專利名稱：一種檢測蛋白表達水平的試劑盒在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測玻連蛋白表達水平的試劑盒在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用，特別涉及檢測玻連蛋白表達水平的試劑盒在制備用于肝細胞癌與肝硬化患者的判別診斷的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒中的應用。
背景技術：
肝細胞癌(h印atocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內的惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率和死亡率，每年約650，000人死于HCC，且其發(fā)病率有增高的趨勢。該病多發(fā)于東南亞和非洲，其中約有50%以上發(fā)生于中國，位居我國癌癥死亡率的第二位。肝細胞癌的發(fā)生情況是一個多因素，多階段，復雜的過程，乙型肝炎病毒 (hepatitisB virus,HBV)慢性感染是重要的高危因素。腫瘤抑制、肝臟切除和移植是現階段肝癌的主要治療方法，但約60%到100%的患者會術后復發(fā)。因此，在高危人群特別是肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者中篩查早期肝癌患者，及時采取治療措施，可提高肝癌患者的生存率和生活質量。但HCC早期診斷較難，病情進展快，預后水平低。目前肝炎、肝硬化等HCC高危人群的篩查和HCC臨床診斷與病情監(jiān)測等仍主要依賴于B超等影像學檢查聯(lián)合血清標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平的檢測。而AFP作為目前HCC診斷和病情監(jiān)測一個最主要的生物標志物，其靈敏度和特異度仍不理想，特別是在臨床中有超過30 %的HCC病人AFP為陰性，對于這部分患者AFP將無法發(fā)揮作用。雖然Des-gamma carboxy-prothrombin (DCP)和 lectin-bound AFP (AFP-L3)被認為是很有潛力的 HCC 診斷標志物，但最近結果表明，AFP對于HCC早期診斷的效果還是要優(yōu)于DCP和AFP-L3 (Marrero， J.A.et al. alpha-Fetoprotein, Des-gamma Carboxyprothrombin, and Lectin-Bound alpha-Fetoprotein in Early Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology(2009))。尋找敏感的肝癌生物標記物，對于早期發(fā)現和診斷肝細胞癌非常重要。近年來，有許多實驗室在進行肝癌標記物相關的蛋白質組學研究。對肝癌腫瘤組織進行iTRAQ分析，得到了三種經免疫組化驗證的差異蛋白f ibroleukin，myeloid associateddifferentiation marker 禾口 ornithine carbamoyl transferase(Chaerkady， R. et al. A quantitativeproteomic approach for identification of potential biomarkers in hepatocellular carcinoma. JProteome Res 7，4289-4298(2008))， 對肝穿組織的細胞核組份分析發(fā)現了 16種與細胞骨架、應激反應和代謝功能相關的差異蛋(Codarin，Ε. et al. Differential ProteomicAnalvsis of Subfractioned Human Hepatocellular Carcinoma Tissues. J Proteome Res 8，2273-2284(2009))，clathrin heavy chain (CHC)禾口 formiminotransferase cyclodeaminase(FTCD)被發(fā)現為組織中的候選標記物(Seimiya，Μ. et al. Identification of novelimmunohistochemical tumor markers for primary hepatocellular carcinoma ；clathrin heavychainand formiminotransferase cyclodeaminase. Hepatology 48,519-530(2008)),還有 人基于雙向電泳，提出基于六個蛋白(haptoglobin, cytochrome b5, progesterone receptormembrane component 1, heat shock 27 kDa protein 1, lysosomal proteinase cathepsin B, keratin I)的決策樹用于區(qū)分腫瘤與非腫瘤(Lee，N. P. et al.Proteomic expressionsignature distinguishes cancerous and nonmalignant tissues in hepatocellular carcinoma. JProteome Res 8,1293-1303, doi :10.1021/ pr800637z(2009))，2DE的方法還發(fā)現了 IaminBl在HCC病人血漿中高表達(Sun，S.， Xu, Μ. Z. ， Poon, R. T. ， Day, P. J. & Luk， J. Μ. Circulating Lamin Bl (LMNBl) biomarker detects early stages of liver cancer in patients. JProteome Res 9,70—78, doi 10. 1021/pr9002118 (2010))。此外，LCM與cICAT技術被結合用于肝癌組織分析(Li， C. et al. Analysis of microdissected cells by two-dimensionalLC—MS approaches. Methods Mol Biol 428，193-208 (2008))，cICAT的方法發(fā)現了與HCC移植后轉移相關的蛋 [=| calpain small subunit 1 (Capn4) (Bai, D. S. et al. Capn4overexpression underlies tumor invasion and metastasis after liver transplantation forhepatocellular carcinoma. Hepatology 49,460-470, doi :10.1002/h印·22638(2009))。非標相對定量方法在血漿中鑒定了一批診斷HCV-HCC與肝硬化的候選標志物(Mas，V. R. etal. Proteomic analysis of HCV cirrhosis and HCV-induced HCC :identifying biomarkers formonitoring HCV-cirrhotic patients awaiting liver transplantation. Transplantation 87，143-152，doi :10. 1097/TP. 0b013e318191c68d)，基于 SELDI 技術的肝癌標志物尋找發(fā)現了 thrombin輕鏈和GRO-alpha(ffu, F. X. et al. Identifying serological biomarkers ofhepatocellular carcinoma using surface-enhanced laser desorption/ionization-time-of-flightmass spectroscopy. Cancer Lett 279, 163-17(K2009))，SAA 蛋白(He，Q. Y. et al. Toward theproteomic identification of biomarkers for the prediction of HBV related hepatocellularcarcinoma. J Cell Biochem 103,740-752 (2008)), neutrophil-activating peptide 2 (He, M. etal.Detection and identification of NAP-2 as a biomarker in hepatitis B~relatedhepatoceIluIar carcinoma by proteomic approach.Proteome Sci 6,
10(2008)) ο綜上所述，近年來蛋白質組學在肝癌標志物方面的研究，大部分還是停留在發(fā)現階段，在標志物的驗證上，特別是血清水平的驗證上取得的進展并不多。因此，針對肝臟細胞癌發(fā)生過程中具有標志性變化的血清蛋白質建立一種檢測方法，有助于腫瘤的臨床診斷。Vitronectin(玻連蛋白)是存在于血液和一些組織中的多功能粘附糖蛋白和擴散因子，可被整合素家族的特定成員識別，在細胞-基質粘附中發(fā)揮作用，人體內 vitronectin水平的變化與凝血、免疫相關疾病等多種生理和病理過程密切相關，但尚無對其進行血清ELISA檢測用于肝細胞癌診斷的報道。(Vitronectin :UniProtKB/Swiss-Prot 庫蛋白號 P04004，GenBank 號X05006)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbent assay 簡稱 ELISA)是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)上發(fā)展起來的一種新型免疫測定技術，ELISA過程包括抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體，再加相應酶標記抗體，生成抗原一待測抗體一酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。待測抗體的量與有色產物成正比。同理也可包被抗體，測定抗原含量。ELISA最常用的四種方法直接法測定抗原；間接法測定抗體；雙抗體夾心法測定抗原；競爭法測定抗原。(1)直接法測定抗原的步驟A.將抗原吸附在載體表面；B.加酶標抗體，形成抗原-抗體復合物；C.加底物。該方法中，底物的降解量=抗原量。(2)間接法測定抗體A.將抗原吸附于固相載體表面；B.加抗體，形成抗原-抗體復合物；C.加酶標抗體；D.加底物。該方法中，測定底物的降解量=抗體量。(3)雙抗體夾心法測定抗原A.將抗體吸附于固相表面；B.加抗原，形成抗原-抗體復合物；C.加酶標抗體；E.加底物。該方法中，底物的降解量=抗原量。(4)競爭法測定抗原A.將抗體吸附在固相載體表面；B.加入酶標抗原和待測抗原，競爭結合抗體；對照只加入酶標抗原；C.加底物。該方法中，對照孔與樣品孔底物降解量的差=未知抗原量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供檢測玻連蛋白(Vitronectin)表達水平的試劑盒在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用。上述檢測玻連蛋白(Vitronectin)表達水平的試劑盒只要滿足可以檢測體系中的玻連蛋白(Vitronectin)濃度的要求均可，特別是酶聯(lián)免疫試劑盒，如American DiagnosticaInc (ADI)公司，貨號 803 的酶聯(lián)免疫試劑盒(IMUBIND Vitronectin ELISA)。上述檢測玻連蛋白(Vitronectin)表達水平的試劑盒也可以用玻連蛋白和/或其抗體制備得到。該檢測玻連蛋白(Vitronectin)表達水平的試劑盒制備的診斷肝細胞癌的試劑盒不依賴血清標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)表達水平即可以診斷肝癌。與上述相同的道理，利用玻連蛋白和/或其抗體可以制成易于檢測、可信度高、不依賴于血清標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)表達水平的診斷肝細胞癌的酶聯(lián)免疫試劑盒。該診斷肝細胞癌的酶聯(lián)免疫試劑盒可為常規(guī)的可檢測玻連蛋白(Vitronectin) 表達水平的酶聯(lián)免疫試劑盒，通常包括固相載體、標記物和可與所述標記物發(fā)生顯色反應的底物；所述標記物為酶標記vitronectin蛋白、酶標記vitronectin蛋白抗體、生物素標記vitronectin蛋白或者生物素標記vitronectin蛋白抗體。所述標記物可以由 vitronectin蛋白或vitronectin蛋白抗體制成。上述vitronectin蛋白抗體可為單克隆抗體或者多克隆抗體，其中單克隆抗體可購自Santa Cruz公司(貨號sc-52752)，多克隆抗體可購自Proteintech公司(貨號 15833-1-AP)。上述試劑盒可用于酶聯(lián)免疫吸附檢測vitronectin蛋白的表達水平，具體可為直接法測定抗原、雙抗體夾心法測定抗原和競爭法測定抗原。當使用雙抗體夾心法測定抗原和競爭法測定抗原時，所述酶聯(lián)免疫試劑盒還包括包被原，所述包被原為vitronectin蛋白抗體。直接法所用的試劑盒，所述標記物為酶標記vitronectin蛋白抗體或者生物素標記vitronectin蛋白抗體。雙抗體夾心法所用的試劑盒，所述包被原為vitronectin蛋白抗體，所述標記物為酶標記vitronectin蛋白抗體或者生物素標記vitronectin蛋白抗體。競爭法測定抗原所用的試劑盒，所述包被原為vitronectin蛋白抗體，所述標記物為酶標記vitronectin蛋白或者生物素標記vitronectin蛋白。所述標記物所用的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶。所述固相載體的材料很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。固相載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等；其中優(yōu)選為聚苯乙烯制成的微量反應板凹孔。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗原吸附其上后還是保留原來的免疫活性，空白值低，孔底透明度高，各板之間、 同一板各孔之間性能相近，所以固相載體優(yōu)選為聚苯乙烯。上述所述vitronectin蛋白抗體優(yōu)選為一抗，可為以vitronectin蛋白為抗原的單克隆抗體或多克隆抗體；所述vitronectin蛋白抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選為鼠源抗體；當使用雙夾心法時，需使用兩種有不同抗原決定簇或不同物種來源的抗體，其中包被原優(yōu)選鼠源抗體。所述試劑盒還包括vitronectin蛋白標準品。vitronectin蛋白標準品可以是富集或表達、合成的人vitronectin全蛋白或包含vitronectin蛋白抗原決定簇的肽段；當標記物為辣根過氧化物酶時，與所述酶標記物發(fā)生顯色反應的底物由底物A和底物B組成，所述底物A為過氧化氫或過氧化脲，所述底物B為鄰苯二胺(0-phenylenediamine，0PD)、3 ‘，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺(3 ‘，3'，5'， 5 ‘ ， -tetramethylbenzidine, TMB)或 ABTS[2，2\ ‘ -azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]；當標記物為堿性磷酸酯酶時，底物為4_硝基酚磷酸鹽緩沖液；當標記物為生物素時，底物A為酶標親和素，底物B為酶的底物。
所述試劑盒中還包括濃縮樣本稀釋液、抗體稀釋液、洗液、顯色試劑、終止液等，這些試劑可用常規(guī)方法制備。發(fā)明人通過大量實驗發(fā)現肝細胞癌患者血清中上調表達的蛋白質vitronectin， 并提供了可以利用檢測此種蛋白質的試劑盒作為診斷肝細胞癌的試劑盒的依據，以及利用該試劑盒診斷肝細胞癌的判定閾值標準，即利用其特性建立了診斷肝癌的試劑盒，該試劑盒可用于肝細胞癌特別是AFP陰性肝細胞癌的臨床檢測。實驗結論表明，vitronectin蛋白在肝細胞癌患者血清中較肝硬化患者有明顯高表達，而且表達水平不依賴于血清標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)表達水平，因此本發(fā)明的通過檢測vitronectin蛋白濃度來診斷肝癌的試劑盒在肝細胞癌特別是AFP陰性肝細胞癌臨床檢驗方面具有突出的應用價值。本發(fā)明所提供的應用，利用在肝細胞癌患者血清中上調表達的蛋白質 vitronectin作為診斷標志物試劑盒的制備或者直接作為診斷肝細胞癌的試劑盒，其具有靈敏度高，準確性高的特點，并不依賴于常規(guī)方法必須依賴的血清標志物甲胎蛋白 (alpha-fetoprotein,AFP)表達，適用于在生物學、醫(yī)學和藥學領域中對肝細胞癌進行臨床檢測研究和發(fā)病機制研究，具有廣泛的實用性。用途包括但不限于在生物學、醫(yī)學和藥學等領域進行各種肝細胞癌相關檢測和研究。


圖1. vitronectin水平在正常對照組(Normal)、HBV感染肝硬化組(LC)和HBV相關肝細胞癌組(HCC)患者血清中(每組為30例樣本的混合)的Western blot檢測結果。圖2. vitronectin水平在正常對照30例(N) ,HBV感染肝硬化患者50例(LC) ,HBV 相關肝細胞癌患者52例(HCC，42例AFP陰性、10例AFP陽性)及其它消化道腫瘤患者15 例(T)的血清樣本中的ELISA檢測結果。圖3.肝硬化組和肝細胞癌組血清中vitronectin蛋白水平的ROC曲線分析結果。圖4. vitronectin水平在42例AFP陰性和10例AFP陽性肝細胞癌患者血清中的 ELISA檢測結果。圖5.肝硬化組和AFP陰性肝細胞癌組患者血清中vitronectin蛋白水平的ROC 曲線分析結果。
具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例1、診斷肝細胞癌的試劑盒的設計本發(fā)明的發(fā)明人通過實驗發(fā)現，vitronectin蛋白在肝細胞癌病人血清中的表達量上調，并進一步通過Western blot進一步驗證了該結論，具體的實驗方法如下對正常對照組(健康人)、臨床鑒定為HBV感染肝硬化組和臨床鑒定為HBV相關肝細胞癌組血清中(每組取30例樣本等量混合，混合可消減個體差異、體現平均水平，使結果更有代表性)vitronectin水平進行了 flfestern blot檢測首先對血清樣本進行常規(guī)SDS-PAGE電泳，電轉到硝酸纖維素膜上后放入封閉液(TBST中5%脫脂奶)中封閉lh，在 1 1500 稀釋 vitronectin—抗(Proteintech 公司，15833-1-AP)中 4°C孵育過夜，TBST 洗膜5次，加入1 5000稀釋羊抗兔二抗(KPL公司，074-1516)室溫下孵育lh，TBST緩沖液洗膜5次，ECL試劑盒(Pierce公司)顯色。結果如圖1所示，結果表明，發(fā)現vitronectin蛋白水平在肝硬化組下降、肝細胞癌組回升。該結果表明可以通過檢測vitronectin蛋白表達水平來診斷肝細胞癌。因此，本發(fā)明的發(fā)明人以上述結果為依據，可應用vitronectin蛋白和/或其抗體建立通過檢測vitronectin蛋白表達水平來診斷肝細胞癌的ELISA檢測試劑盒，它包括 固相載體、標記物和可與所述標記物發(fā)生顯色反應的底物；標記物為酶標記vitronectin 蛋白、酶標記vitronectin蛋白抗體、生物素標記vitronectin蛋白或者生物素標記 vitronectin蛋白抗體。具體試劑盒可有下述試劑組成1)酶標板(固相載體)；2)人 vitronectin 標準蛋白；3)標記物；4)樣本稀釋液；5)抗體稀釋液；6)洗液；7)顯色試劑；8)終止液。本領域技術人員已知，以上組分僅是示意性的，所述酶標板可以是一抗包被過的 (用于雙夾心ELISA法、競爭法)或沒有包被過的(用于直接ELISA法)；人vitronectin 標準蛋白可以是富集或表達、合成的全蛋白或包含抗原決定簇的肽段；標記物可以是辣根過氧化物酶標記或生物素標記；顯色試劑可以是TMB、OPD或ABTS等。ELISA方法可以是雙夾心法、直接法或者競爭法。為方便使用，該試劑盒還可包含以下組分中的一種或多種陰性對照，陽性對照，此外還可含有國家行政機關批準的使用說明等。該試劑盒的使用方法如下1)酶標板用vitronectin抗體包被或不包被；2)用樣本稀釋液稀釋人vitronectin標準蛋白至不同濃度，加入酶標板中孵育， 用于制作標準曲線，用樣本稀釋液稀釋人血清樣本至一定濃度，加入酶標板中孵育，用于樣本檢測，孵育后用洗液沖洗；3)標記物用稀釋液稀釋為一定的工作液，加入酶標板中孵育，孵育后用洗液沖洗；4)加酶底物顯色；5)加終止液終止反應；6) OD值測定和結果計算；所用試劑為本領域技術人員所熟知的各種試劑。例如，步驟1)中酶標板可用 vitronectin抗體包被(雙夾心ELISA法)或不包被(直接ELISA法)；步驟3)中所使用標記物可采用辣根過氧化物酶或生物素標記；步驟4)中所使用酶顯色底物可以是3'， 3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺(3 ‘，3'，5'，5'，-tetramethylbenzidine，TMB)、鄰苯二月安(O-phenylenediamine, 0PD)或 ABTS[2，2\ ‘ -azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]等；步驟6)中所用波長與步驟4)中所用顯色底物相對應；步驟1)、2)、3)中的抗體、蛋白或樣本的具體稀釋濃度可做適當調整。vitronectin抗體可使用商品化產品。 ELISA方法可以是雙夾心法、直接法或者競爭法。以下述具體實施例來說明本發(fā)明的原理，驗證本發(fā)明試劑盒的效果。實施例2、利用檢測vitronectin蛋白表達水平的酶聯(lián)免疫試劑盒作為診斷肝細胞癌的試劑盒的效果驗證一、ELISA試劑盒(雙夾心ELISA法)的組成本發(fā)明利用的檢測vitronectin蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒(雙夾心ELISA法， AmericanDiagnostica Inc(ADI) ^^ 803, IMUBIND Vitronectin ELISA) ,1 下述試齊U 1)酶標板(固相載體，已包被vitronectin抗體)；2)人vitronectin蛋白標準溶液vitronectin濃度為110μ g/ml的正常人血漿， 為 GenBank 號 X05006 的 vitronectin 蛋白全長。3) HRP 標記的人 vitronectin 抗體；4)樣本稀釋液；5)洗液；6)顯色底物試劑(底物為TMB)；7)終止液。二、檢測vitronectin蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒診斷肝癌的效果實驗對正常對照30例、HBV感染肝硬化患者50例、HBV相關肝細胞癌患者52例(42例 AFP陰性、10例AFP陽性)及其它消化道腫瘤患者15例的血清樣本中的vitronectin水平進行ELISA檢測，具體方法如下1、分別取 vitronectin 標準蛋白 0ng/ml、6. 88ng/ml、13. 75ng/ml、27. 5ng/ml、 55ng/ml和llOng/ml溶液100 μ 1加入包被抗體的酶標板，每個梯度做2個平行孔，用于制
作標準曲線。2、正常對照組(健康人30例；N)、肝硬化組(臨床鑒定為HBV感染肝硬化患者的 50例患者；LC)、肝細胞癌組(臨床鑒定為HBV感染肝細胞癌的患者，其中AFP陰性42例、 AFP陽性10例；HCC)及其它消化道腫瘤組(臨床鑒定為消化道腫瘤而未患肝癌的患者15 例；Τ)的血清樣本，各取2μ1用樣本稀釋液稀釋后(稀釋倍數為正常對照組1 5000、肝硬化組1 4000、肝細胞癌組1 4000)，每例樣本取100 μ 1加入包被抗體的酶標板，每個樣本做2個平行孔。以只加入樣本稀釋液的孔作為陰性對照。3、上述樣本室溫(18_25°C )水平搖床Q50rpm)孵育Ih后，每孔加350 μ 1洗液洗滌4次，每次3分鐘。4、每孔加入HRP標記的人vitronectin抗體100 μ 1，室溫(18-25°C )水平搖床 (250rpm)孵育Ih后，每孔加350ul洗液洗滌4次，每次3分鐘。5、加入顯色底物試劑100 μ 1/孔，室溫(18-25°C )顯色5_10分鐘；加入終止液 50 μ 1/孔，450nm波長測定各孔樣本的OD值。6、通過標準品濃度和OD值繪制標準曲線，通過各孔血清樣本所測得的OD值，計算
9各血清樣本中vitronectin蛋白的含量。結果如圖2所示，結果表明，vitronectin蛋白水平在肝硬化組下降、肝細胞癌組回升，其中正常對照組vitronectin蛋白的濃度平均值為128. 21 μ g/ml，肝硬化組為 56. 19 μ g/ml，肝細胞癌組為104. 07 μ g/ml，對各組樣本中vitronectin蛋白含量進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現肝硬化組和肝細胞癌組血清vitronectin蛋白水平有顯著性差異。7、對肝硬化組和肝細胞癌組血清vitronectin蛋白水平進行ROC曲線分析通過GraphPad Prism軟件對肝硬化組和肝細胞癌組血清vitronectin蛋白水平進行ROC曲線分析，以肝硬化組為對照組、肝細胞癌組為疾病組，AUC = 0. 8781 (如圖3所示)。根據約登指數(靈敏度+特異度-1)計算最佳工作點，當以vitronectin蛋白濃度> 79 μ g/ml為判定肝細胞癌的閾值時，靈敏度為88%、特異度為80%。上述147例人體血清樣本的ELISA驗證，具有很高的可信性。上述結果說明vitronectin是可用于肝細胞癌和肝硬化患者判別診斷的潛在標志物。8,AFP陰性和AFP陽性肝細胞癌組血清vitronectin蛋白水平及其ROC曲線對比對比步驟3獲得的AFP陰性(40例)和AFP陽性(10例)肝細胞癌組血清 vitronectin蛋白水平數據，無顯著性差異(如圖4所示)。對肝硬化組和AFP陰性肝細胞癌組血清vitronectin蛋白水平進行ROC曲線分析，以肝硬化組為對照組、AFP陰性肝細胞癌組為疾病組，AUC = 0. 88 (如圖5所示)。上述結果說明vitronectin可用于AFP陰性肝細胞癌和肝硬化患者的判別診斷。綜上實驗結論表明，Vitronectin蛋白在肝細胞癌患者血清中較肝硬化患者有明顯高表達，而且表達水平不依賴于AFP，因此本發(fā)明利用檢測vitronectin蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒作為診斷肝癌的試劑盒，或者直接利用vitronectin蛋白和/或vitronectin蛋白抗體制備通過檢測vitronectin蛋白濃度來診斷肝癌的試劑盒，在肝細胞癌特別是AFP陰性肝細胞癌臨床檢驗方面具有應用價值。
權利要求
1.檢測vitronectin蛋白表達水平的試劑盒在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述檢測vitronectin蛋白表達水平的試劑盒為酶聯(lián)免疫試劑盒。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述檢測vitronectin蛋白表達水平的試劑盒包括vitronectin蛋白和/或vitronectin蛋白抗體和/或vitronectin蛋白的標記物和/或vitronectin蛋白抗體的標記物。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述檢測vitronectin蛋白表達水平的試劑盒為American Diagnostica Inc公司生產的貨號為803的酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑盒名稱為 IMUBIND Vitronectin ELISA。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的應用，其特征在于所述肝細胞癌為HBV感染引起的肝細胞癌。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的應用，其特征在于所述肝細胞癌為AFP陰性的肝細胞癌。
7.vitronectin蛋白抗體在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述vitronectin蛋白抗體為單克隆抗體或者多克隆抗體，所述單克隆抗體為體外培養(yǎng)雜交瘤細胞系獲得的抗體或者商業(yè)途徑獲得的抗體，所述多克隆抗體為商業(yè)途徑獲得的抗體。
9.vitronectin蛋白在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測vitronectin蛋白表達水平的試劑盒在制備診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用。所述檢測vitronectin蛋白表達水平的試劑盒為酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明通過檢測vitronectin蛋白濃度的試劑盒來制備診斷肝癌的試劑盒，在肝細胞癌特別是AFP陰性肝細胞癌臨床檢驗方面具有突出的應用價值。
文檔編號G01N33/543GK102213722SQ20101014133
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權日2010年4月6日
發(fā)明者姜穎, 孫薇, 孫龍欽, 牟勁松, 王慧芬, 賀福初, 趙曉航, 邢寶才, 陳喜林, 高紅軍, 魏漢東 申請人:北京蛋白質組研究中心