專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明設(shè)計(jì)一種免疫親和層析柱(IAC)的制備方法，特別是一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，屬于免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥是一類(lèi)模擬天然除蟲(chóng)菊酯化學(xué)結(jié)構(gòu)合成的高效低毒殺蟲(chóng)劑，多數(shù)品種對(duì)周?chē)窠?jīng)有影響，也能作用于中樞神經(jīng)。主要中毒表現(xiàn)為頭昏、惡心、全身不適、肌顫等。中毒較重者可有抽搐、肺水腫及意識(shí)障礙。嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)呼吸、循環(huán)衰竭。目前擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的檢測(cè)方法有薄層層析法，高效液相色譜法，酶聯(lián)免疫吸附法，放射免疫測(cè)定法等，這些檢測(cè)方法中大多需要樣品前處理，因此有必要研制性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠靈敏的免疫親和柱。目前免疫親和柱的制備方法大概有溴化氰法，過(guò)碘酸鈉法，蛋白A法等，免疫吸附劑主要是由惰性基質(zhì)和抗體組成的，惰性基質(zhì)是構(gòu)成IAC疏松空間的主要組分。通常，基質(zhì)需要具有一定的剛性，具有疏松的多孔結(jié)構(gòu)，要求顆粒均勻、大小一致，理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于活化，并具有親水性以避免非特異性吸附等特點(diǎn)。普遍用于離線IAC的基質(zhì)主要有瓊脂糖(agarose)、葡聚糖(dextram)、纖維素(cellulose)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacryl)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)等。由于這些物質(zhì)多不能耐受壓力，只能在重力作用的低流速條件下使用，常用來(lái)制備離線IAC。目前廣泛使用的商品化的瓊脂糖凝膠(型號(hào)4B，S印harose4B)(S印harose公司)是一種珠狀的瓊脂糖，它具備性質(zhì)獨(dú)特的疏松網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)有序，規(guī)則均一，能容許大分子物質(zhì)自由擴(kuò)散，適合抗體偶聯(lián)和抗原抗體進(jìn)行反應(yīng)。S印harose4B有一定的剛性，可耐受l磅/平方英尺(lpsi)的柱壓；具有良好的親水性；可耐受pH4-9，高濃度的鹽和水溶性有機(jī)溶劑；多糖骨架幾乎不帶電荷使得非特異性吸附大大降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，本發(fā)明利用群特異性抗體的免疫親和層析凈化技術(shù)，能同時(shí)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物多種組分進(jìn)行分離凈化，具備了處理多殘留組分的能力。本發(fā)明的技術(shù)方案一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法(1)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選型抗體的制備a.3-間苯氧甲酸_酰氯的合成，3-間苯氧甲酸簡(jiǎn)寫(xiě)為3-PBA:2.2g3-PBA溶于3mL三氯甲烷中，在磁力攪拌器上輕柔攪拌，在K流中加入liiLN，N'_二甲基甲酰胺，然后將加熱溫度調(diào)為65°C，加入lmL亞硫酰氯，反應(yīng)lh后，加入正己烷2mL，然后用氮?dú)獯蹈桑磸?fù)進(jìn)行3次該操作，得1.5mL深棕色的液體即為3-PBA-酰氯；b.3-間苯氧甲酸縮Y-氨基丁酸的合成將0.79gY-氨基丁酸預(yù)先溶于10mL2mol/L的K0H溶液中，加入2.65mL吡啶，于冰水浴中冷卻，將上述1.5mL3-PBA-酰氯溶液于10min內(nèi)加入Y-氨基丁酸溶液中，激5烈攪拌40min，并監(jiān)測(cè)其pH的變化情況，直到pH降低到7時(shí)，反應(yīng)結(jié)束；然后加入lmLlmol/LNaOH溶液，強(qiáng)力攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后停止，使用6mol/LHCl酸化至pH<7，用10mL二氯甲烷液液萃取2次，萃取液合并后與20mL水進(jìn)行分配，收集有機(jī)相，過(guò)裝有5g無(wú)水硫酸鎂的漏斗，收集流出液并濃縮，結(jié)晶出來(lái)的晶體3-間苯氧甲酸縮y_氨基丁酸，簡(jiǎn)寫(xiě)為3-PBA-y-AJDS，轉(zhuǎn)移到具塞瓶中，fC保存；c.3-PBA-y-AJDS與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原4.2iiL、0.032mmol/L氯甲酸異丁酯逐滴加入預(yù)先冷卻至13。C的溶液，溶液中包含0.032mmol/L的半抗原3-PBA-y-AJDS和9.8iiL、0.041mmol/L三丁胺，溶劑是0.5mL的二惡烷，在12-14"攪拌反應(yīng)45min，所產(chǎn)生的混合酸酐溶液逐滴加入至pH7.5、含54mgBSA蛋白、水二惡烷v/v為5:1的1.5mL水-二惡烷溶液中，混合物在4t:反應(yīng)5h，使用lmol/LNaOH調(diào)整pH始終在7.5，交聯(lián)物超濾凈化，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得免疫原；免疫原按常規(guī)免疫方法制備抗體；經(jīng)ELISA鑒定，抗體的檢測(cè)限為0.5-1yg/kg;與氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯及溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率分別為100%，18%，76%，39%，8%，7%;(2)載體與抗體的偶聯(lián)a.偶聯(lián)將CNBr活化的proteinA-S印harose4B膠體(Pharmacia公司)從4°C冰箱中取出，回復(fù)至室溫，小心將膠體打散；取出20mL打散后膠體，用pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖溶液充分洗滌，去除其保存液；之后，用pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖溶液將膠體稀釋至40mL，使其充分懸浮，平均分配到2個(gè)50mL的離心管中；將29.7mg抗體用PBS緩沖溶液稀釋到20mL，然后分別取lOmL加入到含有膠體的離心管；室溫下小心攪拌30min，而后1000rpm離心10min回收所得載體與抗體偶聯(lián)的膠體；b.測(cè)定偶聯(lián)率用pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖溶液多次洗滌載體與抗體偶聯(lián)的膠體以除去未結(jié)合的抗體，分管收集淋洗流出液，用紫外掃描儀檢測(cè)流出液在280nm下的紫外吸收，直到在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止；計(jì)算洗滌液中的蛋白濃度，進(jìn)而推算抗體的偶聯(lián)率，公式如下彼勝細(xì)、偶聯(lián)前抗體總量一洗滌液中抗體重量^丄偶聯(lián)率(％)=-X100%(公式1)偶聯(lián)前抗體總量(3)封閉活化位點(diǎn)，加固抗體與基質(zhì)支持物的連接用pH8.2、0.2mol/L的三乙胺緩沖液充分洗滌膠體，使膠體溶液微環(huán)境處于三乙胺緩沖體系中，隨后往離心管中加用PH8.2、0.lmol/L三乙胺緩沖液新鮮配制的偶聯(lián)劑鄰苯二甲酸二甲酯DMP50mL(PierceChemical公司)，之后，室溫下顛倒混勻45min，然后將離心管置于1000rpm下離心lOmin回收膠體，用20mmol/L二乙胺水溶液50mL封閉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑位點(diǎn)，室溫靜置5min;(4)裝免疫親和柱IAC柱將空柱用大量pH7.4、0.Olmol/LPBS緩沖液洗滌，將疏水的篩板置于底部；用大量PBS溶液充分洗滌膠體，更換其緩沖體系為PBS，之后將膠體小心蕩起，平均分裝于聚丙烯小柱(GE公司)內(nèi)，按lmL柱床體積/柱，小心地以流線式灌入，避免產(chǎn)生過(guò)多氣泡；然后將頂部濾片加上，小心將其推送至膠體表面；在頂部篩板上加0.5cm高的S印harose4B膠體；用大量PBS溶液沖洗，以去除柱床中的氣泡；最后用含有質(zhì)量濃度0.01%疊氮鈉的PBS6從冰箱中取出制備的IAC柱3支，PBS平衡后，將含8000ng的6種菊酯農(nóng)藥氟胺氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40mLPBS-甲醇，PBS:甲醇體積比80:20，連續(xù)加到IAC柱上，自然重力下流出，然后用20mLPBS、20mL水洗滌，最后用4mL甲醇洗脫，收集流出液，揮干溶劑，正己烷復(fù)溶后，用氣相_電子捕獲檢測(cè)器GC-ECD(氣相-電子捕獲檢測(cè)器)檢測(cè)；按下列公式計(jì)算每種動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量；空白對(duì)照柱按照上述(1)_(4)進(jìn)行，只是不加抗體溶液；(6)洗脫液的選擇將總體積為lOmL含有氟胺氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯和溴氰菊酯各100ng的含有10%甲醇的PBS溶液連續(xù)加到IAC柱上，依次用20mLPBS、水洗滌柱，最后分別用不同比例的PBS溶液-甲醇溶液，醋酸溶液-甲醇，檸檬酸緩沖液-甲醇，甲醇溶液進(jìn)行洗滌；收集洗脫液，用GC-ECD測(cè)定，計(jì)算回收率；(7)上樣溶液和再生介質(zhì)確定由于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的弱極性，在溶劑中加入一定比例助溶劑甲醇來(lái)改變其水溶性；上樣液選擇PBS，PBS-甲醇(9:1，v/v)，PBS-甲醇(8:2，v/v)，PBS-甲醇(75:25，v/v)，PBS-甲醇(7:3，v/v)，PBS-甲醇(6:4，v/v)，PBS-甲醇(5:5，v/v);上樣液初選為PBS-甲醇(8:2，v/v);將含有50ng的氟胺氰菊酯，入-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯或溴氰菊酯的40mL溶液(PBS-甲醇8:2，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，依次用PBS-甲醇(9:1，v/v)，PBS-甲醇(8:2，v/v)，PBS-甲醇(75:25，v/v)，PBS-甲醇(7:3，v/v)，水-甲醇(9:1，v/v)，水-甲醇(8:2，v/v)，水-甲醇(75:25，v/v)，水-甲醇(7:3，v/v)進(jìn)行洗滌，測(cè)定回收率；再生溶液初選為PBS;(8)重復(fù)使用和柱容量用氟胺氰菊酯和溴氰菊脂標(biāo)準(zhǔn)品為代表化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，時(shí)間為2個(gè)月，考察免疫親和柱在此期間連續(xù)使用20次的動(dòng)態(tài)柱容量的變化。一次使用包括加樣、洗滌、洗脫和再生。20X甲醇的PBS(0.01M，pH7.4)溶液作為上樣溶液。洗脫液用4mL甲醇洗脫，再生用PBS(O.OIM，pH7.4)溶液，GC-ECD測(cè)定柱容量變化。用所述方法制備的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的應(yīng)用實(shí)際樣品處理肉類(lèi)組織經(jīng)研缽磨碎，添加水平每kg肉添加5，20或50iig的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的試樣，取樣本5g，加無(wú)水硫酸鈉10g，混勻溶于30mL石油醚-乙醚溶液中，石油醚乙醚體積比為1:1，渦旋lmin后，超聲提取10min，離心，上清液揮干，溶于正己烷20mL和乙腈30mL的介質(zhì)中，液液分配，將乙腈層濃縮，溶于20mL上樣溶液中，上樣溶液為甲醇:PBS體積比2:8，PBS為pH7.4、0.01M;動(dòng)態(tài)柱容量(ngfeil)=上樣,頓農(nóng)度(ng/ml)X上樣液體積(ml)艦鵬積(ml)X100%(公式2)絕對(duì)往容量=檢測(cè)條件GC-ECD:檢測(cè)器300°C;進(jìn)樣口280°C;不分流進(jìn)樣；載氣高純氮；色譜柱DM-5，30mX0.32mmI.D，O.25iim(Dikma);程序升溫初始60。C維持lmin，25。C/min升至175°C，10°C/min升至300°C，300。C維持5min。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用群特異性抗體的免疫親和層析凈化技術(shù)，能同時(shí)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物多種組分進(jìn)行分離凈化，具備了處理多殘留組分的能力。本發(fā)明利用實(shí)驗(yàn)所獲得的抗體與ProteinA-S印harose4B偶聯(lián)，裝填免疫親和層析柱。ProteinA特異地與抗體的重鏈恒定區(qū)(Fc)結(jié)合，將其可變區(qū)釋放出來(lái)，使得抗體定向地偶聯(lián)到基質(zhì)載體上，其結(jié)合區(qū)手臂充分地展開(kāi)，有利于和目標(biāo)分子結(jié)合。與常用的spharose4B相比，后者依靠基質(zhì)骨架上游離的羥基非特異性地與抗體相連，由于結(jié)合的非特異性，抗體的結(jié)合部位也可被埋沒(méi)，使得只有部分結(jié)合部位裸露，在相同的膠體量和抗體量下，定向結(jié)合的ProteinA載體使得IAC柱有更高的柱容量。圖1洗脫液體積的選擇。圖2上樣溶液中甲醇組分的比例的選擇。圖320次使用期間小柱的柱容量變化曲線。圖46種菊酯在氣相色譜上的分離。1、甲氰菊酯，2、入-氯氟氰菊酯，3、氟氯氰菊酯，4、氯氰菊酯，5、氟胺氰菊酯，6、溴氰菊酯。具體實(shí)施例方式(1)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選型抗體的制備a.3-PBA-酰氯的合成2.2g3-PBA溶于3mL三氯甲烷中，在磁力攪拌器上輕柔攪拌，在K流中加入liiLN，N'-二甲基甲酰胺，然后將加熱溫度調(diào)為65t:，加入約lmL亞硫酰氯，反應(yīng)1小時(shí)后，加入正己烷2mL，然后用氮?dú)獯蹈?，反?fù)進(jìn)行3次該操作，最后約1.5mL深棕色的液體即為3-PBA-酰氯。b.將0.79gY-氨基丁酸預(yù)先溶于10mL2M的K0H溶液中，加入2.65mL吡啶，于冰水浴中冷卻，將上述1.5mL3-PBA-酰氯溶液于10min內(nèi)加入Y-氨基丁酸溶液中，激烈攪拌40min，并監(jiān)測(cè)其pH的變化情況，直到pH降低到7時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。然后加入lmL1MNaOH，強(qiáng)力攪拌，觀察pH的變化情況，反應(yīng)進(jìn)行15min后停止，使用6NHC1酸化至pH<7，用10mL二氯甲烷液液萃取2次。萃取液合并后與20mL水進(jìn)行分配，收集有機(jī)相，過(guò)裝有約5g無(wú)水硫酸鎂的漏斗，收集流出液并濃縮，結(jié)晶出來(lái)的晶體轉(zhuǎn)移到具塞瓶中，4t:保存。c.與載體蛋白的偶聯(lián)氯甲酸異丁酯(4.2iiL，0.032mM)逐滴加入預(yù)先冷卻的溶液(13°C)，溶液中包含0.032mM的半抗原3-PBA-y-AJDS和三丁胺(9.8yL，0.041mM)，溶劑是0.5mL的二惡烷，在12-14t:下攪拌反應(yīng)45min，所產(chǎn)生的混合酸酐溶液逐滴加入蛋白溶液(BSA54mg)于1.5mL水/二惡烷(5:1，v/v)pH7.5，混合物在4。C反應(yīng)5h，使用1MNaOH調(diào)整pH始終在7.5，交聯(lián)物超濾凈化，(PM10，000膜)，然后進(jìn)行冷凍干燥。d.免疫原經(jīng)常規(guī)流程制備抗體。經(jīng)ELISA鑒定，抗體的檢測(cè)限為0.5_1yg/kg。與氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯和溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率為100%，18%，76%，39%，8%，7%。[OO53](2)載體與抗體的偶聯(lián)a偶聯(lián)將CNBr活化的proteinA-S印harose4B膠體從4"C冰箱中取出，回復(fù)至室溫。小心將膠體打散，取出20mL打散后的膠體，用PBS充分洗滌，去除其保存液。之后，用PBS溶液將膠體稀釋至40mL，使其充分懸浮，平均分配到2個(gè)50mL的離心管中。將事先抗血清純化好的抗體(29.7mg)用PBS稀釋到20mL，然后分別取10mL加入到含有膠體的離心管。室溫下小心攪拌約30min，而后低速離心(1000rpm)10min回收膠體。b.測(cè)定偶聯(lián)率用PBS緩沖液多次洗滌膠體以除去未結(jié)合的抗體，分管收集淋洗流出液，用紫外掃描儀檢測(cè)流出液在280nm下的紫外吸收，直到在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止。計(jì)算洗滌液中的蛋白濃度，進(jìn)而推算抗體的偶聯(lián)率，公式如下趣勝啦,。八偶聯(lián)前抗體總量一洗滌液中抗體重量、,偶聯(lián)率(％)=-X100%(公式1)偶聯(lián)前抗體總量多克隆抗體溶液與溴化氰活化的ProteinA-S印harose4B偶聯(lián)后，用大量的PBS洗去未結(jié)合的抗體分子，將收集的洗滌液進(jìn)行紫外測(cè)定，偶聯(lián)結(jié)果如下表1。利用上述公式，計(jì)算偶聯(lián)上的抗體量為27.2mg，偶聯(lián)率為91.6%。表1抗體偶聯(lián)率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(3)封閉活化位點(diǎn)，加固抗體與基質(zhì)支持物的鏈接用0.2M的三乙胺緩沖液(pH8.2)充分洗滌膠體，使其溶液微環(huán)境處于三乙胺緩沖體系中，將膠體裝于離心管中，隨后往離心管中加偶聯(lián)劑DMP(dimethylpimelimidate)50mL(O.1M，用pH8.2三乙胺緩沖液新鮮配制)，之后，室溫下顛倒混勻45min。然后將離心管置于1000rpm下離心10min回收膠體，用二乙胺水溶液50mL(20mM)封閉未反應(yīng)的交聯(lián)劑位點(diǎn)，室溫靜置5min。(4)裝柱將空柱用大量PBS緩沖液洗滌，將疏水的篩板置于底部。用大量PBS溶液充分洗滌膠體，更換其緩沖體系為PBS，之后將膠體小心蕩起，平均分裝于聚丙烯小柱內(nèi)，按lmL柱床體積/柱，小心地以流線式灌入，避免產(chǎn)生過(guò)多氣泡。然后將頂部濾片加上，小心將其推送至膠體表面。在頂部篩板上加約0.5cm高的S印harose4B膠體。用大量PBS溶液沖洗，以去除柱床中的氣泡。最后用含有0.01%疊氮鈉的PBS溶液保存小柱，膠體上方留約0.3cm高的緩沖液，于4t:冰箱中保存待用。(5)測(cè)定柱容量從冰箱中取出制備的IAC柱3支，PBS平衡后，將含8000ng的6種菊酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40mLPBS-甲醇(80-20，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，自然重力下流出，然后用20mLPBS、20mL水洗滌，最后用4mL甲醇洗脫，收集流出液，揮干溶劑，正己烷復(fù)溶后，用GC-ECD檢測(cè)。按下列公式計(jì)算動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量?！?，插處六，n上樣,物濃度(ngM)X上樣液體積(ml)、動(dòng)態(tài)柱谷量(ng/ml)=-—B^-n-^X100%(公式2)動(dòng)態(tài)往容量(ng/ml)絕對(duì)往容量=X100%(公式3)單位體枳膠的抗體(ng/ml)空白對(duì)照柱按照上述(1)(4)進(jìn)行，只是不加抗體溶液。根據(jù)所獲得的IAC柱，測(cè)定其對(duì)氟胺氰菊酯、入酯、氟氯氰菊酯以及溴氰菊酯6種藥物的柱容量。結(jié)果如表2所示，該柱對(duì)6種藥物的絕對(duì)柱容量為195-415ng/mgIgG，動(dòng)態(tài)柱容量為1289-2340ng/mL?？梢詽M足殘留分析的需要。表2親和層析柱的動(dòng)態(tài)和絕對(duì)柱容量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(6)洗脫液的選擇0074]將10mL含有氟胺氰菊酯，入菊酯各100ng的PBS溶液(含有10%甲醇)連續(xù)加到IAC柱上，依次用20mLPBS、水洗滌柱，最后分別用不同比例的PBS溶液_甲醇溶液，醋酸溶液-甲醇，檸檬酸緩沖液-甲醇，甲醇溶液進(jìn)行洗滌。收集洗脫液，用GC-ECD測(cè)定，計(jì)算回收率。分別使用不同酸堿度和不同甲醇含量的PBS溶液對(duì)目的藥物進(jìn)行洗脫，測(cè)定其回收率，綜合考慮回收率和IAC柱的壽命，最終選擇了4mL甲醇作為最終的洗脫液(見(jiàn)圖1)。在此條件下，各個(gè)藥物的回收率均在93%以上，可以滿足殘留分析的要求。表3洗脫溶液對(duì)藥物回收率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>洗脫體積也是一個(gè)重要的參數(shù)，洗脫體積太大不方便濃度且可能破壞抗體的穩(wěn)定性。試驗(yàn)中我們對(duì)洗脫液甲醇的使用量進(jìn)行了優(yōu)化，見(jiàn)圖l所示，隨著甲醇體積的增加，回收率增加，由于有機(jī)溶劑對(duì)抗體的活性有損害，為了增加柱的可重復(fù)使用頻率，我們選擇了4mL甲醇，既可以滿足較高的回收率又不至于洗脫體積太大而降低IAC柱的壽命，同時(shí)也縮短了分析時(shí)間。(7)淋洗液的選擇動(dòng)物性組織樣本中油脂、蛋白等干擾物質(zhì)會(huì)顯著降低抗原-抗體反應(yīng)的特異性，大量的非特異性結(jié)合反應(yīng)引入了干擾物質(zhì)，降低了凈化效果。試驗(yàn)中，我們對(duì)豬肉樣品的提取物分別在IAC柱上進(jìn)行了凈化，并通過(guò)改變淋洗液PBS中NaCl的含量可以顯著地減少非特異性結(jié)合。結(jié)果表明，PBS-0.2MNaCl-20X甲醇可以在保證各個(gè)藥物較好的回收率的情況下減少非特異性結(jié)合。(8)上樣溶液和再生介質(zhì)確定由于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的弱極性，在溶劑中加入一定比例助溶劑甲醇來(lái)改變其水溶性。將含有50ng的氟胺氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯或溴氰菊酯的40mL溶液(PBS-甲醇9:1，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，依次用PBS-甲醇(9:1，v/v)，PBS-甲醇(8:2，v/v)，PBS-甲醇(75:25，v/v)，PBS-甲醇(7:3，v/v)，水-甲醇(9:1，v/v)，水-甲醇(8:2，v/v)，水-甲醇(75:25，v/v)，水-甲醇(7:3，v/v)進(jìn)行洗滌，測(cè)定回收率。再生溶液初選為PBS。上樣溶液中甲醇的含量由于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的弱極性，上樣溶液中含有一定比例的有機(jī)溶劑可以增強(qiáng)其溶解性，然而有機(jī)溶劑會(huì)破壞抗原-抗體結(jié)合，試驗(yàn)中對(duì)不同比例的甲醇-PBS上樣溶液進(jìn)行了測(cè)試，見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，隨著甲醇含量的增加，目標(biāo)化合物在上樣流出液中的損失隨之增加，在甲醇比例為25%以下，測(cè)定回收率在90%以上，而甲醇比例超過(guò)30%則目標(biāo)化合物回收率急劇下降。因此，試驗(yàn)中選擇含20%甲醇的PBS(O.01M，pH7.4)溶液作為上樣溶液。(9)重復(fù)使用和柱容量用氟胺氰菊酯和溴氰菊脂標(biāo)準(zhǔn)品為代表化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，時(shí)間為2個(gè)月，考察免疫親和柱在此期間連續(xù)使用20次的動(dòng)態(tài)柱容量的變化。一次使用包括加樣、洗滌、洗脫和再生。20X甲醇的PBS(0.01M，pH7.4)溶液作為上樣溶液。洗脫液用4mL甲醇洗脫，再生用PBS(O.OIM，pH7.4)溶液，GC-ECD測(cè)定柱容量變化。試驗(yàn)中在2個(gè)月內(nèi)考察了IAC柱的穩(wěn)定性，追蹤了在此期間的柱容量變化。圖3以氟胺氰菊酯或溴氰菊酯的柱容量變化表明了在20次重復(fù)使用過(guò)程中，在前6次過(guò)程中，柱容量迅速下降，此后趨于平穩(wěn)，尤其是在10次使用之后柱容量變化較小，此時(shí)的柱容量下降至最初的1/3。(見(jiàn)圖3)(10)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度為0，0.5，1，2，5，10，50，100，200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用GC-ECD測(cè)定，以各組分色譜峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。菊酯為手性藥物，對(duì)于在非手性柱上出現(xiàn)簇峰的，以各個(gè)峰面積總和計(jì)算，如氟氯氰菊酯為混旋體，有四個(gè)峰，以4峰面積總和計(jì)算?；貧w方程見(jiàn)表4，由表4知，在上述濃度范圍內(nèi)，每種藥物的響應(yīng)與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于99%，典型色譜圖見(jiàn)圖4。表46種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性回歸系數(shù)藥物線性范圍ng/mL線性方程回歸系數(shù)甲氰菊酯1-200y=0.9772x+9.60310.9946A-氯氟氰菊酯0.5-200y=1.5552x+13.8110.9970氟氯氰菊酯2-200y=0.5598x+l.67640.9995氯氰菊酯2-200y=1.639x+20.0110.9936氟胺氰菊酯2-200y=0.6366x+0.27860.9971溴氰菊酯2-200y=0.1143x-0.80060.9980(11)實(shí)際樣品處理肉類(lèi)組織經(jīng)研缽磨碎，添加水平5，20或50iigkg—、取樣本(5g)，加無(wú)水硫酸鈉(lOg)，混勻溶于石油醚-乙醚(1:1，v/v，30mL)溶液中，渦旋(lmin)后，超聲提取(10min)，離心，上清液揮干，溶于正己烷(20mL)和乙腈(30mL)，液液分配，將乙腈層濃縮，溶于上樣溶液(甲醇PBS(0.01M，pH7.4)=2:8，20mL)。檢測(cè)條件GC-ECD:檢測(cè)器(300°C);進(jìn)樣口(280°C);不分流進(jìn)樣；載氣(高純氮)；色譜柱DM-5，30mX0.32mmI.D.，0.25iim(Dikma);程序升溫初始60。C維持lmin，25°C/min升至175°C，10°C/min升至300°C，300。C維持5min。表5豬肉添加回收試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，其特征在于(1)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選型抗體的制備a.3-間苯氧甲酸-酰氯的合成，3-間苯氧甲酸簡(jiǎn)寫(xiě)為3-PBA2.2g3-PBA溶于3mL三氯甲烷中，在磁力攪拌器上輕柔攪拌，在N2流中加入1μLN，N′-二甲基甲酰胺，然后將加熱溫度調(diào)為65℃，加入1mL亞硫酰氯，反應(yīng)1h后，加入正己烷2mL，然后用氮?dú)獯蹈?，反?fù)進(jìn)行3次該操作，得1.5mL深棕色的液體即為3-PBA-酰氯；b.3-間苯氧甲酸縮γ-氨基丁酸的合成將0.79gγ-氨基丁酸預(yù)先溶于10mL2mol/L的KOH溶液中，加入2.65mL吡啶，于冰水浴中冷卻，將上述1.5mL3-PBA-酰氯溶液于10min內(nèi)加入γ-氨基丁酸溶液中，激烈攪拌40min，并監(jiān)測(cè)其pH的變化情況，直到pH降低到7時(shí)，反應(yīng)結(jié)束；然后加入1mL1mol/LNaOH溶液，強(qiáng)力攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后停止，使用6mol/LHCl酸化至pH＜7，用10mL二氯甲烷液液萃取2次，萃取液合并后與20mL水進(jìn)行分配，收集有機(jī)相，過(guò)裝有5g無(wú)水硫酸鎂的漏斗，收集流出液并濃縮，結(jié)晶出來(lái)的晶體3-間苯氧甲酸縮γ-氨基丁酸，簡(jiǎn)寫(xiě)為3-PBA-γ-AJDS，轉(zhuǎn)移到具塞瓶中，4℃保存；c.3-PBA-γ-AJDS與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原4.2μL、0.032mmol/L氯甲酸異丁酯逐滴加入預(yù)先冷卻至13℃的溶液，溶液中包含0.032mmol/L的半抗原3-PBA-γ-AJDS和9.8μL、0.041mmol/L三丁胺，溶劑是0.5mL的二惡烷，在12-14℃攪拌反應(yīng)45min，所產(chǎn)生的混合酸酐溶液逐滴加入至pH7.5、含54mgBSA蛋白、水∶二惡烷v/v為5∶1的1.5mL水-二惡烷溶液中，混合物在4℃反應(yīng)5h，使用1mol/LNaOH調(diào)整pH始終在7.5，交聯(lián)物超濾凈化，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得免疫原；免疫原按常規(guī)免疫方法制備抗體；經(jīng)ELISA鑒定，抗體的檢測(cè)限為0.5-1μg/kg；與氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯及溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率分別為100％，18％，76％，39％，8％，7％；(2)載體與抗體的偶聯(lián)a.偶聯(lián)將CNBr活化的proteinA-Sepharose4B膠體從4℃冰箱中取出，回復(fù)至室溫，小心將膠體打散；取出20mL打散后膠體，用pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖溶液充分洗滌，去除其保存液；之后，用pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖溶液將膠體稀釋至40mL，使其充分懸浮，平均分配到2個(gè)50mL的離心管中；將29.7mg抗體用PBS緩沖溶液稀釋到20mL，然后分別取10mL加入到含有膠體的離心管；室溫下小心攪拌30min，而后1000rpm離心10min回收所得載體與抗體偶聯(lián)的膠體；b.測(cè)定偶聯(lián)率用pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖溶液多次洗滌載體與抗體偶聯(lián)的膠體以除去未結(jié)合的抗體，分管收集淋洗流出液，用紫外掃描儀檢測(cè)流出液在280nm下的紫外吸收，直到在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止；計(jì)算洗滌液中的蛋白濃度，進(jìn)而推算抗體的偶聯(lián)率，公式如下(3)封閉活化位點(diǎn)，加固抗體與基質(zhì)支持物的連接用pH8.2、0.2mol/L的三乙胺緩沖液充分洗滌膠體，使膠體溶液微環(huán)境處于三乙胺緩沖體系中，隨后往離心管中加用pH8.2、0.1mol/L三乙胺緩沖液新鮮配制的偶聯(lián)劑鄰苯二甲酸二甲酯DMP50mL，之后，室溫下顛倒混勻45min，然后將離心管置于1000rpm下離心10min回收膠體，用20mmol/L二乙胺水溶液50mL封閉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑位點(diǎn)，室溫靜置5min；(4)裝免疫親和柱IAC柱將空柱用大量pH7.4、0.01mol/LPBS緩沖液洗滌，將疏水的篩板置于底部；用大量PBS溶液充分洗滌膠體，更換其緩沖體系為PBS，之后將膠體小心蕩起，平均分裝于聚丙烯小柱內(nèi)，按1mL柱床體積/柱，小心地以流線式灌入，避免產(chǎn)生過(guò)多氣泡；然后將頂部濾片加上，小心將其推送至膠體表面；在頂部篩板上加0.5cm高的Sepharose4B膠體；用大量PBS溶液沖洗，以去除柱床中的氣泡；最后用含有質(zhì)量濃度0.01％疊氮鈉的PBS溶液保存小柱，膠體上方留0.3cm高的緩沖液，于4℃冰箱中保存待用；(5)測(cè)定柱容量從冰箱中取出制備的IAC柱3支，PBS平衡后，將含8000ng的6種菊酯農(nóng)藥氟胺氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40mLPBS-甲醇，PBS∶甲醇體積比80∶20，連續(xù)加到IAC柱上，自然重力下流出，然后用20mLPBS、20mL水洗滌，最后用4mL甲醇洗脫，收集流出液，揮干溶劑，正己烷復(fù)溶后，用氣相-電子捕獲檢測(cè)器GC-ECD檢測(cè)；按下列公式計(jì)算每種動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量；空白對(duì)照柱按照上述(1)～(4)進(jìn)行，只是不加抗體溶液；(6)洗脫液的選擇將總體積為10mL含有氟胺氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯和溴氰菊酯各100ng的含有10％甲醇的PBS溶液連續(xù)加到IAC柱上，依次用20mLPBS、水洗滌柱，最后分別用不同比例的PBS溶液-甲醇溶液，醋酸溶液-甲醇，檸檬酸緩沖液-甲醇，甲醇溶液進(jìn)行洗滌；收集洗脫液，用GC-ECD測(cè)定，計(jì)算回收率；(7)上樣溶液和再生介質(zhì)確定由于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的弱極性，在溶劑中加入一定比例助溶劑甲醇來(lái)改變其水溶性；上樣液選擇PBS，PBS-甲醇(9∶1，v/v)，PBS-甲醇(8∶2，v/v)，PBS-甲醇(75∶25，v/v)，PBS-甲醇(7∶3，v/v)，PBS-甲醇(6∶4，v/v)，PBS-甲醇(5∶5，v/v)；上樣液初選為PBS-甲醇(8∶2，v/v)；將含有50ng的氟胺氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯或溴氰菊酯的40mL溶液(PBS-甲醇8∶2，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，依次用PBS-甲醇(9∶1，v/v)，PBS-甲醇(8∶2，v/v)，PBS-甲醇(75∶25，v/v)，PBS-甲醇(7∶3，v/v)，水-甲醇(9∶1，v/v)，水-甲醇(8∶2，v/v)，水-甲醇(75∶25，v/v)，水-甲醇(7∶3，v/v)進(jìn)行洗滌，測(cè)定回收率；再生溶液初選為PBS；(8)重復(fù)使用和柱容量用氟胺氰菊酯或溴氰菊脂標(biāo)準(zhǔn)品為代表化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，時(shí)間為2個(gè)月，考察免疫親和柱在此期間連續(xù)使用20次的動(dòng)態(tài)柱容量的變化；一次使用包括加樣、洗滌、洗脫和再生；含20％甲醇的pH7.4、0.01M的PBS溶液作為上樣溶液；洗脫液用4mL甲醇洗脫，再生用pH7.4、0.01M的PBS溶液，GC-ECD測(cè)定柱容量變化。F2009102225780C0000021.tif,F2009102225780C0000022.tif,F2009102225780C0000023.tif2.用權(quán)利要求1所述方法制備的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的應(yīng)用，其特征在于實(shí)際樣品處理肉類(lèi)組織經(jīng)研缽磨碎，添加水平每kg肉添加5，20或50iig的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物的試樣，取樣本5g，加無(wú)水硫酸鈉108，混勻溶于301^石油醚-乙醚溶液中，石油醚乙醚體積比為l:l，渦旋lmin后，超聲提取10min，離心，上清液揮干，溶于正己烷20mL和乙腈30mL的介質(zhì)中，液液分配，將乙腈層濃縮，溶于20mL上樣溶液中，上樣溶液為甲醇:PBS體積比2:8，PBS為pH7.4、0.OIM;檢測(cè)條件GC-ECD:檢測(cè)器300°C;進(jìn)樣口280°C;不分流進(jìn)樣；載氣高純氮；色譜柱DM-5，30mXO.32mmI.D，0.25iim;程序升溫初始60°C維持lmin，25。C/min升至175°C，10°C/min升至300°C，3Q0。C維持5min。全文摘要一種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，屬于免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明利用群特異性抗體的免疫親和層析凈化技術(shù)，能同時(shí)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥物多種組分進(jìn)行分離凈化。本發(fā)明利用實(shí)驗(yàn)所獲得的抗體與ProteinA-Sepharose4B偶聯(lián)，裝填免疫親和層析柱。ProteinA特異地與抗體的重鏈恒定區(qū)(Fc)結(jié)合，將其可變區(qū)釋放出來(lái)，使得抗體定向地偶聯(lián)到基質(zhì)載體上，其結(jié)合區(qū)手臂充分地展開(kāi)，有利于和目標(biāo)分子結(jié)合。與常用的spharose4B相比，后者依靠基質(zhì)骨架上游離的羥基非特異性地與抗體相連，由于結(jié)合的非特異性，抗體的結(jié)合部位也可被埋沒(méi)，使得只有部分結(jié)合部位裸露，在相同的膠體量和抗體量下，定向結(jié)合的ProteinA載體使得IAC柱有更高的柱容量。文檔編號(hào)G01N33/531GK101726589SQ200910222578公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年11月20日優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日發(fā)明者匡華,彭池方,徐麗廣,李灼坤,胥傳來(lái),陳偉,馬偉申請(qǐng)人:江南大學(xué)