīng)用，以減少?gòu)?fù)雜樣品中高低豐度蛋白質(zhì)的濃度差異，在低豐度蛋白質(zhì)富集的同時(shí)實(shí) 現(xiàn)對(duì)高豐度蛋白質(zhì)的去除。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
—種固定scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器，于聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料表面化學(xué)鍵合有M13噬菌體展示scFv文庫(kù)。所述聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料為30-100 μ m的大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠整體 材料；每mL冷凝膠整體材料表面鍵合1 X IO10-I X IO13個(gè)M13噬菌體。所述蛋白質(zhì)均衡器的制備方法30_100 μ m的大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料 載體經(jīng)活化后，將Ml3噬菌體展示scFv文庫(kù)鍵合于其表面，每mL冷凝膠整體材料表面鍵合 1 X IO10-I X IO13個(gè)M13噬菌體，制備成固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器。所述載體表面活化的過(guò)程為，先以過(guò)量的0. 5M己二胺通入聚丙烯酰胺冷凝膠整 體材料、活化聚丙烯酰胺基質(zhì)；再通入過(guò)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的戊二醛反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3-20小 時(shí)；所述將M13噬菌體展示scFv文庫(kù)鍵合于載體表面的過(guò)程為，于聚丙烯酰胺冷凝膠 整體材料中通入含有M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的磷酸鹽緩沖液，PH范圍7. 4 7. 6，磷酸 鹽的鹽濃度為25 30mM，鍵合反應(yīng)溫度為20_30°C，反應(yīng)時(shí)間12-24小時(shí)，每mL磷酸鹽緩 沖液中含有1 X IO10-I X IO13個(gè)M13噬菌體。所述均衡器可用于蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理，降低高豐度蛋白質(zhì)的濃度并對(duì)低豐度蛋白 質(zhì)進(jìn)行富集，降低樣品復(fù)雜程度，提高蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)目?？蓪⒌鞍踪|(zhì)平衡器裝入5mL體積的層析柱中或涂覆在玻璃板上進(jìn)行應(yīng)用。利用固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器處理蛋白質(zhì)樣品時(shí)，所采用的 洗脫過(guò)程為，以 1-2M NaCL、25-100mM pH2_3 的 Gly-HCL 緩沖液和 0. 01-0. 05unit/ μ L 的凝 血酶溶液進(jìn)行三步洗脫，即利用高鹽、低PH和生物活性酶三種不同類型洗脫試劑的結(jié)合， 實(shí)現(xiàn)柱上結(jié)合蛋白質(zhì)的完全洗脫。本發(fā)明選用Μ13噬菌體展示scFv文庫(kù)作為處理生物樣品的配基，文庫(kù)中包含 IO6-IO8個(gè)展示不同scFv片段的噬菌體，噬菌體固定后每一不同的scFv片段約有IO4-IO6個(gè) 相同拷貝；作為配基的噬菌體展示文庫(kù)選用M13絲狀噬菌體作為展示外源片段的載體，其 單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)具有與抗體相似的特異性和結(jié)合能力，能夠與相應(yīng)受體特異 識(shí)別并結(jié)合。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為1. M13噬菌體展示scFv文庫(kù)庫(kù)容較大，約含IO6個(gè)展示不同scFv片段的M13噬菌 體。并且scFv特異性高、結(jié)合能力強(qiáng)，能夠更廣泛有效地富集低豐度蛋白質(zhì)，減少?gòu)?fù)雜樣品 中高低豐度蛋白質(zhì)的濃度差異。2.配基來(lái)源方便，M13噬菌體展示scFv文庫(kù)能夠進(jìn)行擴(kuò)增，從而滿足大量鍵合的需要。3.上樣體積小，一般只需200μ g樣品即可，適用于珍稀蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理。4.無(wú)論流出液還是洗脫液均被收集用于后續(xù)分析，沒(méi)有人為的樣品損失，能夠更 全面地進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。5.固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器不僅能夠減少蛋白質(zhì)濃度差異， 富集低豐度蛋白質(zhì)，還能有效去除樣品中的高豐度蛋白質(zhì)，從而得到更好的預(yù)處理效果。


圖1噬菌體配基在聚丙烯酰胺冷凝膠表面鍵合反應(yīng)示意圖。圖2聚丙烯酰胺冷凝膠的掃描電鏡結(jié)果。圖3經(jīng)蛋白質(zhì)均衡器處理收集的人血清PBS流出液SDS-PAGE結(jié)果。1 分子量Marker (97、66、43、31、20和14kDa) ；2 未鍵合噬菌體文庫(kù)的空白聚丙烯酰胺冷凝膠處理過(guò)的人血清PBS流出液；3 蛋白質(zhì)均衡器處理過(guò)的人血清PBS流出液； 4:未處理的人血清樣品。圖4經(jīng)蛋白質(zhì)均衡器處理收集的腎病患者尿蛋白PBS流出液SDS-PAGE結(jié)果。1 分子量Marker (97、66、43、31、20和14kDa) ；2 未鍵合噬菌體文庫(kù)的空白聚丙 烯酰胺冷凝膠處理過(guò)的腎病患者尿蛋白PBS流出液；3 蛋白質(zhì)均衡器處理過(guò)的腎病患者尿 蛋白PBS流出液；4 未處理的腎病患者尿蛋白樣品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料為基質(zhì)，經(jīng)戊二醛活化后固定上M13噬菌體 展示的scFv文庫(kù)(市購(gòu))，制備得到固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器，并用 其對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。具體為1)M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的擴(kuò)增(按常規(guī)方法進(jìn)行)5 μ L Μ13噬菌體展示 scFv文庫(kù)(1 lOXlOnpfu/mL)禾Π IyL牛凝血酶(1 5unit/yL)在94 μ L無(wú)菌水中 混合，37°C溫育1小時(shí)后在M13K07輔助噬菌體的幫助下，轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM109，然后在含有 lOOyg/mL氨芐青霉素和50 μ g/mL卡那青霉素的2 X TY培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。得到的噬菌體 溶液再用0. 2體積的聚乙二醇(PEG)/氯化鈉(NaCL)溶液(20%w/v PEG 8000,2. 5M NaCL) 進(jìn)行純化。2)固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器的制備5_10mL體積的聚丙烯 酰胺冷凝膠整體材料經(jīng)0. 5M己二胺和質(zhì)量百分比5%的戊二醛活化后與噬菌體分子上的 氨基進(jìn)行鍵合反應(yīng)，制備得到固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器，M13噬菌體 的鍵合量為1 2X IO12個(gè)/mL聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料。該蛋白質(zhì)均衡器不使用時(shí)，用 含質(zhì)量濃度0. 01% NaN3的1 XPBS保護(hù)液保護(hù)起來(lái)，于1 10°C儲(chǔ)存待用。3)蛋白質(zhì)均衡器用于樣品的預(yù)處理0. 1 0. 2mg/mL樣品2mL上樣后室溫放置30 分鐘，再依次用10倍體積的1XPBS、2M NaCl、50mM pH2. 5的Gly-HCL緩沖液和0. Olunit/ μ L的凝血酶溶液進(jìn)行洗脫，餾分收集后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。實(shí)施例1制備固定Μ13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器用于人血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。1)M13噬菌體展示的scFv文庫(kù)在聚丙烯酰胺冷凝膠表面的鍵合反應(yīng)如圖1所示， 具體步驟如下純化的M13噬菌體展示scFv文庫(kù)溶解于IXPBS (pH7. 4)中用于鍵合反應(yīng)， 如圖2所示的5mL大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠以10倍體積0. IMNa2CO3沖洗，配制0. 5M己二 胺通入凝膠中，室溫反應(yīng)4小時(shí)后水洗至中性。以10倍體積1 XPBS沖洗后與質(zhì)量濃度5% 戊二醛室溫反應(yīng)5小時(shí)。再次用IXPBS沖洗，循環(huán)通入純化的IOmL濃度為7. 8X 101 Ipfu/ mL的噬菌體，室溫過(guò)夜反應(yīng)，即制備得到固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器，最終噬菌體的鍵合總量為5. 2 X IO12個(gè)。2)蛋白質(zhì)均衡器用于人血清樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)研究0. 2mg/mL人血清2mL上樣 后室溫放置30分鐘，然后依次用50mL的1XPBS、2M NaCl和50mM pH2. 5的Gly-HCl緩沖 液進(jìn)行沖洗，最后將5mL 0. Olimit/μ L的凝血酶溶液通入均衡器中37。C反應(yīng)1小時(shí)，再用 IXPBS進(jìn)行沖洗。對(duì)收集的PBS流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖3所示蛋白質(zhì)均衡器處理后的血 清樣品中高低豐度蛋白質(zhì)濃度差異顯著減少，而未處理的和空白聚丙烯酰胺冷凝膠對(duì)照柱 處理的血清樣品高低豐度蛋白質(zhì)濃度差異顯著。對(duì)上述各個(gè)餾分收集后進(jìn)行μ RPLC-MS/MS 分析，檢測(cè)結(jié)果如表1所示未經(jīng)蛋白質(zhì)均衡器處理的人血清樣品鑒定出151個(gè)蛋白質(zhì)。而 處理過(guò)的人血清樣品蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目為430個(gè)，比處理前提高了約2倍。以上結(jié)果表明，固 定噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器能夠有效減少人血清樣品中蛋白質(zhì)的濃度差異， 富集低豐度蛋白質(zhì)，從而顯著提高蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)目。表1蛋白質(zhì)均衡器處理前后的人血清樣品μ RPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果。 實(shí)施例2制備固定M13噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器用于腎病患者尿蛋白的研究。固定噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器的制備及樣品預(yù)處理方法同實(shí)施例1， 與實(shí)施例1不同之處在于，蛋白質(zhì)均衡器用于腎病患者尿蛋白組學(xué)研究尿蛋白上樣。對(duì)收 集的腎病患者尿蛋白PBS流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖4所示蛋白質(zhì)均衡器處理后的 腎病患者尿蛋白樣品中高低豐度蛋白質(zhì)濃度差異顯著減少，而未處理的和空白聚丙烯酰胺 冷凝膠對(duì)照柱處理的尿蛋白樣品高低豐度蛋白質(zhì)濃度差異顯著。對(duì)腎病患者尿蛋白的PBS 流出液、NaCL洗脫液、Gly-HCL洗脫液和凝血酶酶解液四種餾分進(jìn)行μ RPLC-MS/MS分析， 檢測(cè)結(jié)果如表2所示未經(jīng)蛋白質(zhì)均衡器處理的腎病患者尿蛋白樣品鑒定出142個(gè)蛋白質(zhì)。 而處理過(guò)的樣品中蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目為396個(gè)，比處理前提高了約2倍。以上結(jié)果同樣表明， 固定噬菌體展示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器能夠有效減少高低豐度蛋白質(zhì)的濃度差異，提 高蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)量，從而更好地進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。表2蛋白質(zhì)均衡器處理前后的腎病患者尿蛋白μ RPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果。 未處理藥蛋白質(zhì)均衡器處理后的腎病患者尿蛋白
腎病患者 PBS流出 NaCL洗 Gly-HCL 凝血酶酶總蛋白質(zhì)
「00441 本發(fā)明涉及一種固定scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器及制備和應(yīng)用，是以大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料為基質(zhì)，對(duì)其用戊二醛進(jìn)行活化后，固定上M13噬菌體展示的單鏈 抗體可變區(qū)(scFv)文庫(kù)，制備得到相應(yīng)的的蛋白質(zhì)均衡器。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法 簡(jiǎn)便，整體材料孔徑大、親水性好，易于進(jìn)行復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理，M13噬菌體展示的 scFv文庫(kù)能夠自我擴(kuò)增，配基來(lái)源方便充足。與固定六肽庫(kù)的硅球均衡器技術(shù)相比，樣品上 樣量小，蛋白質(zhì)損失少，M13噬菌體展示的scFv片段特異性高，結(jié)合能力強(qiáng)，使樣品中低豐 度蛋白質(zhì)富集的同時(shí)，有效去除高豐度蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
一種固定scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器，其特征在于于聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料表面化學(xué)鍵合有M13噬菌體展示scFv文庫(kù)。
2.按照權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)均衡器，其特征在于所述聚丙烯酰胺冷凝膠整體 材料為30-100 μ m的大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料；每mL冷凝膠整體材料表面鍵合 1 X IO10-I X IO13 個(gè) M13 噬菌體。
3.—種權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)均衡器的制備方法，其特征在于30-100μπι的大孔徑聚 丙烯酰胺冷凝膠整體材料載體經(jīng)活化后，將Μ13噬菌體展示scFv文庫(kù)鍵合于其表面，每mL 冷凝膠整體材料表面鍵合1 X IO10-I X IO13個(gè)Μ13噬菌體，制備成固定Μ13噬菌體展示scFv 文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器。
4.按照權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)均衡器的制備方法，其特征在于所述載體表面活化的 過(guò)程為，先以過(guò)量的0. 5M己二胺通入聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料、活化聚丙烯酰胺基質(zhì)； 再通入過(guò)量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的戊二醛反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3-20小時(shí)。
5.按照權(quán)利要求3所述蛋白質(zhì)均衡器的制備方法，其特征在于所述將M13噬菌體展 示scFv文庫(kù)鍵合于載體表面的過(guò)程為，于聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料中通入含有M13噬菌 體展示scFv文庫(kù)的磷酸鹽緩沖液，PH范圍7. 4 7. 6，磷酸鹽的鹽濃度為25 30mM，鍵合 反應(yīng)溫度為20-30°C，反應(yīng)時(shí)間12-24小時(shí)，每mL磷酸鹽緩沖液中含有1 X IO10-I X IO13個(gè) Ml3噬菌體。
6.一種權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)均衡器的應(yīng)用，其特征在于所述均衡器可用于蛋白質(zhì) 樣品預(yù)處理，降低高豐度蛋白質(zhì)的濃度并對(duì)低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行富集，降低樣品復(fù)雜程度，提 高蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)目。
7.按照權(quán)利要求6所述蛋白質(zhì)均衡器的應(yīng)用，其特征在于可將蛋白質(zhì)均衡器裝入5mL 體積的層析柱中或涂覆在玻璃板上進(jìn)行應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求6所述蛋白質(zhì)均衡器的應(yīng)用，其特征在于利用固定M13噬菌體展 示scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器處理蛋白質(zhì)樣品時(shí)，所采用的洗脫過(guò)程為，以1-2M NaCL, 25-100mM pH2_3的Gly-HCL緩沖液和0. 01-0. 05unit/ μ L的凝血酶溶液進(jìn)行三步洗脫，即 利用高鹽、低PH和生物活性酶三種不同類型洗脫試劑的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)柱上結(jié)合蛋白質(zhì)的完全 洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固定scFv文庫(kù)的蛋白質(zhì)均衡器及制備和應(yīng)用，是以大孔徑聚丙烯酰胺冷凝膠整體材料為基質(zhì)，對(duì)其用戊二醛進(jìn)行活化后，固定上M13噬菌體展示的單鏈抗體可變區(qū)(scFv)文庫(kù)，制備得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)均衡器。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法簡(jiǎn)便，整體材料孔徑大、親水性好，易于進(jìn)行復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理，M13噬菌體展示的scFv文庫(kù)能夠自我擴(kuò)增，配基來(lái)源方便充足。與固定六肽庫(kù)的硅球均衡器技術(shù)相比，樣品上樣量小，蛋白質(zhì)損失少，M13噬菌體展示的scFv片段特異性高，結(jié)合能力強(qiáng)，使樣品中低豐度蛋白質(zhì)富集的同時(shí)，有效去除高豐度蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N1/34GK101846687SQ20091001087
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者張麗華, 張玉奎, 張維冰, 梁振, 趙鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所