專利名稱：一種蟲草菌絲體中粗多糖含量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種粗多糖的測(cè)定方法，特別是涉及一種蟲草菌絲中粗多糖含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
蟲草多糖是蟲草體內(nèi)含量最豐富、最重要的生物活性物質(zhì)之一，蟲草多糖是由甘露糖、蟲草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、巖藻糖組成的多聚糖。大量醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蟲草多糖可活化巨噬細(xì)胞，刺激抗體產(chǎn)生，提高人體免疫能力，升高白細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)，并具有抗腫瘤、抗輻射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、潤(rùn)肺和延緩衰老等藥理作用， 此外，蟲草多糖還能抗心律失常，抗心肌缺血，擴(kuò)張外周血管，降壓，降血脂，抑制血小板聚集。目前，蟲草菌絲體中的粗多糖含量的測(cè)定方法通常采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法，均是以葡萄糖或葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而對(duì)蟲草菌絲體樣品中的粗多糖含量進(jìn)行定量。其步驟主要包括1、對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理；2、繪制葡萄糖或葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；3、通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定樣品的含量；為了使得測(cè)定的結(jié)果能夠反應(yīng)蟲草菌絲體中粗多糖的真實(shí)含量，對(duì)不同批次樣品進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，均需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。這種方法即耗時(shí)又消耗實(shí)驗(yàn)試劑；另外在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)還會(huì)因稱量、定容、稀釋等操作步驟產(chǎn)生人為誤差，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定蟲草菌絲體中粗多糖的含量，操作方法簡(jiǎn)便、人為誤差少的蟲草菌絲中粗多糖含量的測(cè)定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種蟲草菌絲體中粗多糖的測(cè)定方法，包括如下步驟(1)供試品溶液的制備a、稱取m克的蟲草菌絲體供試品，置于體積為V1HiL的容量瓶中，加入所述V1HiL容量瓶體積的2/3的蒸餾水，在100°C恒溫水浴中浸提3-8小時(shí)，定容至V1HiL,過(guò)濾，除去不溶雜質(zhì)，收集濾液；b、吸取濾液V2mL，加入4倍于V2ml的無(wú)水乙醇，用于沉淀濾液中的多糖，醇沉6_8 小時(shí)，離心，收集多糖沉淀；C、將所述多糖沉淀溶于V3HiL蒸餾水中，使沉淀溶解，即得到供試品溶液；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備a、將純度大于99. 0%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于80°C干燥至恒重，精確稱取0. Olg，置于 IOOml容量瓶中，加入80ml蒸餾水，超聲15分鐘，使葡萄糖充分溶解，放冷至室溫，定容搖勻，即得0. 10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；b、精密吸取所述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 OmUO. 20ml,0. 40ml,0. 60ml、0. 80ml、1. 0ml，分別置于6個(gè)IOml具塞試管中，分別加蒸餾水使體積為1. 0ml，再加質(zhì)量濃度為5%的苯酚水溶液1. 0ml，搖勻，滴加濃硫酸5. 0ml，振蕩搖勻后置沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫，得到標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液；用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液中葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)蟲草菌絲體中粗多糖吸收系數(shù)的確定a、供試品待測(cè)液的制備取步驟(1)獲得的供試品溶液V4mL，加蒸餾水使體積為 1. 0ml，加質(zhì)量濃度為5%的苯酚水溶液1. 0ml，搖勻，滴加濃硫酸5. 0ml，振蕩搖勻后置沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫，得到供試品待測(cè)液，體積記為V5 ；b、吸收系數(shù)的確定用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定所述供試品待測(cè)液的吸光度；由步驟(2)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度A與濃度C的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得到供試品待測(cè)液中粗多糖的濃度C，根據(jù)朗伯-比爾定律A = ECL，計(jì)算出供試品待測(cè)液中粗多糖的吸收系數(shù)E1;(4)按步驟(1)-(3)重復(fù)η次，獲得多個(gè)供試品待測(cè)液的吸收系數(shù)&、E3, E4…… En,計(jì)算Ep E2、E3、E4……En的平均值Ε，即為蟲草菌絲體中粗多糖的吸收系數(shù)；(5)利用確定的吸收系數(shù)E根據(jù)下述公式計(jì)算蟲草菌絲體中粗多糖的含量a、按照步驟(1)所述的方法另取M克蟲草菌絲體，制備蟲草菌絲體溶液，獲得該溶液的Vp v2、v3值;b、按照步驟(3)中a所述的方法制備體積為V5的蟲草菌絲體溶液，獲得該溶液的 V4和V5值；C、用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定步驟b所得蟲草菌絲體溶液的吸光度A;d、根據(jù)步驟(4)得到的吸收系數(shù)E，按下式計(jì)算蟲草菌絲體中粗多糖含量，
、， AxK xK xV, …，X =-^~^~!~ χ 100%
EXIOOxF4 XF2 xM式中X——蟲草菌絲體中粗多糖含量，以葡萄計(jì)；A——供試品待測(cè)液的吸光度；E——吸收系數(shù)M——蟲草菌絲體質(zhì)量，單位為g。本發(fā)明的方法只需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，無(wú)需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，根據(jù)公式即可獲得蟲草菌絲體中的粗多糖含量。省去了標(biāo)準(zhǔn)曲線法中，配置標(biāo)準(zhǔn)溶液和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法的步驟，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，從而減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的人為誤差。同時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)步驟的減少，還縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)試劑，既提高了工作效率又節(jié)約了成本。


圖1是蟲草菌絲體粗多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
一種蟲草菌絲體中粗多糖的測(cè)定方法，包括如下步驟(1)供試品溶液的制備a、稱取1. Og的蟲草菌絲體供試品，置于體積為IOOmL(VllIiL)的容量瓶中，加入所述IOOmL容量瓶體積的2/3的蒸餾水，在100°C恒溫水浴中浸提5小時(shí)，定容至IOOmL,過(guò)濾， 除去不溶雜質(zhì)，收集濾液；b、吸取濾液5mL(V2mL)，加入20mU4倍于V2ml)的無(wú)水乙醇，用于沉淀濾液中的多糖，4°C靜置醇沉6小時(shí)，3000rpm離心，收集多糖沉淀；C、將所述多糖沉淀溶于25mL (V3HiL)蒸餾水中，使沉淀溶解，即得到供試品溶液；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備a、將純度大于99. 0%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于80°C干燥至恒重，精確稱取0. 010g，置于 IOOml容量瓶中，加入80ml蒸餾水，超聲15分鐘，使葡萄糖充分溶解，放冷至室溫，定容搖勻，即得0. 10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；b、精密吸取所述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0ml、0. 20ml,0. 40ml,0. 60ml,0. 80mlU. 0ml，分別置于6個(gè)10ml具塞試管中，分別加蒸餾水使體積為1. 0ml，再加質(zhì)量濃度為5%的苯酚水溶液1. 0ml，搖勻，滴加濃硫酸5. 0ml，振蕩搖勻后置沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫，得到標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液；用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液中葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1和圖 1 ；表1蟲草菌絲體粗多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
權(quán)利要求
1. 一種蟲草菌絲體中粗多糖的測(cè)定方法，其特征包括如下步驟(1)供試品溶液的制備a、稱取m克的蟲草菌絲體供試品，置于體積為V1HiL的容量瓶中，加入所述V1HiL容量瓶體積的2/3的蒸餾水，在100°C恒溫水浴中浸提3-8小時(shí)，定容至V1HiL,過(guò)濾，除去不溶雜質(zhì)， 收集濾液；b、吸取濾液V2mL，加入4倍于V2ml的無(wú)水乙醇，用于沉淀濾液中的多糖，醇沉6_8小時(shí)， 離心，收集多糖沉淀；c、將所述多糖沉淀溶于V3HiL蒸餾水中，使沉淀溶解，即得到供試品溶液；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備a、將純度大于99.0%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于80°C干燥至恒重，精確稱取0. Olg，置于IOOml 容量瓶中，加入80ml蒸餾水，超聲15分鐘，使葡萄糖充分溶解，放冷至室溫，定容搖勻，即得0.10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；b、精密吸取所述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液OmUO.20ml,0. 40ml,0. 60ml,0. 80ml、1. 0ml，分別置于6個(gè)IOml具塞試管中，分別加蒸餾水使體積為1. 0ml，再加質(zhì)量濃度為5%的苯酚水溶液1.0ml，搖勻，滴加濃硫酸5. 0ml，振蕩搖勻后置沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫，得到標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液；用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液中葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)蟲草菌絲體中粗多糖吸收系數(shù)的確定a、供試品待測(cè)液的制備取步驟(1)獲得的供試品溶液V4mL，加蒸餾水使體積為 1. 0ml，加質(zhì)量濃度為5%的苯酚水溶液1. 0ml，搖勻，滴加濃硫酸5. 0ml，振蕩搖勻后置沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫，得到供試品待測(cè)液，體積記為V5 ；b、吸收系數(shù)的確定用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定所述供試品待測(cè)液的吸光度；由步驟(2)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度A與濃度C的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得到供試品待測(cè)液中粗多糖的濃度C，根據(jù)朗伯-比爾定律A = ECL，計(jì)算出供試品待測(cè)液中粗多糖的吸收系數(shù)E1 ；(4)按步驟(1)-(3)重復(fù)η次，獲得多個(gè)供試品待測(cè)液的吸收系數(shù)E2、&、E4……En,if 算Ep E2、E3、E4……En的平均值E，即為蟲草菌絲體中粗多糖的吸收系數(shù)；(5)利用確定的吸收系數(shù)E根據(jù)下述公式計(jì)算蟲草菌絲體中粗多糖的含量a、按照步驟(1)所述的方法另取M克蟲草菌絲體，制備蟲草菌絲體溶液，獲得該溶液的 V V2J3 值；b、按照步驟C3)中a所述的方法制備體積為V5的蟲草菌絲體溶液，獲得該溶液的V4和 V5值；c、用光程為Icm的比色皿，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定步驟b所得蟲草菌絲體溶液的吸光度A；d、根據(jù)步驟(4)得到的吸收系數(shù)E，按下式計(jì)算蟲草菌絲體中粗多糖含量，、， AxK xK xV, …，X =-^~1~！~ χ 100%ExIOOxF4 XF2 χ M式中X——蟲草菌絲體中粗多糖含量，以葡萄計(jì)； A——供試品待測(cè)液的吸光度； E——吸收系數(shù)M——蟲草菌絲體質(zhì)量，單位為g。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蟲草菌絲體中粗多糖的測(cè)定方法，包括如下步驟(1)供試品溶液的制備；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；(3)蟲草菌絲體中粗多糖吸收系數(shù)的確定；(4)按步驟(1)-(3)重復(fù)n次，獲得多個(gè)供試品待測(cè)液的吸收系數(shù)E2、E3、E4……En，計(jì)算E1、E2、E3、E4……En的平均值E，即為蟲草菌絲體中粗多糖的吸收系數(shù)；(5)利用確定的吸收系數(shù)E根據(jù)下述公式計(jì)算蟲草菌絲體中粗多糖的含量，本發(fā)明的方法只需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，無(wú)需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，根據(jù)公式即可獲得蟲草菌絲體中的粗多糖含量。節(jié)省了步驟，從而減少檢測(cè)過(guò)程中的人為誤差。同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)試劑，既提高了工作效率又節(jié)約了成本。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102252978SQ20101060494
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者李星芝, 童艷, 趙曉娟 申請(qǐng)人:天津天獅生命源有限公司, 天津天獅生物發(fā)展有限公司, 天獅集團(tuán)有限公司