專利名稱：一種檢測甲苯胺紅的間接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫和食品安全領(lǐng)域中違禁添加劑檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，具體而 言，本發(fā)明涉及一種用于檢測對位紅的間接競爭法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
甲苯胺紅與對位紅一樣同屬于偶氮系列化工合成染色劑，主要應(yīng)用于油彩顏料及 橡膠制品的著色，常溫下呈固態(tài)。由于其結(jié)構(gòu)(見下圖)與致癌物蘇丹紅相似，在代謝過程 中偶氮苯可被降解，產(chǎn)生苯胺，苯胺可直接作用于肝細胞，引起中毒性肝病，長期攝入苯胺 可造成人體的神經(jīng)系統(tǒng)損害，并具有潛在的致癌性，因此被禁止用于食品生產(chǎn)。 由于添加甲苯胺紅后可使辣椒制品、番茄制品以及香腸等食品長期保持鮮艷光亮 的櫻桃紅色，增加了產(chǎn)品的外觀新鮮度，而且在偶氮染料中價格相對便宜，可大幅降低生產(chǎn) 成本，因而被不法商家作為食品添加劑使用，以吸引消費者，雖屢禁而不止，給消費者帶來 巨大的危害。( 二 )相關(guān)國家標準的檢測方法現(xiàn)狀目前國內(nèi)仍沒有針對甲苯胺紅的檢測方法標準，其日常檢測主要參考蘇丹紅的方 法標準(GB/T 19681-2005)，采用溶劑萃取，液相色譜測定。國外實驗室甲苯胺紅的檢測， 則常采用液相、氣相色譜法或與質(zhì)譜聯(lián)用進行定性、定量。這些方法具有檢測精度高、靈敏、 準確、穩(wěn)定等一系列優(yōu)點，但設(shè)備及檢測費用昂貴、操作復雜、分析時間長，不能實現(xiàn)現(xiàn)場檢 測，限制了其推廣和應(yīng)用，也給甲苯胺紅的快速檢測和監(jiān)管帶來困難。目前國內(nèi)外還沒有專 門針對甲苯胺紅的快速免疫檢測方法報道，因而建立高靈敏度的甲苯胺紅快速檢測技術(shù)成 為當務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測甲苯胺紅的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明提供了一種快速檢測甲苯胺紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括甲苯胺 紅特異性抗體、甲苯胺紅_載體蛋白偶聯(lián)物和酶標二抗。其中甲苯胺紅特異性抗體為甲苯 胺紅的多克隆抗體或單克隆抗體，可用甲苯胺紅與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動物(例如兔或鼠)制得。所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或匙孔 銅蘭蛋白(KLH)。所述的對位紅_載體蛋白偶聯(lián)物采用化學方法偶聯(lián)得到。所述酶標二抗 的標記酶為辣根過氧化物酶，所述酶標二抗可以用商品化的辣根過氧化物酶酶標二抗，也 可以通過過碘酸鈉法或戊二醛法將辣根過氧化物酶與二抗偶聯(lián)制得。在本發(fā)明的一個優(yōu)選 實施方案中，所述酶標二抗為酶標羊抗兔IgG抗體或酶標羊抗鼠抗體。用于制備所述酶標板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙 烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。為方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進一步包括包被有對位紅抗 原的酶標板、對位紅標準溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。所述的濃縮洗滌液為0. 5%吐溫-20 10倍磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑 A液和顯色劑B液組成(例如，使用體積比為1 1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲， 顯色劑B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0. 吐溫-20的10 倍磷酸鹽緩沖液。另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測飼料、水產(chǎn)品或食品樣品中對位紅含量的方 法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有對位紅抗原的酶標板 孔中加入標準品或樣品溶液，再加入抗甲苯胺紅多克隆或單克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加 入酶標記二抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為將甲苯胺紅抗原吸附于固相載體上，加入樣本或甲苯胺紅標準品溶液并加入甲苯 胺紅抗體工作液，待測樣品中甲苯胺紅和固相載體上包被的甲苯胺紅抗原競爭甲苯胺紅抗 體，再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值 與樣品中甲苯胺紅的量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出甲苯胺紅濃度范圍。有益效果本發(fā)明檢測甲苯胺紅的試劑盒主要采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法定性或定 量測定樣品中甲苯胺紅含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢 測大批樣品。本發(fā)明中，該試劑盒采用高特異性的甲苯胺紅多克隆或單克隆抗體，主要試劑以 工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時間并降低因操作步驟冗繁 造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準確度、對儀器設(shè)備要求低、試 劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素污染的等優(yōu)點，可在飼料及動物源性產(chǎn)品檢 測中發(fā)揮重要作用。


附圖為甲苯胺紅檢測曲線，其中系列1是lyg/ml-l 20000組合，系列2是 0. 5 μ g/ml-1 10000 組合，系列 3 是 0. 25μ g/ml-1 5000 組合。。
4實施例提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護 范圍構(gòu)成任何限制。實施例1免疫原的合成及多克隆、單克隆抗體制備1. 1試劑與儀器甲苯胺紅(德國Dr)，琥珀酸酐(Sigma公司)，吡啶(Sigma公司)，EDC(上海共價 化學試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)、匙鑰孔血藍蛋白(KLH，Sigma公司)，辣根過氧化物 酶(HRP)(上海楷洋生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為分析純。雙光束紫外可見分光光度儀(TU-1909，北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置 (3057型便攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數(shù)控計滴器，恒流泵，自動部分收集器，層 析柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學儀器有限公司)，臺式離心機 (Minispin 最大轉(zhuǎn)速 13400rpm 最大離心力 12100rcf, 2ml X 12)。1. 2甲苯胺紅人工抗原的合成1.2.1免疫原的合成稱取25毫克(0. Immol)甲苯胺紅溶于5ml吡啶中，充分攪拌使其完全溶解，加入 10毫克琥珀酸酐，室溫攪拌24小時，N2吹干，以一定體積DMSO復溶稱取50毫克KLH，以0. lmol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO充分攪拌，使其占總?cè)?液的50%，將琥珀酸酐化的對位紅加入到KLH溶液中，以加入EDC 0. 2-0. 3M (約IOOmg)，攪 拌反應(yīng)過夜。然后，將偶聯(lián)物過S印hadeXG-25M凝膠層析純化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床體 積平衡，調(diào)節(jié)流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯(lián)物， 洗脫液用 PH 7. 4 0. OlM PBS。提純后的免疫原分裝后_20°C凍存。1.2. 2包被抗原的合成稱取25毫克(0. Immol)的對位紅溶于5ml無水吡啶中，加入10毫克琥珀酸酐，室 溫下攪拌24小時，N2吹干，以一定體積DMSO復溶。稱取40毫克卵清蛋白(OVA)，以0. lmol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO充分攪拌，使 其占總?cè)芤旱?0%，將琥珀酸酐活化的甲苯胺紅加入到OVA溶液中，加入EDC 0. 2-0. 3M(約 100-150mg)，攪拌反應(yīng)過夜。然后，將偶聯(lián)物過S印hadeXG-25M凝膠層析純化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床體 積平衡，調(diào)節(jié)流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯(lián)物， 洗脫液用 PH 7. 4 0. OlM PBS。提純后的包被抗原加等量甘油，分裝后_20°C保存。1. 3單克隆或多克隆抗體的制備將上述甲苯胺紅-KLH偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選取5只BLBE/C小鼠，將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油 包水的乳濁液，按IOOug/只的進行首次免疫，采取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫 一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始， 每次免疫后10天，尾靜脈取血進行抗體特異性檢測，抗體符合要求后準備細胞融合，在細胞融合前3天加強免疫一次，然后取脾臟融合。然后按照單克隆細胞株的篩選培養(yǎng)程序進 行陽性細胞株的制備。然后將符合要求的細胞株注入小鼠腹腔，制備單克隆抗體腹水。用同樣的免疫程序，免疫5只日本大耳白兔，制備多克隆的抗體。3免一周后采血 清測定抗體滴度和特異性，4免一周后取全血清。用硫酸銨沉淀法提純抗體，過S印hadeX-G25柱除去硫酸銨。所得抗體用于效價和 特異性測定。1. 4抗體效價和特異性測定1. 4. 1間接ELISA檢測抗體效價以10 μ g/ml的甲苯胺紅-OVA按每孔100 μ 1包被酶標板，4°C包被24h，洗滌5次， 拍干，每孔加入200μ1 2%的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液(封閉液)，4°C下封閉12h，洗滌 3次，拍干。加入不同稀釋倍數(shù)的抗體ΙΟΟμ 1，37°C孵育2h，洗滌三次，立即加入ΙΟΟμ 1酶 標羊抗兔或羊抗鼠抗體，37°C孵育30min，洗滌三次，加50 μ 1顯色劑A液和50 μ 1顯色劑B 液，室溫避光作用15min，加50 μ 1終止液終止反應(yīng)，酶標儀檢測OD值(450nm)。同時設(shè)置 陰性對照孔和平行重復孔?？贵w溶液以1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000 倍稀釋。以兩倍于陰性血清OD值的抗血清OD值對應(yīng)的抗體稀釋度為抗體效價。檢測結(jié)果 見表-1表-1抗體效價檢測結(jié)果(平均OD值) 據(jù)上表數(shù)據(jù)可以確定抗體效價為32000以上，滿足實驗要求。1. 4. 2間接競爭ELISA檢測抗體特異性ELISA操作方法同1. 4. 1。每孔加入100 μ 1不同濃度的游離甲苯胺紅與包被物 競爭隨后加入抗體溶液，得出不同的OD值。根據(jù)1.4. 1的結(jié)果，所用抗體最佳濃度約為 1 5000。甲苯胺紅抑制濃度系列值和抗體的IC5tl值結(jié)果見表-2，(以0抑制孔的OD值 為最大值Btl，其它抑制濃度孔OD值為B，Β/Β0 = 50%時對應(yīng)的對位紅濃度為此抗體的IC5tl 值。)由表中數(shù)據(jù)可知，甲苯胺紅抗血清IC5tl值在9 μ g/L左右。表-2抗體特異性檢測結(jié)果(0D平均值) 實施例2間接競爭ELISA方法的建立2. 1 ELISA棋盤法確定包被抗原和抗體最佳工作濃度將 ΙΟΟμ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml、0· 5 μ g/ml、0· 25 μ g/ml >0. 125 μ g/ml 系列濃度的甲苯胺紅-OVA按每孔100 μ 1包被酶標板，4°C包被24h，用洗液洗滌4次，在吸水紙上 拍干，每孔用200μ1封閉液4°C下封閉12h，洗滌3次，在吸水紙上拍干。加入1 1000， 1 2000,1 4000,1 6000,1 8000,1 10000 稀釋的抗體溶液 100 μ 1，室溫作用 lh， 洗滌4次，立即加入100 μ 1酶標羊抗兔(或羊抗鼠)抗體，室溫作用30min，洗滌三次，加 50 μ 1顯色劑A液和50 μ 1顯色劑B液，室溫避光作用lOmin，每孔加入50 μ 1終止液終止 反應(yīng)，酶標儀檢測A值(450nm)。同時設(shè)置陰性對照孔和平行重復孔，取OD值為1. 7左右 時對應(yīng)的包被抗原和抗體濃度組合做抑制曲線，選取最佳曲線的濃度組合。試驗數(shù)據(jù)列于 表_3。 表-3
包被濃度 ug/mi 100 10 10.5 0.25 0.125 空白
抗體濃度_
1:1000 3.283 3.016 2.721 2.425 1.813 0.76 0.055
1:2000 3.06 3.052 2.563 2.137 1.517 0.51 0.056- 取包被濃度分別為lyg/mLO. 5μβ/πι1，0. 25μβ/πι1對應(yīng)的抗體稀釋度為 1 6000，1 4000，1 2000 做抑制曲線，抑制濃度分別為(^8/1、148/1、3 48/1、9口8/ L、27y g/L、81y g/L，得抑制曲線如附圖1。其中，系列1是1 μ g/ml-1 6000組合，系列2 是 0. 5yg/ml-l 4000 組合，系列 3 是 0. 25 μ g/ml-1 2000 組合。結(jié)果表明系列1，SP 1 μ g/ml—1 6000組合所得的曲線為最佳曲線。實施例3甲苯胺紅間接競爭酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測甲苯胺紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被甲苯胺紅抗原的酶標板；(2)抗甲苯胺紅單克隆或多克隆抗體工作液；(3)用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠抗體；(4)甲苯胺紅標準品溶液6瓶，濃度分別為:0yg/LUyg/L,3yg/L,9yg/L, 27μ g/L、81y g/L ；(5)底物顯色液A液為過氧化脲或過氧化氫，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰
苯二胺；(6)濃縮洗滌液為含0. 5 %吐溫20的10倍磷酸鹽緩沖液；(7)濃縮樣品稀釋液為0. 吐溫-20的10倍磷酸鹽緩沖液；(8)終止液為2mol/L的硫酸溶液。實施例4試劑盒精密度試驗例為標準可重復性試驗。具體操作為從每批實施例2或3中的方法制備的酶標板中，各抽取10個孔，測定9 μ g/L的標 準溶液的吸光度值(OD)，重復3次，計算變異系數(shù)CV%。結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在1. 5-7. 5%之間，說明本試劑盒標準品精密度達到了要 求。實施例5試劑盒的回收率試驗取兩個濃度的甲苯胺紅標樣，對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分 別計算回收率。結(jié)果表明飼料中的添加回收率為60% -75%。實施例6試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2_8°C，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、 50%抑制濃度、甲苯胺紅添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會 有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存條件下放置兩周，進行加速老化實驗，結(jié)果表 明該試劑盒各項指標完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入_20°C冰箱 冷凍5天，測定結(jié)果表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8°C 保存12個月以上。實施例7樣品中甲苯胺紅殘留的檢測1、樣品前處理準確稱取5g辣椒醬樣品于40ml離心管中。加入20mlDMS0，充分振蕩10分鐘， 4000rpm 離心 lOmin，取上清 5ml。2、用試劑盒進行檢測向甲苯胺紅-OVA偶聯(lián)物包被的酶標板微孔中加系列標準品或樣品溶液100 μ 1， 再加入抗體工作液50μ 1，室溫反應(yīng)1小時。倒出孔中液體，每孔加入250μ 1經(jīng)10倍稀釋了 的洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板4次，在吸水紙上拍干。每孔加入酶 標記羊抗兔(或酶標羊抗鼠)抗體ΙΟΟμ 1，避光室溫孵育30min。倒出孔中液體，每孔加入 250 μ 1經(jīng)10倍稀釋了的洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復操作共洗板4次，在吸水 紙上拍干。加入底物顯色液A液50 μ 1，B液50 μ 1，輕輕振蕩混勻，室溫避光顯色lOmin，每 孔加入終止液(2mol/L鹽酸)50μ1，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。結(jié)果分析計算百分吸光度值并繪制標準曲線，相對應(yīng)每一個樣品中甲苯胺紅的濃度可以從 標準曲線上讀出，也可以用回歸方程法計算出在樣本中甲苯胺紅的含量。利用專業(yè)電腦軟 件更便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標準溶液顏 色的比較，可以判斷出樣本中甲苯胺紅的濃度范圍。
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權(quán)利要求
一種檢測甲苯胺紅的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括甲苯胺紅特異性抗體、甲苯胺紅 載體蛋白偶聯(lián)物和酶標二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括包被有甲 苯胺紅抗原的酶標板、甲苯胺紅標準溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述甲苯胺紅特異性抗 體為單克隆抗體或多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的載體蛋白為牛血 清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標二抗的標記 用酶為辣根過氧化物酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標二抗為羊抗 兔IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含有 0. 05% -0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的底物顯色劑由顯色劑A 和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的濃縮樣品稀釋液為含 0. 吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
10.一種檢測樣品中甲苯胺紅含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有甲苯胺紅抗原的酶標板孔 中加入標準品或樣品溶液，再加入抗甲苯胺紅多克隆抗體或單克隆抗體工作溶液，孵育后 洗滌拍干，加入酶標記二抗(羊抗兔或羊抗鼠)，孵育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測 定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種檢測甲苯胺紅的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的甲苯胺紅的酶聯(lián)免疫試劑盒包括甲苯胺紅特異性單克隆或多克隆抗體、甲苯胺紅與載體蛋白的偶聯(lián)物、酶標二抗。本發(fā)明的檢測甲苯胺紅酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準確性等特點，可快速檢測食品中殘留的對位紅。
文檔編號G01N33/543GK101915843SQ201010240040
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者于洪俠, 張妍, 張薇薇, 楊曙明, 程瑪麗, 邱靜, 陳剛, 陳愛亮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所