專利名稱：一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米修飾電極和生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極及其制作方法。
背景技術(shù)：
阿特拉津自1952年由瑞士 Ciki-Geigy化學(xué)公司開發(fā)生產(chǎn)以來，由于其高效等特性，成為了全世界應(yīng)用最為廣泛的除草劑之一。據(jù)研究表明，阿特拉津是一種內(nèi)分泌干擾物，在低濃度下可能存在對機(jī)體產(chǎn)生亞急性損傷的潛在危害。近年，在很多地區(qū)的地下水和地表水中檢都測到了阿特拉津殘余。于是，迫切需要建立一種快速、高靈敏的檢測低濃度的阿特拉津的方法。傳統(tǒng)的阿特拉津分析方法(如薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用等)雖然可以達(dá)到痕量檢測水平，但是其檢測程序復(fù)雜、耗時(shí)，并且儀器昂貴。由于電化學(xué)傳感器制作簡單，可在渾濁液中檢測，容易小型化，靈敏度高，被用來檢測低濃度的阿特拉津等污染物。近年來，尤其酶生物傳感器發(fā)展非常迅速。但是，由于酶的高度不穩(wěn)定性，并且容易形成中間產(chǎn)物阻礙酶反應(yīng)及污染電極，進(jìn)一步提高靈敏度成為大多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，我們設(shè)想構(gòu)筑一種高靈敏的、穩(wěn)定的、制作簡單、價(jià)格低廉的阿特拉津電化學(xué)生物傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種超高靈敏的、制備簡單、成本低廉、檢測速度快的用于檢測阿特拉津的生物傳感電極及其制作方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極，其特征在于，該傳感電極以鈦板為基體電極，鈦板表面生長的直立有序的二氧化鈦納米管及在管內(nèi)和表面修飾的酪氨酸酶。—種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極的制作方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)鈦板表面二氧化鈦納米管電極的制備將純鈦板依次用100#、300#和500#砂紙打磨，然后用金相砂紙進(jìn)一步拋光，使純鈦板表面平滑成鏡面，接著在蒸餾水和丙酮中各超聲清洗15min，再二次蒸餾水清洗干凈后，將鈦板浸泡在濃度為10wt%草酸中微沸蝕刻 1. 5h,然后用二次蒸餾水將鈦板清洗干凈并吹干，在室溫下，將預(yù)處理過的鈦板作為陽極， 鉬片電極作為對電極，先用濃度為0. 5wt%的氫氟酸做電解液，20V下預(yù)處理lh，再以水、氟化銨和乙二醇的混合溶液作為電解液，20V下進(jìn)行陽極化氧化池，取出鈦板用二次蒸餾水清洗干凈后在氮?dú)鈿夥罩懈稍?，然后置于管式爐中在氧氣氣氛中進(jìn)行熱處理，得到表面含二氧化鈦納米管的鈦板；(2)鈦板表面二氧化鈦納米管電極的預(yù)處理在2mol/L的NH4Cl溶液中，以表面含二氧化鈦納米管的鈦板作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，于-1. 5V恒電位下還原預(yù)處理3s ；(3)酪氨酸酶的固定配置含10mg/ml的酪氨酸酶的pH為7. O的磷酸緩沖液，采用微量注射器取20 μ L 50U · μ Γ1的酪氨酸酶溶液和5 μ L 2. 5wt%的戊二醛覆蓋在工作電極表面，整個(gè)工作電極表面都涂好溶液后，將工作電極在氮?dú)鈿夥障赂稍?，從而制備得到固定了致密酪氨酸酶的用于檢測阿特拉津的生物傳感電極，放入4°C冰箱中保存待用。所述步驟(1)中的混合溶液中水、氟化銨和乙二醇的重量比為1 0. 25 98. 75。所述步驟(1)中的熱處理包括以下步驟控制升溫速率為1°C /min將管式爐的溫度由室溫升至500°C，然后在500°C恒溫證，最后以1°C /min的速率將管式爐降至室溫即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在鈦板上直立有序的TiO2-NTs上固定了酪氨酸酶制備得到Tyr/Ti02-NTs，獲得了優(yōu)異的穩(wěn)定性能和超高的靈敏度，與傳統(tǒng)技術(shù)和現(xiàn)有生物傳感器相比，其具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)與傳統(tǒng)的分析方法相比，此傳感器制備簡單，成本低廉，檢測速度快；(2)與現(xiàn)有生物傳感器相比，本發(fā)明采用了直立于鈦板上的直立有序TiO2-NTs為基體電極材料，首先這種材料生物兼容性和親水性好，有利于生物分子的固定，再者，這種納米管陣列高度有序，物理化學(xué)性能穩(wěn)定，能夠提供很大的比表面積和自由空間，其多孔管式結(jié)構(gòu)更有利于酪氨酸酶分子的負(fù)載，加大了酪氨酸酶分子的負(fù)載量，有利于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，同時(shí)，原位生長的直立TiO2-NTs制備工藝更加簡便、經(jīng)濟(jì)。


圖1為本發(fā)明制備的生物傳感電極在阿特拉津中的抑制曲線；圖2本發(fā)明制備的用于檢測阿特拉津的生物傳感電極和HPLC對土壤中阿特拉津的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例一種超高靈敏的阿特拉津生物傳感電極，該傳感電極以鈦板為基體電極，鈦板表面生長的直立有序的二氧化鈦納米管及在管內(nèi)和表面修飾的酪氨酸酶。具體制作過程如下將純鈦板(直徑0. 5mm)依次用100#，300#和500#砂紙打磨，然后用金相砂紙進(jìn)一步拋光，使基體表面平滑成鏡面，接著在蒸餾水和丙酮中各超聲清洗15分鐘。用二次蒸餾水清洗干凈后，將鈦板首先在10wt%草酸中微沸蝕刻1. 5小時(shí)，然后再將鈦板用二次蒸餾水清洗干凈并吹干。在室溫下，將預(yù)處理過的鈦片作為陽極，鉬片電極作為對電極，先用 wt. 0.5%的氫氟酸做電解液，20V下預(yù)處理1小時(shí)；再以水(wt. )、氟化銨(0. 25% )和乙二醇(98.75%)的混合溶液作為電解液，20V下進(jìn)行陽極化氧化3小時(shí)。取出電極用二次蒸餾水清洗干凈后在氮?dú)鈿夥罩懈稍?，然后置于管式爐中在氧氣氣氛中進(jìn)行熱處理。采用如下程序進(jìn)行熱處理首先，升溫速率1°C /分鐘由室溫升至500°C，然后在500°C恒溫5 小時(shí)，最后同樣以1°C /分鐘的速率降至室溫，最后制備得到鈦板基體表面直立生長的二氧化鈦納米管電極。在2mol/L的NH4Cl溶液中，以鈦板表面二氧化鈦納米管電極作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，于-1.5V恒電位下還原預(yù)處理3秒鐘。配置含10mg/ml的酪氨酸酶的pH為7. O的磷酸緩沖液PBS，然后采用微量注射器取20μ L 50U · μ L—1的酪氨酸酶溶液和5μ L 2. 5%的戊二醛覆蓋在電極表面，整個(gè)電極表面都涂好溶液后，將電極在氮?dú)鈿夥障赂稍铮瑥亩苽涞玫焦潭酥旅芾野彼崦傅挠糜跈z測阿特拉津的生物傳感電極Tyr/Ti02-NTs，放入4°C冰箱中保存待用。以得到的用于Tyr/Ti02-NTs作為工作電極，鉬絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，建立三電極體系。電解池中電解液為含0. ImM對甲酚的pH為7.0&PBS。電化學(xué)測定中應(yīng)攪拌，并通入氧氣。用CHI660電化學(xué)工作站對所述的三電極體系進(jìn)行數(shù)據(jù)控制傳輸，采用循環(huán)伏安法對電化學(xué)行為進(jìn)行考察，連續(xù)20圈內(nèi)，還原法峰電流響應(yīng)值為0. 22mA, 標(biāo)準(zhǔn)偏差為4. 2%。放入4°C冰箱4周后，再次考察，峰電流為原來的90%。對于阿特拉津，用含阿特拉津IOppm的標(biāo)準(zhǔn)樣品用PBS逐漸稀釋至2ppt，分別將傳感器進(jìn)入阿特拉津溶液中IOmin后，測定酶抑制率見圖1。我們可以看出，該生物傳感器的檢測范圍為0.2ppt-10ppm，在0.2-10ppt范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為= 8. 461+2. 741C(ppt)，相關(guān)系數(shù)為 0. 9996，檢測限為 0. Ippt0用PVC板圍住ImX Im的試驗(yàn)小區(qū)，試驗(yàn)小區(qū)在一個(gè)500m2的沒有噴灑農(nóng)藥歷史的水稻土地區(qū)。試驗(yàn)前，采集空白土壤樣品做對照樣品。將250mg阿特拉津溶于IL水中(加入少量丙酮助溶)，均勻噴灑在土壤表面，平衡Mh。然后，模擬降雨40ml，直至表層積水完全入滲后，平衡Mh，采集土壤樣品。土壤樣品按下述方法采集。試驗(yàn)小區(qū)分成4小塊，每塊分成 4 等分，在深度為 0-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-60，60_70cm 土壤層中取土壤樣品。土壤在室溫下自然風(fēng)干，碾碎后過篩，取土樣10g，于250mL錐形瓶中，加入50mL丙酮， 浸泡他后，振蕩lh。沉清后，其上清液根據(jù)檢測方法分為以下兩種處理程序。(1)用于生物傳感器時(shí)，只取上清液30ml，直接加入PBS中使用傳感器檢測。( 用于HPLC檢測時(shí)，將上清液導(dǎo)入鋪有二層濾紙及一薄層助濾劑的布氏漏斗減壓抽濾，然后加入少量無水硫酸鈉去水，重復(fù)上述抽濾，取濾液30ml，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴中減壓蒸致近干，然后用丙酮定容致 2mL·所有樣品置于4°C冰箱中以備檢測。以實(shí)施例1得到的Tyr/Ti02_NTs和HPLC分別檢測的結(jié)果見圖2。兩種方法檢測的誤差小于5%。并且該阿特拉津電化學(xué)生物傳感器對阿特拉津的檢測比HPLC檢測法更為靈敏。非常重要的是，用該傳感器檢測時(shí)，樣品的預(yù)處理過程大大簡化，既縮短了檢測的時(shí)間，又減少了復(fù)雜過程中造成的誤差。由此表明，利用該生物傳感器檢測土壤中的阿特拉津具有良好的效果。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極，其特征在于，該傳感電極以鈦板為基體電極，鈦板表面生長的直立有序的二氧化鈦納米管及在管內(nèi)和表面修飾的酪氨酸酶。
2.一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極的制作方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)鈦板表面二氧化鈦納米管電極的制備將純鈦板依次用100#、300#和500#砂紙打磨，然后用金相砂紙進(jìn)一步拋光，使純鈦板表面平滑成鏡面，接著在蒸餾水和丙酮中各超聲清洗15min，再二次蒸餾水清洗干凈后，將鈦板浸泡在濃度為10wt%草酸中微沸蝕刻1.證，然后用二次蒸餾水將鈦板清洗干凈并吹干， 在室溫下，將預(yù)處理過的鈦板作為陽極，鉬片電極作為對電極，先用濃度為0. 5wt%的氫氟酸做電解液，20V下預(yù)處理lh，再以水、氟化銨和乙二醇的混合溶液作為電解液，20V下進(jìn)行陽極化氧化池，取出鈦板用二次蒸餾水清洗干凈后在氮?dú)鈿夥罩懈稍铮缓笾糜诠苁綘t中在氧氣氣氛中進(jìn)行熱處理，得到表面含二氧化鈦納米管的鈦板；(2)鈦板表面二氧化鈦納米管電極的預(yù)處理在2mol/L的NH4Cl溶液中，以表面含二氧化鈦納米管的鈦板作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉬絲電極作為對電極，于-1.5V恒電位下還原預(yù)處理3s ；(3)酪氨酸酶的固定配置含10mg/ml的酪氨酸酶的pH為7.0的磷酸緩沖液，采用微量注射器取20 μ L 50U · μ廠1的酪氨酸酶溶液和5μ L 2. 5wt%的戊二醛覆蓋在工作電極表面，整個(gè)工作電極表面都涂好溶液后，將工作電極在氮?dú)鈿夥障赂稍?，從而制備得到固定了致密酪氨酸酶的用于檢測阿特拉津的生物傳感電極，放入4°C冰箱中保存待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極的制作方法，其特征在于，所述步驟(1)中的混合溶液中水、氟化銨和乙二醇的重量比為1 0.25 98.75。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極的制作方法，其特征在于，所述步驟(1)中的熱處理包括以下步驟控制升溫速率為1°C /min將管式爐的溫度由室溫升至500°C，然后在500°C恒溫釙，最后以1°C /min的速率將管式爐降至室溫即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測阿特拉津的生物傳感電極及其制作方法，該生物傳感電極由鈦板、鈦板表面生長的直立有序的二氧化鈦納米管及在管內(nèi)和表面修飾的酪氨酸酶組成，采用陽極氧化法在鈦板表面生長直立有序的二氧化鈦納米管，制備得到鈦板表面二氧化鈦納米管電極(TiO2-NTs)；然后在2mol/L的NH4C1溶液中，于-1.5V恒電位下預(yù)處理3秒鐘；再用微量注射器取20μL 50U·μL-1的酪氨酸酶溶液和5μL 2.5％的戊二醛覆蓋在電極表面，制備得到Tyr/TiO2-NTs。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備方法簡單，成本低，重現(xiàn)性好，用于檢測環(huán)境中低濃度阿特拉津的檢測穩(wěn)定性好、檢測范圍為0.2ppt-10ppm，檢測限為0.1ppt。
文檔編號G01N27/327GK102297887SQ20101020949
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者余志敏, 劉梅川, 吳濤, 張重寧, 趙國華 申請人:同濟(jì)大學(xué)